核酸適配子在臨床研究中的進展

1、核酸適配子在臨床研究中的進展彭艷馮茂輝謝偉自 1990 年,tuerk 和 ellington 用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(systematic evolution ()1 ligands by exponential enrichmentselex)技術分別篩選岀能與t4dna聚合酶和有機染料特異結合的 隨機寡核井酸后，用于篩選的靶物質(zhì)越來越廣，從核酸蛋口擴展到小分子有機物，以及完整 的細胞病毒等。其在棊礎研究、臨床研究及藥物開發(fā)中的應用也不斷增加。本文對核酸適配 了及其在臨床診斷和治療的應用作一綜述。一適配子及其特點適配了是通過selex技術從體外人工合成的人容量單鏈隨機寡核廿酸文庫屮經(jīng)過多

2、倫 篩選和富集獲得的，能與靶分子高親和力和高特異性結合的寡聚核昔酸。它能與一系 列靶物質(zhì)特異地結合，其親和力和特異性能少抗體媲美，甚至優(yōu)于抗體，且具備抗體所不具 備的一些優(yōu)點，如核酸適配子的分子量小、制備簡單、生產(chǎn)不依賴于動物、成本低、易重 復、毒性低、無免疫源性，即使針對有毒物質(zhì)也可以篩選出其相應的適配子適配子在實際應用中也具有許多優(yōu)點：(1)高親和力和髙特界性：適配子的解離常數(shù)(kd) 一般在納摩爾到皮摩爾，能夠區(qū)分一個輕棊或甲基的區(qū)別，其親和力和特異性是別的配基無 法比擬的；(2)靶分子范圍廣：從理論上說，只要核廿酸庫屮的系列有足夠的多樣性，就可 以通過selex技術篩選出相應的適配子。

3、陋等較大的蛋白質(zhì)分子、金屬離子、有機染料、 核昔、多肽等小分子物質(zhì)以及完整的細胞和病毒顆粒和細菌施子都可以是其靶分子；(3)體 外篩選易人工合成：隨著selex技術的不斷完善，適配了的篩選周期越來越短；人工合成 的適配子純度高，有極佳的準確性和重復性，兒乎消除了制備的批i'可誤差；(4)易修飾性： 適配子為寡聚核昔酸片段，可以在保持其原有的綸物學活性的基礎上進行精確的位點修飾, 它可以被熒光染料、放射性同位素、牛物素標記、細胞毒素和藥物等連接，提高了其在臨床 診斷和治療屮的應用。(5)分子量小，穩(wěn)定性好，對壞境溫度不敏感，易保存。適配子比抗 體的分了小，易通過細胞膜進入細胞內(nèi)，能更方便

4、地檢測細胞內(nèi)的靶分了；經(jīng)過修飾的適配 子穩(wěn)定性好，在體內(nèi)的半衰期長，利于體內(nèi)診斷和治療；適配子變性和復性可逆且速度快, 可以反復使用、長期保存和室溫運輸。二、適配了在臨床診斷中的應用 適配子感受器在診斷發(fā)展方面具有許多優(yōu)點，具作為生物組分在診斷應川屮提供了許多有利 因素，例如未經(jīng)修飾適配子具有易再生的特點，另外，適配子的易標記性使其在診斷中更貝 靈活性o如今的許多臨床診斷技術仍然依賴于免疫學技術如醜聯(lián)免疫吸附試驗。除了這些 經(jīng)典的檢測外，可以利用核酸適配子檢測蛋白、細胞及分子成像，具有良好的敏感性和特 異性。1. 相關蛋白的檢測:表皮生長因子受體(epidermalgrowth factor

5、receptor, egfr)蛋白由 28個外顯了編碼的跨膜蛋白組成，是erb酪氨酸激酶受體家族屮的一員，其與腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展冇明顯的相關性?！暗?篩選出抗一egfr適配了，其經(jīng)金納米微粒(gnps)修飾后可以 特異地、定最地檢測到細胞屮的egfr蛋白。fang等在血小板源性生長因子(platelet- derived growth factor, pdgf) b鏈的核酸適配子兩端分別連接熒光基團和熒光淬滅基團， 在腫瘤細胞培養(yǎng)上清液中成功地檢測到皮摩爾水平濃度的pdgf,而j1能夠準確地分辨出 pdgf分了的三種二聚體，顯示出高度的選擇性、敏感性及簡便易行性。2. 細胞檢測：核酸適配子能夠

