土壤中具抗腫瘤活性微生物的篩選與分離

1、土壤中具抗腫瘤活性微生物的篩選與分離湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2012級基地2班肖蓉摘要：隨著癌癥發(fā)病率的日益增高，如何快速有效地找到癌癥的治療方法迫在眉睫。通過微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)抗腫瘤活性物是一種簡單易行的方法。土壤中放線菌種類與數(shù)量位居第二，在這之中有許多具有抗腫瘤活性的類別仍待被發(fā)現(xiàn)，因此，通過在土壤中篩選具有這種特性的菌株具有必要性。關(guān)鍵詞：放線菌 抗腫瘤 鑒定與篩選 目錄 （一）土樣采集 （二）富集 （三）分離培養(yǎng) （四）篩選 （五）產(chǎn)物分析 （六）文獻(xiàn)引用 （一）土樣采集 土壤是環(huán)境微生物學(xué)研究中最具挑戰(zhàn)性的環(huán)境,土壤也是各種微生物最集中的地方，在土壤中，微生物總數(shù)依次是細(xì)菌、放線菌

2、、真菌（霉菌和酵母）、原生動物等。土壤中放線菌的孢子含量多，有利于從中篩選出符合實(shí)驗(yàn)研究要求的放線菌種類。但是隨著土壤中的養(yǎng)分、通氣、酸堿度及其所處的季節(jié)和地理?xiàng)l件的不同，微生物的分布也會不同，因此，廣泛采集各地的土壤樣品進(jìn)行微生物的篩選，增大了野生菌株新類型的概率，因?yàn)榈厍蛏衔⑸锓N類與數(shù)量遠(yuǎn)不止現(xiàn)如今所發(fā)現(xiàn)的這些。偏堿性土壤中放線菌的含量較多，因此試驗(yàn)中應(yīng)盡量采集偏堿性、干燥的土壤樣品。且土壤中略帶土腥味時(shí)，含有放線菌的孢子數(shù)會更多。采集土壤時(shí)，使用干凈的鏟子、透氣的塑料袋，先刮去表層5厘米左右的土，然后進(jìn)行采樣，采集完土樣后，在塑料袋上標(biāo)明采樣的地址、采集人以及采集的時(shí)間，作為菌種來源的

3、說明，以便更好的對篩選出的菌種生活習(xí)性的描述與分析。采樣時(shí)隨機(jī)選取五個(gè)樣本地，20*20平方米的面積，隨即采取100-200克的土樣。對土壤的處理： 高有機(jī)質(zhì)土樣經(jīng)過適度微波處理可顯著增加土壤放線菌總數(shù)、鏈霉菌數(shù)。微波預(yù)處理土樣對可培養(yǎng)放線菌的種類有明顯影響，微波處理新鮮土樣對土壤微生物數(shù)量有一定影響。不同粒級土壤中放線菌的種類和數(shù)量不同。土壤粒徑越小，放線菌數(shù)量越多。此外，新鮮采集的土樣都要經(jīng)過晾干然后收集到無菌透氣的袋子并貼好采集時(shí)的標(biāo)記，保存在陰涼干燥的地方。（二）富集富集培養(yǎng)是指當(dāng)樣品中微生物含量較少時(shí)，根據(jù)該微生物的生理特點(diǎn)，人為創(chuàng)建一種培養(yǎng)條件，使樣品中的微生物在最適合的環(huán)境條件下

4、生長繁殖，相對數(shù)量快速增加，以利于菌株分離的手段。任何一種微生物的正常生長都有其特定要求的生理及環(huán)境條件，包括碳源、氮源、酸堿度、溫度、空氣等要求，富集培養(yǎng)就是通過控制這些條件達(dá)到目的。由于本實(shí)驗(yàn)是要篩選放線菌，故使用最經(jīng)典的高氏一號培養(yǎng)基對土壤中的放線菌進(jìn)行富集培養(yǎng)。此外，放線菌的生長條件偏堿性，因此，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為堿性：7.2-8.5，以利于放線菌形成優(yōu)勢菌落而抑制其它微生物的生長。此外，在培養(yǎng)基中加入10%的苯酚抑制霉菌的生長，以及增強(qiáng)放線菌的抗逆性。在實(shí)驗(yàn)過程中，高氏一號培養(yǎng)基倒完平板后通常需要將培養(yǎng)基表面風(fēng)干，以創(chuàng)造出一個(gè)適合放線菌生長而不利于大多數(shù)細(xì)菌生長的干燥環(huán)境。此外，

