膠質瘤細胞的培養(yǎng)及應用

1、 膠質瘤細胞的培養(yǎng)及其應用【摘要】  膠質瘤細胞及組織培養(yǎng)的方法日益成熟，近些年來有了一些新的改進，已經(jīng)廣泛應用于膠質瘤實驗的多方面研究：放療、化療、生物治療等方面細胞學實驗以及動物模型的建立?！娟P鍵詞】  膠質瘤；細胞培養(yǎng)；應用   據(jù)統(tǒng)計大約9%的人類腫瘤是腦腫瘤，而腦腫瘤中90%是膠質瘤1。腦膠質瘤是來源于神經(jīng)上皮的腫瘤。在成人致命原發(fā)腦腫瘤中，高級別惡性膠質瘤最常見，確診后中位生存期為912個月2，而且這些患者是經(jīng)過積極治療的，包括外科切除、放療、化療等。這些治療的失敗部分歸咎于膠質瘤細胞侵襲性生長以及與周圍正常腦組織交錯，因而外科手術難以完全切

2、除3；同時由于其異常的生物學特性，對放、化療的抗拒，導致術后放、化療失??；而且經(jīng)常以同級別或高級別復發(fā)4。因此需要開辟新的治療方法如生物治療以及開發(fā)新的治療藥物，這些新的治療方法及新藥研制都需要以實驗為依據(jù)。目前關于膠質瘤的常用研究方法有臨床實驗和基礎實驗。其中常用的基礎實驗有細胞實驗以及動物實驗。細胞學實驗是基礎，是利用培養(yǎng)的細胞進行實驗，從細胞水平、分子水平揭示膠質瘤的細胞特性。它具有許多優(yōu)點：可以長時間直接觀察細胞的形態(tài)結構和生命活動5；研究的條件可以人為控制；研究的樣本比較均一；研究的內容便于觀察、檢測和記錄；可以用于許多領域的研究；相對而言比較經(jīng)濟。   

3、; 1  膠質瘤細胞培養(yǎng)的歷史    1925年，F(xiàn)ish培養(yǎng)人惡性膠質瘤細胞獲得成功，開創(chuàng)了體外研究膠質瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1個人膠質瘤細胞株TC178，使體外長期連續(xù)動態(tài)觀察膠質瘤細胞成為可能。 20世紀70年代以來，隨著基礎培養(yǎng)技術的迅猛發(fā)展，膠質瘤細胞的體外培養(yǎng)和克隆技術日趨成熟。近年來更是探索出許多新的培養(yǎng)方法，并應用于各項研究。目前膠質瘤的細胞培養(yǎng)技術比較成熟，已經(jīng)建立了許多膠質瘤品系，如國內的人腦惡性膠質瘤體外細胞系SHG-44，是1980年取材于額葉星形細胞瘤的組織塊經(jīng)胰酶消化，單層靜止培養(yǎng)而成的；細

4、胞形態(tài)有星形、梭形；流式細胞光度儀測定，此細胞以四倍體為主，G1期占54.57%、S期占15.17%、G2/M期占30.25%；免疫組化提示本細胞中存在S-100和GFAP；存于蘇州大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科細胞實驗室。已經(jīng)明確的膠質瘤細胞系（株）有許多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后還會不斷建立新的品系。    2  目前常用培養(yǎng)方法及應用    現(xiàn)有的膠質瘤細胞培養(yǎng)形式主要有：單層細胞培養(yǎng)、三維/立體培養(yǎng)及聯(lián)合培

5、養(yǎng)等。    2.1  單層細胞培養(yǎng)及應用  傳統(tǒng)意義上的單層細胞培養(yǎng)可以分為原代培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)兩類。前者是從供體獲得組織后的初次培養(yǎng)，后者一般為利用現(xiàn)有的細胞系（株）。兩種培養(yǎng)方法各有優(yōu)缺點，而且都已經(jīng)得到廣泛的應用。目前國內研究膠質瘤的實驗多采用細胞系，這主要是因為國內已經(jīng)有許多膠質瘤細胞系，品系明確、易于培養(yǎng)；但連續(xù)性細胞系由于連續(xù)傳代，細胞的形態(tài)、結構、功能發(fā)生了一定的變化，傳代代數(shù)越多，發(fā)生的變化也越大，因而對實驗結果有一定的影響。原代培養(yǎng)細胞技術相對要復雜得多，而且培養(yǎng)成功率較低，費時費力，因此不為許多研究者選用；但原代細胞剛離體

