動物肝臟中DNA的提取檢測實驗報告

1、動物肝臟中DNA的提取及檢測一、前言脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸（DNA ，為英文 Deoxyribonucleic acid的縮寫），又稱去氧核糖核酸， 是脫氧核糖核酸染色體的主要化學成分， 同時也是組成基因的材料。 有時也被稱為“遺傳微?！?， 原因是在繁殖過程中，父代會把它們自己 DNA 的一部分復制傳遞到子代中，從而完成性狀的傳播。DNA 是高分子聚合物， DNA 溶液為高分子溶液，具有很高的粘度，可被甲基綠染成綠色。 DNA 對紫外線（ 260nm ）有吸收作用，利用這一特性，可以對 DNA 進行含量測定。當核酸變性時，吸光度升高，稱為增色效應(yīng)；當變性核酸重新復性時，吸光度又會恢復到原來的

2、水平。較高溫度、有機溶劑、酸堿試劑、尿素、酰胺等都可以引起 DNA 分子變性，即 DNA 雙鏈堿基間的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開也稱為 DNA 的解螺旋。在細胞內(nèi)， DNA 能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，整組染色體則統(tǒng)稱為染色體組。對于人類而言，正常的體細中含有46 條染色體。染色體在細胞分裂之前會先在分裂間期完成復制，細胞分裂間期又可劃分為： G1 期-DNA 合成前期、 S 期-DNA 合成期、 G2-DNA合成后期。對于真核生物，如動物、植物及真菌而言，染色體主要存在于細胞核內(nèi)；而對于原核生物， 如細菌而言，則主要存在于細胞質(zhì)中的擬核內(nèi)。染色體上的染色質(zhì)蛋白，如組織蛋白，能夠?qū)?DNA 進行組

3、織并壓縮，以幫助 DNA 與其他蛋白質(zhì)進行交互作用，進而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。脫氧核糖核酸的結(jié)構(gòu)DNA 的結(jié)構(gòu)：DNA 的結(jié)構(gòu)一般可劃分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)四個水平。DNA 是一種長鏈聚合物，組成單位為四種脫氧核苷酸，即腺嘌呤脫氧核苷酸（dAMP脫氧腺苷）、胸腺嘧啶脫氧核苷酸 （dTMP脫氧胸苷）、胞嘧啶脫氧核苷酸（dCMP脫氧胞苷）、鳥嘌呤脫氧核苷酸（ dGMP脫氧鳥苷）。而脫氧核糖（五碳糖）與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長鏈骨架，排列在外側(cè)，四種堿基排列在內(nèi)側(cè)。每個糖分子都與四種堿基里的其中一種相連，這些堿基沿著DNA 長鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，指導蛋白質(zhì)的合成。

4、讀取密碼的過程稱為轉(zhuǎn)錄，是以DNA 雙鏈中的一條單鏈為模板轉(zhuǎn)錄出一段稱為 mRNA （信使 RNA ）的核酸分子。DNA 是由許多脫氧核苷酸按一定堿基順序彼此用3 ， 5 - 磷酸二酯鍵相連構(gòu)成的長鏈。大多數(shù)DNA 含有兩條這樣的長鏈，也有的 DNA 為單鏈，如大腸桿菌噬菌體 X174 、G4、M13 等。 DNA 有環(huán)形 DNA 和鏈狀 DNA 之分。在某些類型的 DNA 中， 5- 甲基胞嘧啶可在一定限度內(nèi)取代胞嘧啶， 其中小麥胚 DNA 的 5- 甲基胞嘧啶特別豐富。在某些噬菌體中，5- 羥甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40 年代后期，查加夫（E.Chargaff ）發(fā)現(xiàn)不同物種 DNA 的堿

5、基組成不同，但其中的腺嘌呤數(shù)等于其胸腺嘧啶數(shù)（A=T ），鳥嘌呤數(shù)等于胞嘧啶數(shù)（G=C ），因而嘌呤數(shù)之和等于嘧啶數(shù)之和，一般用幾個層次描繪DNA 的結(jié)構(gòu)。濃鹽法從動物組織中提取DNA核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白 （DNP/RNP ）的形式存在，其中 DNP 能溶于水及高濃度鹽溶液，但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解度很低，而 RNP 則可溶于低鹽溶液，因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分別抽提出來。 將抽提得到的 DNP 用 SDS 處理可將其分離 DNA 和蛋白質(zhì)，用氯仿 - 異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得 DNA 上清，加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。肝臟細胞肝臟是由肝細胞