5、在倒培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)在倒平板時(shí)留出足夠的空間，以利于放線菌的生長，因?yàn)槠渖L周期較長、好氧，初次篩選時(shí)生長周期更長，一般需要5-8天的時(shí)間，因此，應(yīng)留出足夠空間，保證空氣含量，并做到無菌操作，以避免讓其他生長周期短的菌株先形成優(yōu)勢菌落。將土樣做成濃度梯度稀釋后接種。放入28-32攝氏度培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5天左右。高氏一號培養(yǎng)基（1L）：可溶性淀粉20克；三水磷酸氫二鉀5克；七水硫酸鎂5克；硝酸鉀10克；瓊脂20克；氯化鈉5克，七水硫酸亞鐵1克；蒸餾水1000ml；pH：7.2-7.5；滅菌121攝氏度20分鐘。配制時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐

6、一溶化其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分到100ml，調(diào)pH。高溫滅菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100ml培養(yǎng)基中混勻，將培養(yǎng)基倒入平皿內(nèi)約15ml/皿 （三）分離培養(yǎng)樣品經(jīng)富集后的培養(yǎng)液，仍然是多種微生物混合在一起，為了獲得純種，就必須采用特定有效的技術(shù)方法，把我們需要的菌株從中分離出來。這種方法是分離單個(gè)微生物細(xì)胞，經(jīng)分裂繁殖在固體培養(yǎng)基上形成肉眼可見的單菌落，通過在肉眼條件下獲取該單菌落而獲得該微生物的純培養(yǎng)?，F(xiàn)在多采用稀釋涂布平板法、平板劃線法等，此外，還可以結(jié)合特定的生理生化試驗(yàn)進(jìn)行擴(kuò)展，如透明圈法、變色圈法、生長圈法和抑制圈法。具有抗腫瘤活性的放線菌多產(chǎn)生一些抗生素等，因此會在菌落周圍

7、形成一個(gè)透明抑制圈，用來抑制其他種類微生物的生長。放線菌的菌落形態(tài)特征為小而干燥，菌落致密，且菌落不透明，邊緣有樹枝狀菌絲或光滑或粉狀不均勻，菌落有時(shí)能形成各種顏色的色素，且具有特殊的土腥味。挑取單菌落，繼續(xù)接種到新的高氏一號培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，多采用劃線分離的方法，以便更好地分理出單菌落。連續(xù)純化2-3次可以減少菌落的混雜程度，避免菌株因?yàn)楦采w和毗鄰而重疊生長造成的菌落不純。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，放線菌是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁厚呈紫色且菌落呈樹枝狀等各種典型特征。對這些菌落可以進(jìn)行標(biāo)記區(qū)分，比如可以記下它們分別的來源，或者挑選時(shí)的序號。（四）篩選初篩初篩是指從大量分離到的微生物中將具有

8、合成目的產(chǎn)物能力的微生物篩選出來的過程。一般采用平板篩選和搖瓶篩選的辦法，高通量篩選技術(shù)的興起使得篩選過程自動化，更快速、便捷。由于先前在分離培養(yǎng)過程中菌落已經(jīng)進(jìn)行過多次純化，所以接下來就是進(jìn)行搖瓶發(fā)酵的篩選。配置高氏一號的液體培養(yǎng)基，分裝成幾瓶，40ml/250ml錐形瓶，調(diào)好pH值后滅菌，冷卻后接入已經(jīng)純化好的單菌落的菌株，放入搖床，270rpm、32攝氏度進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，5天后菌液出現(xiàn)渾濁或者小球狀的菌落團(tuán)，無菌條件下取出適量的菌液進(jìn)行相差顯微鏡的鏡檢，觀察菌落生長狀況以及是否染菌，一般在此時(shí)菌落進(jìn)入對數(shù)期生長，對于生長狀況好、未染菌的菌株可以制成菌保液放入-80攝氏度冰箱保存以備今后使用