6、，在形狀、結構、功能等方面與體內細胞更接近，相對能更好地代表其來源組織的細胞類型及組織特異性，更好地保留膠質瘤的生物學特性，更接近也更能反映體內生長特性，所以原代培養(yǎng)出的細胞更適合做藥物敏感實驗、放射敏感實驗等基礎實驗研究。原代單層細胞培養(yǎng)常用的方法有：組織塊原代培養(yǎng)以及單細胞懸液法培養(yǎng)。前者是將膠質瘤組織塊貼附在培養(yǎng)瓶（板）上，一般12天就會有細胞從組織塊邊緣游出，利用游出的細胞進行培養(yǎng)；后者是將組織塊通過機械分離或酶消化法或者二者結合的方法分離成單細胞懸液，再接種于培養(yǎng)瓶（板）進行培養(yǎng)的方法6,7 。傳代單層細胞培養(yǎng)的方法相對簡單一些，只需將需要傳代的細胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接種于

7、培養(yǎng)瓶內，補足培養(yǎng)液即可。以上為傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法，在此基礎上又發(fā)展出一些培養(yǎng)方法，如：單細胞分離培養(yǎng)法、加支持物培養(yǎng)法、球體細胞培養(yǎng)法、懸浮培養(yǎng)法等。單細胞分離培養(yǎng)也就是克隆培養(yǎng)，國內孫立軍、黃強等8已經(jīng)通過對SHG-44細胞系單克隆化，建立了具有低、中、高3種不同分化程度的人膠質瘤細胞株。加支持物培養(yǎng)法是為了實驗研究或便于觀察而預先向培養(yǎng)瓶/板內加入支持物；如為了做細胞免疫組化，預先在培養(yǎng)板內放入小玻片，再培養(yǎng)細胞，待細胞長在玻片上，取出固定、染色，也稱為爬片。球體細胞培養(yǎng)是將長成片的細胞移入不易貼附的底物上，則細胞片能卷聚生長成球形。懸浮培養(yǎng)法，顧名思義就是讓原本貼壁生長的細胞懸浮生長。

8、李茗初等9運用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)C6膠質瘤細胞系，從中分離出該細胞系的干細胞。單層細胞培養(yǎng)是目前最常用的一種培養(yǎng)方式，已廣泛應用于各項基礎研究。    2.1.1  在放射治療研究中的應用  目前膠質瘤細胞系眾多，不同細胞系有各自不同的特點，如MO54對輻射敏感，而T98則對輻射抵抗10；U373、U251、U118MGT-98G表達突變型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1細胞表達野生型p53。針對不同細胞系的特點，在實驗研究時可以根據(jù)需要而加以選擇。Ostruszka等11在研究細胞周期進程中由2,2-二氟脫氧胞嘧啶核苷

9、(2, 2-difluoro-2-deoxycytidine; dFdCyd)引起的放射敏感性的作用中運用了2種人膠質瘤細胞系U251和D54，并且發(fā)現(xiàn)U251對dFdCyd的細胞毒性更敏感，dFdCyd也是U251的放射增敏劑，這種差異在于U251表達突變型p53，而D54細胞表達野生型p53，在D54細胞聯(lián)合dFdCyd和電離輻射后，突出表現(xiàn)在G1期阻滯。Chen等12在研究DB-67作為一種新型DNA拓撲異構酶具有靶向輻射增敏劑的研究中也運用了表達野生型p53和突變型p53的D54-MG和T-98G膠質瘤細胞系。Shono等13采用將腺病毒載體-p53(Ad-p53)導入表達突變型p53

10、的膠質瘤細胞系U251、U373和表達野生型p53的U87、D54細胞系，Ad-p53能通過增加表達野生型p53膠質瘤細胞的凋亡趨勢來提高它們的放射敏感性，并進一步揭示Ad-p53轉染的人膠質瘤細胞所誘導的凋亡和磷酸化區(qū)域特異性的位點相關。    2.1.2  在化療藥物研究中的應用  膠質瘤化療效果差，這主要與缺乏有效的化療藥、全身化療時化療藥難以通過血腦屏障以及腫瘤耐藥有關。因此膠質瘤細胞培養(yǎng)廣泛應用于新藥開發(fā)。Das等14用U87-MG研究地塞米松能夠通過維持Bax:Bcl比率來保護人膠質瘤細胞U87-MG免于遭受替莫唑胺誘導的凋亡，提示