6、特異地結合細胞表面標記物，已被用于開發(fā)多效價抗體類似 物和流式細胞儀分析。zhang等篩選出的熒光標記的特界結合人cd30蛋白的rna適配 了，通過流式細胞術檢測后結果顯示：低濃度(0. 3 nm)適配了就能特異地、敏感地檢測到 表達cd30的淋巴細胞，與臨床公認的診斷探針-抗體探針效果一樣，從而認為該適配子可取 代抗體作為檢測表達cd30淋巴細胞的探針。gnps標記的適配子除具有適配子高選擇性及高 親和力等木身特性外，同時也具冇gnps的光譜優(yōu)勢，因而町以敏感地檢測出靶細胞o medley 等將特界結合人急性淋巴細胞白血病細胞(ccrf-cem cell)的適配子與gnps結合，成功 地檢測

7、出ccrfyem細胞。適配子-金納米比色分析法對以靈傲地辨別靶細胞和對照細胞， 檢測出靶細胞，可成為診斷疾病強有力的工具。3. 分子成像：核酸適配子的分子量小、組織滲透性好、血漿清除率高、信噪比高、成像效 果好，特別適合作為非侵入性診斷成像試劑?？缒ぬ堑鞍譵uc-1高表達于惡性上皮細胞, 己被認為是腫瘤標記物z-opieve等川tc標記抗muc 1適配了用于乳腺癌裸鼠模型成 像分析，發(fā)現(xiàn)放射性同位索tc標記的適配子具有較高的攝取率和清除率，對惡性上皮腫瘤 具有診斷應用價值。kim等將gnps結合到抗前列腺特異性膜抗原(psma)適配了上用于計算 機斷層(ct)掃描，結果顯示gnps能夠增強ct

8、成像ohwang等成功地把核仁蛋白適配子as1411 和用熒光素標記的鉆一鐵納米顆粒結合起來用于腫瘤的影像學診斷。三、適配子在臨床治療中的應用適配子在臨床治療屮的應用方式和單克隆抗體大致相同。與單克隆抗體的牛產(chǎn)方法不一樣的 是適配子在體外篩選不需要生物體，牛產(chǎn)過程中可以很好地控制各種反應條件。另外相對于 其他寡核昔酸，適配了具冇獨特的優(yōu)勢，例如，反義寡核苜酸或者sirna的治療靶標在細胞 內(nèi)，而適配子的治療靶標可以在細胞內(nèi)、細胞外或者細胞表面01. 抑制性核酸適配子：血管內(nèi)皮牛.長因子(vascular endothel i al growth factor, vegf) 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和

9、轉移過程中起重要作用，其促進實體腫瘤血管形成，與惡性腫瘤血行 轉移等臨床病理因素相關。目前，抑制血管生成為抗癌藥的主要靶標之一，故抗vegf適配 子具有治療實體瘤的潛能。有研究表明pdgf-b的適配子在動物模型小可以降低與血管生成 相關疾病的發(fā)生、發(fā)展。mi等 篩選的opnr3rna適配子不僅在體外能抑制mdamb-23i 細胞的黏附、浸潤及轉移，在動物模型體內(nèi)也可以抑制腫塊的生長。2. 可調(diào)控核酸適配子：在臨床應川屮，藥物快速降解能夠減少具對身體的毒害作川。未經(jīng) 修飾的適配了半衰期短，在血漿屮能夠快速清除。reg1是第一個被稱為可調(diào)控的核酸適 配子，由凝血酶因子ixa的rna適配子(rb00

10、6)和與rb006相互補的單鏈rna寡聚核井酸 (rb007)構成。通過rb006與rb007相互競爭使reg-1結構發(fā)生改變從而抑制凝血卿因子 txa,達到抗凝的作用。目前,reg-1己經(jīng)進入i期和ii期的臨床試驗,i a期i b期臨 床試驗分別對未患心血管疾病和患心血管疾病的患者進行抗凝治療，未發(fā)現(xiàn)毒性反應”。1 c期臨床試驗顯示不同劑量的reg-1具冇不同的抗凝作用3. 多價體核酸適配子：抗體的低聚反應能夠增加抗體的親和力，活化感受受體，從而提高 效力。shi等首次用抗果蠅b52適配子證實適配子的多聚體可以增加其親和力。santulli marotto等篩選的細胞毒性t淋巴細胞相關抗原-

