RNAi基因功能研究的新技術(shù)

1、RNAi：基因功能研究的新技術(shù) RNAi：基因功能研究的新技術(shù)：基因功能研究的新技術(shù)RNAiRNAi的定義的定義RNAiRNAi的發(fā)現(xiàn)和研究歷程的發(fā)現(xiàn)和研究歷程RNAiRNAi的作用機(jī)制和特征的作用機(jī)制和特征RNAiRNAi的生物學(xué)功能和意義的生物學(xué)功能和意義RNAiRNAi的應(yīng)用的應(yīng)用展望與思考展望與思考RNAiRNAi的定義的定義RNAi (RNA interference)Sequence-specific, post-transcriptional gene silencing mediated (PTGS) by double-stranded RNARNA干涉干涉是指雙鏈?zhǔn)侵鸽p鏈R

2、NA引起的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默引起的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默 RNAi 廣泛存在于從真菌到植物，從無脊椎動(dòng)物到哺乳廣泛存在于從真菌到植物，從無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的多種生物體中，是一種自然存在的生物學(xué)現(xiàn)象。動(dòng)物的多種生物體中，是一種自然存在的生物學(xué)現(xiàn)象。 目前，目前，RNAi 已發(fā)展成為一種新的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，已發(fā)展成為一種新的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于特異性地降低或關(guān)閉某些基因的表達(dá)。用于特異性地降低或關(guān)閉某些基因的表達(dá)。RNAiRNAi的發(fā)現(xiàn)和研究歷程的發(fā)現(xiàn)和研究歷程(Jorgensen R, 1990) 1995年，Guo等在試圖阻斷線蟲（C. elegans）中的par-1基因

3、時(shí)，驚訝地發(fā)現(xiàn)給線蟲注射正義RNA（sense RNA）同反義RNA一樣，能特異性地抑制線蟲par-1基因的表達(dá)，而未出現(xiàn)預(yù)期的正義RNA使基因表達(dá)增強(qiáng)的現(xiàn)象。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反，他們一直沒能給這個(gè)意想不到的結(jié)果作出合理解釋。 經(jīng)過純化的dsRNA卻能夠高效特異地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，他們將這一現(xiàn)象稱為RNA interference。 Fire A, et al. 隨后，dsRNA介導(dǎo)的RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等幾乎所有真核生物中。這說明RNAi機(jī)制很可能是在進(jìn)化的早期階段就已經(jīng)產(chǎn)生了。 1999年，Hamilton 等在基因誘導(dǎo)

4、的PTGS植株和病毒誘導(dǎo)的PTGS植株中，首次發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)度為25nt 的RNA中間產(chǎn)物。 2000年，Zamore 和 Hammond 等在研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi實(shí)驗(yàn)中加入的dsRNA被首先降解成21-23nt的小片段RNA（small interfering RNA，siRNA），隨后在siRNA的引導(dǎo)下，由核酸內(nèi)切酶將同源mRNA降解。 這一發(fā)現(xiàn)首次顯示了dsRNA介導(dǎo)的基因沉默是一個(gè)同源依賴的兩步降解反應(yīng)。 2000年，Wianny 和 Svoboda 等分別發(fā)現(xiàn)，在小鼠的早期胚胎和卵母細(xì)胞中dsRNA也能產(chǎn)生特異性的RNAi 效應(yīng)。表明dsRNA在哺乳動(dòng)物中也能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的基因沉默，這

5、為利用RNAi研究人類基因功能和基因治療提供了嶄新希望。 然而，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，較長(zhǎng)dsRNA誘導(dǎo)的RNAi作用不象它在其它真核生物中那樣高效特異。因?yàn)檩^長(zhǎng)的dsRNA（長(zhǎng)度大于30nt）的導(dǎo)入可能與病毒侵入細(xì)胞相似，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi) I 型干擾素（IFN-，IFN-），導(dǎo)致非特異性地降解mRNA，致使基因表達(dá)減少甚至細(xì)胞凋亡。 令人振奮的是，在2001年 Elbashir SM 等克服了這一障礙，找到了一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中關(guān)閉特定基因的新方法，他們用合成的21nt 的siRNA (small interfering RNA)，成功地抑制了不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞（人胚腎293細(xì)胞、H

