植物類生長激素—赤霉素的發(fā)酵生產(chǎn)及分離純化與各參數(shù)的測定實驗

1、植物類生長激素赤霉素的發(fā)酵生產(chǎn)及分離純化與各參數(shù)的測定實驗一、赤霉素的分批發(fā)酵實驗?zāi)康模?1、學(xué)會發(fā)酵罐過程操作 2、掌握發(fā)酵液中氨基酸、還原糖、總糖和赤霉素含量測定方法。實驗原理： 赤霉素工藝流程圖： 菌種制備一級培養(yǎng)二級培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 發(fā)酵液預(yù)處理過濾濃縮萃取脫脂 重結(jié)晶產(chǎn)品實驗步驟：1、培養(yǎng)基的配制與滅菌 種子培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基（硝酸鈉 3g 磷酸氫二鉀 1g 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5g 氯化鉀 0.5g 硫酸亞鐵 0.01g 蔗糖 30g 瓊脂 20g 蒸餾水 1000mL 制法 加熱溶解，分裝后121滅菌20min。） 發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基、大米斜面培養(yǎng)基和

2、槐樹枝斜面培養(yǎng)基。2、種子活化與擴(kuò)大培養(yǎng)3、發(fā)酵罐的滅菌與接種4、發(fā)酵工藝控制二、赤霉素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定實驗?zāi)康模菏炀氄莆粘嗝顾睾繕?biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法實驗原理：赤霉素在加熱條件下能使Fe3+還原產(chǎn)生Fe2+，F(xiàn)e2+與鄰菲羅啉形成紅色絡(luò)合物，然后在分光光度計下測定吸光度。實驗器材： 水浴鍋、比色管、比色皿、pH=5的HAc-NaAc緩沖溶液、lNaF溶液、鄰菲羅啉溶液、Fe3+溶液、分光光度計。實驗過程：每隔一段時間取一定量的發(fā)酵液于25ml比色管中，依次準(zhǔn)確加入3.00mlFe3+溶液和4.00ml鄰菲羅啉溶液，搖勻，在沸水中加熱50min后，取出，冷水冷卻至室溫，加入3mlNaF溶液和5

3、ml pH=5的HAc-NaAc緩沖溶液，用水定容至刻度線，搖勻，用2ml比色皿以相應(yīng)試劑空白作參比，在波長510nm處測定溶液的吸光度A。結(jié)果處理：以時間（T）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制赤霉素含量曲線圖附：赤霉素濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖三、發(fā)酵液中還原糖含量的測定實驗?zāi)康模?，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定Tr21發(fā)酵液中還原糖含量，利用糖含量這個參數(shù)，控制發(fā)酵過程.實驗原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與光吸收

4、值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。實驗器材： 發(fā)酵液（5天）：赤霉素發(fā)酵液（GA） 3，5-二硝基水楊酸（DNS），氫氧化鈉，苯酚，亞硫酸鈉，酒石酸鉀鈉，葡萄糖，蒸餾水 可見分光光度計，電子天平，真空干燥箱，數(shù)顯恒溫水浴鍋，離心機(jī)，移液器，槍頭，500ML容量瓶，試管，500 ml 燒杯，1000ml量筒試劑配制 （1）1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100ml，即含葡萄糖為1.0mg/ml。 （2）3,5二硝基水楊酸試劑：稱取6.3 g 3,5二硝基水楊酸并量取262 ml 2mol/L NaOH加到酒石酸鉀納的

5、熱溶液中（ 182 g酒石酸鉀納溶于500 ml水中 ），再加5 g結(jié)晶酚和5 g亞硫酸氫鈉溶于其中，攪拌溶解，冷卻后定容到1000 ml貯于棕色瓶中。 （3）碘碘化鉀溶液：稱取5g碘，10g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。 （4）6N NaOH：稱取120g NaOH溶于500ml蒸餾水中。 （5）0.1% 酚酞指示劑。 （6）6 mol/L HCl溶液實驗步驟：1、葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于15 ml試管中，用蒸餾水補足至1.0ml, 分別準(zhǔn)確加入DNS試劑2ml，沸水浴加熱2min，流水冷卻，用水補足到15

6、ml刻度。在540nm波長下測定吸光度。2、樣品測定： 每隔一段時間取適量發(fā)酵液液，稀釋10倍，取稀釋后的發(fā)酵液液1.0ml于15ml刻度試管中，加DNS試劑2.0ml，沸水煮沸2min，冷卻后用水補足到15ml刻度，在540nm波長下測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖mg/ml數(shù)。求出樣品中糖含量四、發(fā)酵液中總糖含量的測定（方法與還原糖的測定方法相同）實驗?zāi)康模菏炀氄莆瞻l(fā)酵液中總糖含量的測定方法。實驗原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內(nèi)，還原糖

7、的量與光吸收值呈線性關(guān)系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。實驗器材：發(fā)酵液（5天）：赤霉素發(fā)酵液（GA） 3，5-二硝基水楊酸（DNS），氫氧化鈉，苯酚，亞硫酸鈉，酒石酸鉀鈉，葡萄糖，蒸餾水 可見分光光度計，電子天平，真空干燥箱，數(shù)顯恒溫水浴鍋，離心機(jī)，移液器，槍頭，500ML容量瓶，試管，500 ml 燒杯，1000ml量筒實驗步驟：1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在實驗三中葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線已經(jīng)做出，所以不必再做。2、樣品中總糖的提取： 每隔一段時間精確稱取適量發(fā)酵液，置于50 ml三角瓶中，加水15 m1，鹽酸10ml，沸水浴20min，定容至100ml，得提取液。取10ml濾液定容至100ml3、

8、總糖含量的測定：取提取液1.0ml于15ml刻度試管中，加DNS試劑2.0ml，沸水煮沸2min，冷卻后用水補足到15ml刻度，在540nm波長下測定吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出葡萄糖mg/ml數(shù)。求出樣品中糖含量五、發(fā)酵液中氨基酸含量的測定實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)茚三酮顯色法測定氨基酸含量的方法。實驗原理茚三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。氨與茚三酮和還原性茚三酮反應(yīng)，生成紫色化合物。該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，可通過測定570nm處的光密度，測定氨基酸的含量.實驗器材：1、標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：配制成0.3mmol/L溶液；2、PH5.4，2mol/L醋酸緩沖液：量取86mL 2mol/L醋酸鈉溶液，加

9、入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH檢查校正；3、茚三酮顯色液：稱取85mg茚三酮和15mg還原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解；4、60乙醇；5、樣品液：每毫升含0.550g氨基酸；6、分光光度計；7、水浴鍋。實驗步驟：1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別取0.3mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于試管中，用水補足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液；再加入1mL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100水浴中加熱15min，用自來水冷卻。放置5min后，加入3mL 60乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計測定OD570nm。（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，應(yīng)測定OD440nm）。 以O(shè)D570nm為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2氨基酸樣品的測定 取樣品液