11、4(ctla-4)是第一個有治療潛能的多效價 適配了。該適配了的四聚體結構能調(diào)控體內(nèi)的免疫功能，應用于免疫治療，有望成為高效的 抗腫瘤藥物。4. 運輸t具核酸適配子：已有研究表明，將sirna連接到適配子上并特異性地運輸sirna 到其靶細胞上能夠達到治療的目的。另外，適配子同樣可以靶向運輸毒素、放射性同位素和 化療藥物。特別是在運輸治療藥物時比非靶向治療更具優(yōu)勢。首先，靶向運輸將減少對正常 組織或細胞的毒副作用。其次，靶向運輸藥物可以顯著減少有效治療量。mcnamara等首次 在動物模型中用psma適配子來靶向運輸針對plk 一 1和bel -2的sirna治療前列腺癌， 結果發(fā)現(xiàn)：運輸si

12、ra的適配子能夠促便細胞凋亡，便得表達psma的細胞和組織退化，而 對不表達psma的細胞和組織無影響。bagalkot等 將阿霉素直接連接到pmsa適配了 a10± 川以運輸?shù)郊毎麅?nèi)，可以促進表達psma的細胞凋亡。dhar等同樣川適配子精確地將順靶 向運輸?shù)角傲邢侔┘毎?。zhou等將hivgpl20適配子一 sirna嵌合體用于感染hiv的細 胞，發(fā)現(xiàn)能同時通過適配了和sirna抑制艾滋病病毒復制，將該適配了結合到htvgpl60上, 同樣也可以抑制htv-1復制，降低傳染性。huang等將阿霉素連接到ptk7適配子sgc8c上, 發(fā)現(xiàn)阿罅素一適配子復合體對鬲表達冃的蛋白的細胞

13、選擇性高，提高了化療療效。四、展望隨著組織切片selex、復合靶selex、基因組selexl1j、活細胞selex等多種技術形式 的出現(xiàn)，核酸適配子的應用前景也將更加廣泛。核酸適配子作為f1前已用于化學制藥的核巷 酸分了乙一，具冇很多優(yōu)越性，對于疾病診斷和發(fā)病機制的基礎科學研究也冇顯著的優(yōu)勢。 適配子同樣也可以取代抗休用于免疫紐化和酶聯(lián)免疫吸附實驗來分析組織和血液樣本。雖然 適配了應用于臨床相對較新，特別是用于體內(nèi)成像診斷方而還存在一些問題，但其優(yōu)點及其 相關研究意味著其將具冇更廣闊的臨床應用前景。參考文獻1 baldriche, restrepoa, 0 sullivanck- aptas

14、ensordevelopment： elucidation of critical parameters for optimal aptamer performance. anal chem, 2004, 76(23): 7053063.2 tombehi s, minunni m, mascini m. analytical applications ofaptamers. biosens bioelectron, 2005, 20(12)： 2424-2434. 程俊鋒，朱慶義.表皮成長因子受體在非小細胞肺癌中的作用j/cd.中華臨床醫(yī)師 雜志：電了版，2010, 4(12)： 2498-

15、2501 4 li n, tarso nt, nguye nhh, et al. directed evoluti on o f goldnanoparticlc del i very to cells. chem commun(camb), 2010, 46(3): 392394.5 fax，sen a, vicens m, et al. synthetic dna aptamers to detectprotein molecular variants in a highthroughput fluorescencequenching assay： chembiochem, 2003, 4

16、(9)： 829-834.6 zhou j, soontornworajit b, wang y. a temperatureresponsiveanubodylike nanostructure. biomacronio 1 ecu 1 es, 2010, 1 1 (8): 2087-2093.7 zhang p, zhan n, zeng z, et al. using an rna aptamer probe for flow cytometry detection of cd30expressing lymphoma cells. labinvest, 2009, 89(12): 14

17、231432.8 medley cd, smith je, tang z, et al. gold nanoparticlc一basedcolorimotric assay for the direct detection of* cancerous ceus. analchem, 2008, 80(4): 1067一1072.9 pieve cd, perkins ac, missailidis s. anti一muc1 aptamers： radiolabel 1ing with (99m)tc and biodistribution in mcf-7tumourbearing mice.