6、組成，肝細胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微鏡才能看到。人肝約有 25 億個肝細胞， 5000 個肝細胞組成一個肝小葉，因此人肝的肝小葉總數(shù)約有 50 萬個。肝細胞為多角形，直徑約為 20-30/ 加(微米 )，有 6-8 個面，不同的生理條件下大小有差異，如饑餓時肝細胞體積變大。 每個肝細胞表面可分為竇狀隙面、 肝細胞面和面三種。肝細胞里面含有許許多多復雜的細微結(jié)構(gòu) :如肝細胞核、肝細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。二、實驗?zāi)康?. 掌握濃鹽法從動物組織中提取DNA 的原理與技術(shù)三、實驗原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中常以核蛋白（DNP/RNP ）的形式存在，其中 DNP 能溶于水及

7、高濃度鹽溶液，但在 0.14 M 的鹽溶液中溶解度很低，而 RNP 則可溶于低鹽溶液，因此可利用不同濃度的 NaCl 溶液將其從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的DNP 用 SDS 處理可將其分離DNA 和蛋白質(zhì)，用氯仿 - 異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去可得DNA上清，加入冷乙醇即可將其呈纖維狀析出。四、實驗器材和材料試劑實驗器材：勻漿器量筒離心機離心管試管吸管恒溫水浴鍋實驗材料：豬肝實驗試劑：0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉溶液（pH6.8）95% 乙醇（ A.R.）NaCl 固體（ A.R.）5%SDS 溶液（ 5g SDS定容至 100ml）V(氯仿 )：V（異戊醇） 20

8、 ：1 的混合液五、實驗操作1. 稱量 稱 取 一 定 質(zhì) 量 的 豬 肝 ， 加 入 2 倍 肝 重 的 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 檸檬酸鈉緩沖液并用勻漿器磨碎（已完成）。2. 提取DNA量取肝糜4 ml于10毫升離心管，在4000r/min下離心10min，沉淀中再加入8 ml緩沖液于4000r/min離心5 min；棄上清，取沉淀；將沉淀用10 ml 檸檬酸鈉緩沖液完全洗入干凈的小燒杯、加入 5 ml 氯仿 - 異戊醇混合液、1 ml SDS ，振蕩 30min（保鮮膜封口）；緩慢加入固體 NaCl （約 0.9g ），使其最終濃度為 1mol/L ；將溶液分裝到

9、2 個 10 毫升離心管中，在 4000r/min 離心 5min ，取上清水相；在上述水相溶液中分別加等體積冷95% 乙醇，邊加邊用玻棒慢慢朝一個方向攪動， 將纏繞在玻棒上的凝膠狀物用濾紙吸去多余的乙醇，即得 DNA 粗品；用 8ml 蒸餾水溶解 DNA 粗品于 10ml 離心管中。3. 標準曲線的繪制按下表加入各種 試劑，混勻，于 60 恒溫水浴鍋 45min ，冷卻后，在 595nm 波長下于分光光度計比色測定，以吸光度對 DNA 濃度作圖，制作標準曲線。012345標準 DNA溶0.00.40.81.21.62.0液/ml蒸餾水 /ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑4.04

10、.04.04.04.04.0/mlA595nm4. 樣品的測定將 DNA 粗品定容至 25ml 容量瓶，再取 DNA 樣液 1.0ml ，加入蒸餾水 1.0ml ，混勻。然后準確加入二苯胺試劑 4.0ml ，混勻，于60 恒溫水浴鍋 45min ，冷卻后，595nm波長下于分光光度計比色測定，根據(jù)所測的吸光度對照標準曲線求得DNA 的質(zhì)量（ ug ）。5. 計算 100g 豬肝中 DNA 含量 w=m1/m2 ×100%w ：DNA 的質(zhì)量分數(shù)（ %）m1 ：樣液中測得的DNA 的質(zhì)量（ ug ）m2 ：樣液中所含樣品的質(zhì)量（ug ）六、實驗數(shù)據(jù)處理1. 標準曲線012345標準 D