6、eLa細(xì)胞）中的靶基因的表達(dá)，同時(shí)避免了對(duì)其他蛋白質(zhì)合成的抑制。 從此RNAi 研究得以迅猛發(fā)展。 用 RNAi 作關(guān)鍵詞，在 PubMed 網(wǎng)上可以檢索到 600 多篇文章Cell 14篇Nature 10篇Science 13篇 BREAKTHROUGH OF THE YEAR :Small RNAs Make Big Splash #1 The WinnerRNAi as tool - companiesRNAiRNAi的作用機(jī)制和特征的作用機(jī)制和特征Science 2002 296:1263RNAiRNAi的作用特征的作用特征1. RNAi 具有高度的特異性。dsRNA能夠非常特異地誘

7、導(dǎo)與之序列同源的的mRNA降解，而無關(guān)基因不受影響。2. RNAi 具有高效性。相對(duì)很少量的dsRNA分子（數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量）就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的RNAi效應(yīng)，產(chǎn)生類似基因“剔除”的效果。3. RNAi 存在放大效應(yīng)。通過線蟲、果蠅和小鼠的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，少量的dsRNA 能夠使大量的靶基因沉默，即便細(xì)胞增殖50-100倍仍可保持RNAi 效應(yīng)，這表明RNAi 存在擴(kuò)增機(jī)制。4. RNAi 作用廣泛并可遺傳。dsRNA介導(dǎo)RNAi不僅在導(dǎo)入部位產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而且可以跨越細(xì)胞界限在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持。在線蟲，果蠅等RNAi 效應(yīng)可以在生物體內(nèi)傳播，并可傳給子代。1. 通過RNA依賴

8、的RNA聚合酶（RdRP) 合成dsRNA。己知的植物病毒基因組90以上都是ssRNA，需要依靠病毒自身的 RdRP 進(jìn)行復(fù)制。此外，異常的ssRNA（aberrant ssRNA）也可經(jīng)RdRP合成dsRNA。2. 轉(zhuǎn)座元件產(chǎn)生dsRNA。轉(zhuǎn)座元件（TE）是基因組中基因座位可以移動(dòng)的DNA序列。TE有2類：I 型TE是返轉(zhuǎn)座元件，其通過RNA的逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行擴(kuò)增。I 型TE是植物TE中最主要的類型。II 型TE所有生物都有，以原核生物居多。3. 人工合成dsRNA。體外人工合成的一對(duì)序列互補(bǔ)的單鏈RNA（ssRNA），導(dǎo)入體內(nèi)后在體內(nèi)退火形成dsRNA形式，也可以在體外退火形成dsRNA形式，再

9、導(dǎo)入體內(nèi)。 4. 構(gòu)建表達(dá)dsRNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細(xì)胞表達(dá)dsRNA。這為各類哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能的研究提供了強(qiáng)有力的工具。 dsRNA 的生成的生成RNAiRNAi的生物學(xué)功能的生物學(xué)功能 RNAi的本質(zhì)是一種由RNA介導(dǎo)的序列特異性的獲得性免疫反應(yīng)，是一種原始的基因組對(duì)抗外來基因表達(dá)的保護(hù)機(jī)制，是生物體在基因組水平上的免疫系統(tǒng)。 1. 抗病毒感染免疫抗病毒感染免疫 90以上的植物病毒基因組為ssRNA，當(dāng)侵入植物細(xì)胞時(shí)可形成dsRNA中間體。沒有dsRNA的正常植物正是利用病毒自身產(chǎn)生的dsRNA而誘導(dǎo)RNAi 效應(yīng)，選擇性地降解外源性的病毒RNA，達(dá)到抵制病毒的入侵的目的。2. 維持基因組

10、中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性維持基因組中轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性當(dāng)轉(zhuǎn)座子中某些基因改變、復(fù)制時(shí)可產(chǎn)生hairpin dsRNA，啟動(dòng)PTGS反應(yīng)，引起編碼轉(zhuǎn)座酶的mRNA降解，阻止轉(zhuǎn)座酶蛋白的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)，從而得以保持遺傳穩(wěn)定，防止遺傳損害。 3. 清除異常清除異常RNARNAi的另一個(gè)生物學(xué)功能是清除來自細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的異常的無功能RNA（aberrant nonfunctional RNAs），從而發(fā)揮監(jiān)視mRNA的功能。這是RNAi在基因組水平上發(fā)揮免疫監(jiān)視功能的最充分的體現(xiàn)。4. 基因表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控RNAi除了發(fā)揮是抗病毒感染免疫，維持轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性以及清除異常RNA作用外，還參與蛋白編碼基因的