9、。在發(fā)酵第八天左右，菌落進(jìn)入穩(wěn)定期生長，此時(shí)，是各種發(fā)酵產(chǎn)物含量最多的時(shí)期，也是收獲產(chǎn)物的最佳時(shí)期。停止發(fā)酵，取出菌液，分裝到小的EP管中，作為實(shí)驗(yàn)用。每種菌分裝3-4支。發(fā)酵完成后，就可以進(jìn)行初篩了。將用于試驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞復(fù)蘇解凍后傳代培養(yǎng)，接下來就可以對生長狀況良好的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將腫瘤細(xì)胞鋪板后，加入菌種發(fā)酵液做初篩，初篩要求對生物活性檢測既快速又準(zhǔn)確，為特異性藥理活性物質(zhì)提供一個(gè)有效的篩選方式。體外初篩最常用的模型為小鼠體內(nèi)的L1210和P338淋巴細(xì)胞，最小火性標(biāo)準(zhǔn)為50%延滯存活。每個(gè)菌株只做1至2塊板的生測實(shí)驗(yàn)，記錄結(jié)果比較好的菌種，做好標(biāo)記并記錄腫瘤細(xì)胞的對應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每個(gè)菌

10、種選取幾種不同的腫瘤細(xì)胞做生測實(shí)驗(yàn)，然后綜合分析菌種的抗腫瘤效果，對該菌種做出一個(gè)初步評估復(fù)篩通過初篩工作，一般可以淘汰85%-90%不合要求的微生物。余下的菌株繼續(xù)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，步驟與初篩同，然后取菌液做更加精細(xì)的細(xì)胞生測實(shí)驗(yàn)。此次每個(gè)菌株做2-3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，且用于試驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞株種類應(yīng)更多。對于此次結(jié)果好的菌株，可以再做一個(gè)菌液的濃度梯度的實(shí)驗(yàn)，以探索不同濃度下菌株發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤活性的強(qiáng)弱。經(jīng)過這一系列的篩選工作，具有較好的抗腫瘤活性的菌株就已經(jīng)基本上分離出來了，當(dāng)然，除了單獨(dú)培養(yǎng)外，也可以做不同菌株之間相互混合培養(yǎng)對其活性的影響。由于復(fù)篩的重復(fù)試驗(yàn)組數(shù)多，工作量很大，因此，也可以結(jié)合一

11、些高通量篩選的方法，比如一些機(jī)械自動化儀器的使用與檢測儀器的結(jié)合使用。 （五）產(chǎn)物分析進(jìn)行復(fù)篩后，對于抗腫瘤活性表現(xiàn)好的菌株，就要對其抗腫瘤活性物進(jìn)行產(chǎn)物分析。用于檢測多種抗腫瘤實(shí)際的指紋法，省去了對已知抗生素的頻繁的重復(fù)檢測，提高了對抗腫瘤活性物的篩選的工作效率。主要是避免了用在已知的抗腫瘤活性物的分離上的體力和時(shí)間。指紋法包括：抗微生物活性、紙層析、菌種鑒定、薄層層析、紫外吸收光譜、高效液相色譜。以下選取幾個(gè)方法進(jìn)行試驗(yàn)。1，抗微生物活性：通常用于抗微生物活性分析的菌株有鼠傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等致病菌，對他們做一個(gè)抑菌實(shí)驗(yàn)分析，可以初步得出待測菌株的抗菌活性。這一版還可以通過分離培養(yǎng)過程中透明抑菌圈的大小初步判斷待測菌株的抑菌能力。試驗(yàn)中，把待檢菌株菌液制成濃度梯度，然后通過濾紙片接種在上述幾種致病菌的生長平板上，然后測量和記錄抑菌圈的大小。2，菌種鑒定：將待檢菌株進(jìn)行預(yù)處理，即將菌種從培養(yǎng)基中分離出來。通常是離心分離、溶菌酶處理破壁、蒸餾水洗、再離心等步驟，得到菌株。然后通過16srRNA分析，包括pcr擴(kuò)增、熱轉(zhuǎn)、連接等步驟后送去專門測序的公司如Life Tech、上海生工，測序后在NCBI官方網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，得到近似菌及G+C的%值，最后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對篩選出的有抗腫瘤活性的菌種進(jìn)行一個(gè)分類。 （六）文獻(xiàn)引用1，海