11、NA溶0.00.40.81.21.62.0液/ml蒸餾水 /ml2.01.61.20.80.40二苯胺試劑4.04.04.04.04.04.0/mlA595nm00.0390.090.1460.1970.249DNA 含量080160240320400/ug2. 實驗結(jié)果處理豬肝質(zhì)量為 2.04gDNA 提取液體積為 12.53ml序號123A595nm0.1020.1020.101平均 A595nm0.102樣液中 DNA 含量 /ug171.4樣液中樣品質(zhì)量 /g0.1628根據(jù)公式w=m1/m2×100%得： w=0.1053 則 100g 豬肝中 DNA 含量為： w 

12、15;100=0.1053g七、思考題1. 實驗中的乙醇、 SDS、氯仿 - 異戊醇、 NaCl 、檸檬酸鈉分別有什么作用？答：檸檬酸的鈉鹽在實驗中既充當DNA酶的抑制劑，也是pH 緩沖溶液； SDS 是表面活性劑，可以讓蛋白質(zhì)與 DNA 分開；氯仿是有機溶劑，可以使蛋白質(zhì)聚集沉淀， 便于分離出去；異戊醇是消泡劑，可以減少泡沫的發(fā)生；氯仿 - 異戊醇的作用是使、膜溶解；NaCl 固體溶解使得試液成為高濃度的鹽溶液，在這樣的環(huán)境中 DNA核蛋白能溶解， RNA 核蛋白則溶解度很低，可以利用這一性質(zhì)分離兩種核酸。八、實驗注意事項1.DNA主要集中在細胞核中，因此，通常選用細胞核含量比例大的生活組織

13、作為提取制備DNA 的材料，小牛胸腺組織中細胞核比例較大，因而 DNA 含量豐富，同時其脫氧核苷酸酶活性較低，制備過程中 DNA 被降解的可能性相對較低，所以是制備DNA 的良好材料，但其來源較困難，脾臟或肝臟易獲得，也是實驗室制備DNA 常用的材料，本實驗用新鮮肝臟作為實驗材料。2. 為了防止大分子核酸在提取過程中被降解，須采取以下措施：整個過程必須在低溫下進行， 可加入某些物質(zhì)抑制核酸酶的活性， 如檸檬酸鈉、 EDTA、SDS 等， EDTA 是抑制核酸酶的活性最好的抑制劑。3. 從核蛋白中脫去蛋白質(zhì)的方法很多，經(jīng)常采用的有：氯仿 - 異丙醇法、苯酚法、去垢劑法等，他們均能使蛋白質(zhì)變性和核

14、蛋白解聚，并釋放出核酸。4. 使用離心機時，對稱放置的離心管必須用天平調(diào)平衡。5. 避免劇烈振蕩，如研磨過程、攪拌過程等。九、實驗結(jié)果誤差分析及討論經(jīng)過對本次實驗結(jié)果進行分析，得出100g 豬肝中 DNA 含量大約為0.1053g 的結(jié)論，在上網(wǎng)查閱相關(guān)資料后發(fā)現(xiàn)：豬肝中 DNA 含量與本次試驗實際操作測量得出的結(jié)果大致相互吻合。 由此可知，本次試驗結(jié)果是相對比較成功的，較為粗略地測量出豬肝中 DNA 的含量，并且較為熟練地掌握了濃鹽法從動物組織中提取 DNA 的原理與技術(shù)，基本達到了本次實驗的目的。但是本次實驗結(jié)果只是粗略測量，并未達到精確測量豬肝中DNA 的含量，且實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低，這

15、是由于某些誤差導致，在實驗過程中些許因素可能會導致實驗結(jié)果數(shù)據(jù)有偏差，經(jīng)分析得出以下幾點：在稱取豬肝后加入檸檬酸鈉緩沖液進行研磨的過程中， 由于豬肝組織表面較滑不易磨碎， 且研磨至最后依舊有小部分豬肝組織塊殘留，因此可能導致豬肝中 DNA 提取不充分，致使實驗數(shù)據(jù)較理論值偏低；研磨過程中， 可能由于操作不當，導致部分液體濺出，因此可能使得提取液中部分DNA 損失，導致實驗數(shù)據(jù)偏低；在粗提取 DNA 操作中，頻繁地將 DNA 提取液轉(zhuǎn)移至各個儀器內(nèi)，可能有極小部分 DNA 提取液未倒凈，殘留在儀器壁上損耗掉，導致實驗誤差；在使用移液槍的過程中， 可能因為操作不當或移液槍經(jīng)常錯誤使用，出現(xiàn)儀器誤差， 導致吸取的 DNA 樣液不精確，出現(xiàn)實驗誤差；在水相中加入乙醇析出 DNA