11、表達(dá)調(diào)控。RNAiRNAi的應(yīng)用的應(yīng)用Loss-of-function基因突變基因突變RNAi反義核酸，反義核酸，ribozyme細(xì)胞內(nèi)抗體細(xì)胞內(nèi)抗體基因剔除，等基因剔除，等Gain-of-function基因轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，等轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，等基因功能研究的常用手段基因功能研究的常用手段1. 研究基因功能的強(qiáng)有力工具研究基因功能的強(qiáng)有力工具 隨著人類基因組序列的完全破譯，人類已進(jìn)入后基因組時(shí)代。在人類基因組的30億個(gè)堿基對(duì)當(dāng)中，蛋白編碼基因只有3-4萬(wàn)個(gè)，但約半數(shù)的基因功能未知。弄清這些基因的功能及其相互作用關(guān)系已迫在眉睫，建立一種高效、快捷、簡(jiǎn)便的確定基因功能的新技術(shù)是各國(guó)學(xué)者夢(mèng)寐以求

12、的愿望。由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低的突變。目前，RNAi技術(shù)已逐步成為研究功能基因組學(xué)的強(qiáng)有力工具。 己有若干實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用RNAi技術(shù)對(duì)模式生物進(jìn)行大規(guī)模的基因組篩選。他們主要是針對(duì)胚胎發(fā)育、細(xì)胞分裂、性腺發(fā)育這些生物學(xué)過程，篩選影響和參與其中的關(guān)鍵性基因。用RNAi技術(shù)進(jìn)行功能基因組的篩選，其基本原理是根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果，針對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)序列的dsRNA，構(gòu)建成基因組的dsRNA文庫(kù)，將文庫(kù)中不同序列的dsRNA分別導(dǎo)入不同個(gè)體的細(xì)胞內(nèi)，通過表型上的改變篩選相關(guān)基因并由此大致確定基因功能。這項(xiàng)技術(shù)將序列和功能直接連接起來，開辟了功能基因組研

13、究的新篇章。目前，利用RNAi技術(shù)對(duì)線蟲約19000個(gè)預(yù)測(cè)基因的功能研究正已在進(jìn)行之中。 與此同時(shí)，哺乳動(dòng)物中非特異性RNAi效應(yīng)的克服和新型表達(dá)載體的問世，將RNAi技術(shù)用于哺乳動(dòng)物的基因功能的研究推上了應(yīng)用的前沿。當(dāng)前，利用RNAi技術(shù)來研究哺乳動(dòng)物基因功能正如火如荼地進(jìn)行著，有越來越多的研究團(tuán)體正加入到這一研究隊(duì)伍中來。利用RNAi技術(shù)，人們已在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞（CHO、HeLa、293、293T、T細(xì)胞等）中成功地降低了靶基因的表達(dá)，這些被降低了的基因范圍廣泛，既有結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因，也有催化蛋白編碼基因，而靶基因降低的幅度則高達(dá)85-99%。隨著RNAi技術(shù)的發(fā)展及日臻完善，RNAi技

14、術(shù)必將成為人類功能基因組學(xué)研究的革命性工具。2. 研究信號(hào)傳導(dǎo)途徑的新方法研究信號(hào)傳導(dǎo)途徑的新方法 Clemens等42應(yīng)用RNAi研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。他們首先用針對(duì)DSH3PX1和DACK的dsRNA對(duì)果蠅細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Western blot分析表明相應(yīng)基因的蛋白均減少了9599，表明RNAi能特異性阻斷培養(yǎng)細(xì)胞靶蛋白的產(chǎn)生。然后他們利用RNAi技術(shù)分析了已知的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RNAi技術(shù)所闡明的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與已知的胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑完全一致。在此基礎(chǔ)上他們又利用RNAi技術(shù)分析了DSH3PX1與DACK之間的關(guān)系，證明DACK是DSH3PX1磷酸化的上游激酶