11、膠質瘤患者接受替莫唑胺化療之前如果用地塞米松將會產生非預期效果，為指導臨床治療打下基礎。Landen等15在研究那可丁通過血腦屏障及抑制膠質瘤生長時利用鼠C6細胞系，證明那可丁可以抑制C6細胞增殖，并測定那可丁通過一層培養(yǎng)的腦微血管內皮細胞比率，并且與已知的滲透劑和非滲透劑相比較，來作為體外測定那可丁通過血腦屏障的方法。    2.1.3  在生物和基因治療研究中的應用  生物治療主要是通過調動宿主天然防衛(wèi)機制或給予機體某些物質來取得抗腫瘤效應。對抗腫瘤防御機制的基礎理論的深入了解以及生物反應調節(jié)劑（BRMs）的不斷發(fā)現(xiàn)和應用使得生物治療前景廣

12、闊。BRMs大致有以下幾類：天然或基因重組細胞因子、抗腫瘤的各類體細胞和輔助性的造血干細胞、抗體、基因治療、腫瘤疫苗、抗血管生成藥、細胞分化誘導劑、某些菌類及其有效成分、植物藥包括中藥的有效成分、有機酸及小分子合成劑、其他類型。隨著生物治療研究的不斷升溫，膠質瘤的細胞培養(yǎng)已廣泛應用于膠質瘤生物治療的許多方面，如：Friese等16利用人膠質瘤細胞系和鼠膠質瘤細胞系GL261 和SMA-560研究NKG2D，腫瘤細胞表達的配體激活免疫受體NKG2D 刺激由NK、T和CD8+T細胞介導的腫瘤免疫。人膠質瘤細胞表達NKG2D的配體MICA、MICB和一些UL16-結合蛋白家族，然而膠質瘤細胞因為高表

13、達型MHC抗原而抵抗NK細胞的細胞毒作用，體外實驗中質粒介導或腺病毒介導在膠質瘤細胞過表達的MICA可提高它們對NK和T細胞的應答。腫瘤疫苗也是當今研究熱點之一，制備以及測試抗膠質瘤疫苗都需要膠質瘤細胞培養(yǎng)。如利用膠質瘤細胞致敏樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）制備膠質瘤疫苗。Driessens等17發(fā)現(xiàn)被射線或化療藥（順鉑和絲裂霉素）作用后凋亡的膠質瘤9L細胞聯(lián)合鼠來源的成熟DCs分泌GM-CSF顯示較好的治療腫瘤潛能。Giezeman-Smits等18發(fā)現(xiàn)用白介素-4(IL-4)轉染膠質瘤9L細胞制備的腫瘤疫苗能夠誘導親代腫瘤發(fā)生特異的、有保護性的免疫應答。針對膠質瘤基因

14、治療的研究也越來越多，如單純皰疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/丙氧鳥苷(GCV)系統(tǒng)、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(Ec-CD)基因/5 氟胞嘧啶(5-FC)系統(tǒng)；早期生長反應基因-1啟動子（pEgr-1）；CEA-啟動子等19 22。    2.1.4  在動物模型研究中的應用  培養(yǎng)的膠質瘤細胞還可以用于建立動物模型，為研究膠質瘤發(fā)病機理以及治療提供良好的實驗對象。如利用鼠類細胞系立體定向注射于大鼠顱內建立鼠膠質瘤模型等。Prins等23通過向C57BL/6 (H-2b)雌鼠的腹側皮下注射GL26膠質瘤細胞以及將GL26膠質瘤細胞立體定向注射于

15、大鼠顱內建立鼠膠質瘤模型，用于研究黑色素瘤相關抗原（MMAs）的靶向免疫治療。    2.1.5  在其他方面研究中的應用  膠質瘤細胞培養(yǎng)除用于上述研究外，還廣泛應用于其他研究方面，如探討膠質瘤細胞與正常星型細胞之間的作用機制；膠質瘤細胞凋亡機制以及侵襲轉移機制等。Zhang等6在研究惡性膠質瘤細胞和星型細胞之間的直接縫隙連接的交流中采用了原代培養(yǎng)的膠質瘤細胞和原代培養(yǎng)的星型細胞。Joy等3利用SF767 和T98G膠質瘤細胞系研究發(fā)現(xiàn)惡性膠質瘤細胞激活P13-K途徑并且表現(xiàn)降低凋亡的敏感性。Yamamoto等24利用SNB-19、D-54M