18、 nucl med biol, 2009, 36(6)： 703-710.10 kim d, jeong yy, jan s. a drug一loaded aptamer一gold nanoparticlebioconjugate for comb incd ct imaging and therapy of prostateca nccr. acs nan o,2010,4(7): 3689-3696.11 hwang do w, ko hy, ke jh, et al. a nucleolintargetedmuhimodal nanoparticle imaging probe for

19、tracking cancer cel 1 susing an aptamer. j nucl medm, 2010, 51(1)： 98105.12 ke 女n ad, pal s, ellington a. aptamers as therapeutics. nat revdrug discov, 2010, 9(7)： 537-550.13 王天寶，王勁，唐錄英，等.血清血管內(nèi)皮生長因子c聯(lián)合多排ct診斷胃癌淋巴結轉 移的可行性j / cd.中華臨床醫(yī)師雜志:電子版,2009, 3(6)： 928-933.14 akiyama ii, kachi s, silva rl, et al-

20、intraocular injection of allaptamer that binds pdgfb： a potential treatment for proliferativeretinopathies. j cell physiol, 2006, 207(2)： 4o7412.15 serinino b, faxc6n bl, mccanley d, et al. sequential loss of tumorvessel pericytes an d endothelial cells after inhibition of platelet一derived growth fa

21、ctor b by selective aptamer ax102. cancer res, 2007, 67(15)： 7358-7367.16 mi z, guo h, russel 1 mb, et al. rna aptamer blockade ofosteopontin inhibits growth and metastasi s of mdamb231 breastcancer ceus. mol ther, 2009, 17(1)： 153, 161.17 rusconi cp, scardino e, layzer j, et al. rna aptamem asrever

22、sible antagonists of coagulation factorix a. nature, 2002, 419(6902): 90-94.18 rusconi cp, roberts jd, pi toe ga, et al. antidote mediatedcontrol of al 1 anticoagulant aptiimer in vivo. nat biotechnol, 2004, 22(11): 1423-1428.19 dyke ck, steinhubl sr, kleiman ns, et al. firstin. humanexperience of a

23、ll antidote-controlled anticoagulant using rnaaptamer technology : a phase 1 a pharmacodynamic evaluation of adrugan tidote pair for the controlled regulation of factor 1)(aactivity. circulation, 2006, 114(23): 2490-2497.20 chan my,cohen mg, rlyke ck, et al. phase lb randomized studyof antidote一cont

24、rohcd modulation of factor txa activity in pailentswitl stable coronary artery disease. circulation, 20o8, 117(22): 2865-2874.21 chan my, rusconi cp, alexander jh, et al . a randomized, repeat-dose, pharmacodynamic and safety study of an antidote一controlled factorixa inhibitor. j thromb haemost, 200

25、8, 6(5)： 789-796.22 shi h, hoffman be, lis jt. rna aptamers as efective proteinantagonists in a multiceuular organism. proc natl acad sci usa, 1999, 96 (18)： 1003310038.23 santuii i. marotto so nair sk, rusconi c. et al. multivalent rnaaptamers that inhibit c ria_4 and enhance tumor immunity. cancer

26、 res, 2003, 63(21): 7483-7489.24 mcnamara jo 2nd, andrechek er, wang y, et al. ce ii typespecificdelivery of sirnas witll aptamersirna chimeras. natbiotechnol, 2006, 24 (8): 10051015.25 bagalkot v, farokhzad 0c, langer r, et al. an aptameidoxombicin physical conjugate a8 a novel targeted drugdeliver

27、yplatform. angew chem int ed ensl 2006, 45(48)： 8149-8152.26 dhar s, gufx, langer r, et al. targeted del i very of cisplatin toprostatc ca neer ceus by aptamer functionalized pt(tv)prodrug一plgapeg nanoparticles. proc natl acad se i u s a, 2008, 105(45)： 1735617361.27 zhou j, li h, li s, et al. novel dual inhibitory function aptamer一sirna delivery system for hiv-1 therapy. mol ther, 2008, 16(8): 1481-1489.28 zhou j, swiderski p, li h, et al. selection, characterizion andapplication of new rna h