15、，DSH3PX1是其作用靶位。在整個(gè)試驗(yàn)過程中他們發(fā)現(xiàn)RNAi技術(shù)比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白非特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)。 最近，Muda等43利用RNAi技術(shù)鑒定了唐氏綜合癥粘附分子（Down-Syndrome cell-adhesion molecule，DSCAM）磷酸化的上游蛋白酪氨酸激酶，DSCAM是一種屬于免疫球蛋白-纖連蛋白超家族的細(xì)胞表面分子，對(duì)果蠅的軸突尋徑（axonal path-finding）功能十分重要，DSCAM酪氨酸磷酸化可將接頭蛋白DOCK的SH2結(jié)構(gòu)域傳遞給受體。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的DOCK是以酪氨酸磷酸化形式存在，而

16、DPTP61F則是使DOCK去磷酸化的蛋白酪氨酸磷酸酶。Heinonen等44用RNAi技術(shù)證實(shí)了過敏反應(yīng)中BTK（Brutons tyrosine kinase）對(duì)有效分泌組織胺的直接作用。實(shí)驗(yàn)中，他們將針對(duì)BTK的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，影象及蛋白印跡分析表明細(xì)胞中BTK的表達(dá)降低，同時(shí)，肥大細(xì)胞中促炎性介質(zhì)組織胺的釋放減少了20-25%。這些結(jié)果與用BTK抑制劑LFM-A13所得到的結(jié)果非常相似。這些研究顯示了RNAi技術(shù)可以作為研究細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要方法。3. 基因治療（病毒感染、腫瘤）的新策略基因治療（病毒感染、腫瘤）的新策略 如前所述，siRNA的應(yīng)用有效地保證了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RN

17、Ai效應(yīng)的特異性，再同已有的高效的基因傳遞系統(tǒng)相結(jié)合，一種真正基于的RNAi技術(shù)的基因治療方法就誕生了。Hannon等用復(fù)制缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒成功地將siRNA導(dǎo)入到靶細(xì)胞中，并預(yù)言了體內(nèi)外的若干應(yīng)用。 同時(shí)，在siRNA介導(dǎo)HIV的基因沉默實(shí)驗(yàn)中也得到了類似的結(jié)果，針對(duì)HIV-1基因組LTR和5個(gè)病毒編碼基因的siRNA，可將HIV-1病毒的復(fù)制降低30-50倍。 Jacque等發(fā)現(xiàn)針對(duì)HIV-1基因組 LTR、Vif 和 Nef 的siRNA均能抑制病毒的復(fù)制。 Novina 等用針對(duì)HIV-1基因組結(jié)構(gòu)蛋白Gag、調(diào)節(jié)蛋白Nef的siRNA，有效地抑制了HIV-1的感染，而針對(duì)HIV-1感

18、染必需受體CD4的siRNA則降低了病毒侵入Magi-CCR5細(xì)胞的能力。利用針對(duì)HIV RNA或其感染必需的受體CCR5的siRNA，可以將病人的骨髓干細(xì)胞改造成對(duì)HIV感染具有抵抗力的細(xì)胞。 以上研究表明，siRNA能抑制不同感染階段的病毒復(fù)制，而感染的阻止既可用針對(duì)病毒基因的siRNA，也可以用針對(duì)參與病毒生活周期的宿主細(xì)胞基因的siRNA。 RNAi 在病毒基因治療的研究方面也格外矚目。目前己有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室用RNAi技術(shù)對(duì)HIV、脊髓灰質(zhì)炎病毒等的感染進(jìn)行了研究，取得了令人激動(dòng)的成果。他們用針對(duì)病毒基因組編碼基因mRNA的siRNA成功地阻止了靶基因的表達(dá)，為病毒的基因治療提供了全新的重

19、要策略。 Gitlin等用針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組的siRNA處理人HeLa細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siRNA顯著降低了病毒的滴度并促進(jìn)感染細(xì)胞中病毒的清除，證實(shí)了siRNA能特異性地抑制胞內(nèi)RNA病毒的快速?gòu)?fù)制。 由于腫瘤是一種多基因疾病，單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長(zhǎng)，而利用RNAi技術(shù)則克服了這一缺點(diǎn)，它能在體內(nèi)同時(shí)特異性阻斷多個(gè)癌基因的表達(dá)。Lin等把針對(duì)原癌基因bcl2的 mRNA cDNA雜交體轉(zhuǎn)染到人前列腺癌 LNCaP 細(xì)胞中，對(duì)bcl2基因表達(dá)產(chǎn)生了較長(zhǎng)時(shí)期的抑制。這一效應(yīng)與體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中的 RNAi 相似，表明RNAi可用于B細(xì)胞淋巴瘤和白血病的基因治療。