16、GU、87 MG、U-373 MG、U-118 MG和SW1088研究N-glycan在調節(jié)膠質瘤遷移和侵襲中的作用。    2.2  三維（立體）培養(yǎng)及應用  單層細胞培養(yǎng)雖然已經(jīng)得以廣泛應用，但也有其不足之處：第一，具有遺傳不穩(wěn)定性；第二，是一個平面結構，而人體是三維立體結構，與人體環(huán)境相差很遠。針對這些不足，許多科研工作者也嘗試用立體培養(yǎng)，因為環(huán)境對細胞的生長分化有著至關重要的作用。已有科研證明異位植入的胚胎細胞能轉化為惡性細胞，并引發(fā)癌癥，而相同的細胞在子宮內則可形成正常的胚胎；相反畸胎瘤細胞植入胚胎內可能經(jīng)歷正常的發(fā)育過程。與傳統(tǒng)的培

17、養(yǎng)方式相比，三維立體培養(yǎng)的細胞在細胞形狀和細胞環(huán)境更接近于活體內狀態(tài)，而形狀和環(huán)境能決定細胞的基因表達和生物學行為。三維細胞培養(yǎng)優(yōu)點還在于具有清晰的幾何學形狀，這使其結構與功能直接相關，從而可以進行理論分析25。Joki等26在研究環(huán)氧化酶-2的實驗中運用了三維培養(yǎng)系統(tǒng)，證明環(huán)氧化酶-2抑制劑NS-398對膠質瘤細胞生長和遷移有抑制作用。但是三維立體培養(yǎng)也不能完全模擬體內環(huán)境，而且立體培養(yǎng)的模型在目前條件下難以無限生長下去，主要是因為模型長到一定大小時，由于模型中心缺乏營養(yǎng)或缺氧而壞死。因此如何解決這些問題，還需要進一步努力。    2.3  其他培養(yǎng)方

18、法及應用  目前培養(yǎng)和應用膠質瘤細胞除了單獨應用上述培養(yǎng)方法以外，還有共培養(yǎng)（coculture）方法,即將2種或2種以上的細胞一起培養(yǎng)的方法，其實質也是單層細胞培養(yǎng)；也有嘗試2種或幾種方法聯(lián)合應用，如同時選用單層細胞培養(yǎng)及三維立體培養(yǎng)。Zhang等6將原代培養(yǎng)的人膠質瘤細胞和原代培養(yǎng)的鼠星型細胞共培養(yǎng)，并認為2種細胞之間的縫隙連接的形成不是自然的，因為將膠質瘤細胞注射入活鼠腦內很快就能和宿主細胞功能性耦聯(lián)在一起，而且和膠質瘤細胞耦聯(lián)在一起的縫隙連接似乎可以調節(jié)星型細胞的表型。和膠質瘤細胞共培養(yǎng)的星型細胞表達Cx43顯著降低并可以低水平表達GFAP。Joki等26在研究環(huán)氧化酶-2的

19、實驗中除了運用三維培養(yǎng)系統(tǒng)外，還運用了單層細胞培養(yǎng)檢測NS-398抑制膠質瘤細胞增殖以及運用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測腫瘤細胞侵襲入正常鼠腦細胞。    3  展  望    提到膠質瘤細胞培養(yǎng)就不得不關注膠質瘤干細胞的研究。目前除膠質瘤細胞原代培養(yǎng)以及膠質瘤細胞系的培養(yǎng)外，還有人通過原代無血清培養(yǎng)、神經(jīng)干細胞培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)以及CD133免疫磁珠分離等方法成功地分離、培養(yǎng)出膠質瘤干細胞。膠質瘤干細胞的分離、培養(yǎng)及研究是目前膠質瘤研究的熱點，該研究將為膠質瘤的診斷與治療帶來新的突破與希望。膠質瘤血管發(fā)生、形成、血管結構改變以及與

20、周圍組織的關系也是當今研究熱點，而這方面研究也需要細胞培養(yǎng)技術。通過該研究有利于闡明膠質瘤的浸潤、轉移與其血管生成、結構之間的相關性，以及化療藥物透過血腦屏障的藥代機制等。所以膠質瘤的細胞培養(yǎng)是一項非常重要的基礎技術，相信新的培養(yǎng)技術會不斷產生，新的應用領域會不斷發(fā)現(xiàn)。 【參考文獻】  1 Bondy ML, Wang LE, El-Zein R, et al. -radiation sensitivity and risk of gliomaJ. J Natl Cancer Inst, 2001, 93(20) :1553-1557.2 Hegde M, Rodcoe J

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