20、Wilda等用特異dsRNA誘導(dǎo)的RNAi來殺死含有BCR/ABL融合基因的白血病細(xì)胞。他們用針對(duì)M-BCR/ABL融合基因的dsRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，定量PCR及Western blot分析發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)mRNA和M-BCR/ABL癌蛋白(oncoprotein)均減少，而BCR/ABL的減少則強(qiáng)烈地誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果為深入研究將RNAi用于殺滅基因異常的腫瘤細(xì)胞的基因治療開辟了新的領(lǐng)域。 The chemokine receptors CCR-5 and CXCR-4 are the principle coreceptors of HIV-1 infection. R5 (macrop

21、hage, M) tropic HIV-1 strains mainly use CCR-5, X4 (T cell line-tropic) use CXCR-4. We investigated whether vector-based siRNA would down-regulation of CCR-5 and CXCR-4 surface expression. Transduced cell lines were assayed by FACS. Inhibition of HIV-1 infection by siRNAs targeted against CCR-5 and

22、CXCR-4siRNA 特異性阻斷T淋巴細(xì)胞表面CCR5, CXCR4的表達(dá)CCR5CXCR4PM-1 PM-1/pSU3 pooled PM-1/pSU5 pooled CD3CD4 The CXCR4 expression on cell surface has a critical role in infection of HIV-1 and determining the metastasic destination of breast cancer and other cancers. Blocking of CXCR4 expression on breast cancer cel

23、l surface by vector-based siRNAsCXCR4MDA-MB-231ControlpSU/siRNAColony 1pSUPERpSU/siRNAColony 2siRNA 特異性阻斷乳腺癌細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)展望與思考展望與思考 從RNAi 的發(fā)現(xiàn)至今，僅僅幾年的時(shí)間，RNAi就已成為生命科學(xué)研究中的熱點(diǎn)，充分說明了RNAi在生命科學(xué)研究中的重要地位。目前，我們對(duì)RNAi作用機(jī)制的復(fù)雜性及其生物學(xué)作用的多樣性的認(rèn)識(shí)才剛剛起步，但RNAi技術(shù)已引起從單細(xì)胞原生動(dòng)物到哺乳動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)的根本變革，它不但是研究基因功能的有力工具，而且已成為特異性基因治療的新方法。這

24、些方法的應(yīng)用將使已測(cè)序的基因組中處于休眠狀態(tài)的潛能釋放出來，其前景不可估量。 盡管RNAi技術(shù)有著十分廣闊的應(yīng)用前景，但要保證該技術(shù)取得成功，還必須對(duì)RNAi技術(shù)進(jìn)行不斷的完善。 首先，并不是所有mRNA序列都能接近siRNA，有些序列包埋于RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)或折疊區(qū)域中，而另外一些則與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合物，阻礙了siRNA 對(duì)靶序列的識(shí)別。因此，往往要經(jīng)過不斷的摸索才能合理地選擇出最佳的靶序列。 還有，如何將siRNA傳遞至細(xì)胞內(nèi)也是一個(gè)急需解決的當(dāng)務(wù)之急，雖然可將siRNA 高效地導(dǎo)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，但導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)則另當(dāng)別論。 與研究工作實(shí)際相結(jié)合，發(fā)揮自身的與研究工作實(shí)際相結(jié)合，發(fā)揮自身

25、的優(yōu)勢(shì)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，使我校的科學(xué)研究產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，使我校的科學(xué)研究產(chǎn)生新的飛躍新的飛躍主要參考文獻(xiàn)主要參考文獻(xiàn)1. Plasterk RH. RNA silencing: the genomes immune system. Science, 2002; 296(5571):1263-12652. Hannon GJ. RNA interference. Nature, 2002; 418(6894):244-2513. Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet, 2001; 2(2):110-1194. Davenport