成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21的代謝活動(dòng)需要βKlotho

1、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21 的代謝活動(dòng)需要 Klotho成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（ FGF21 ）是一種由肝臟合成的內(nèi)分泌因子，具有促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的功能。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21的活動(dòng)取決于Klotho 一種單次跨膜蛋白，這種蛋白的表達(dá)在前成脂肪細(xì)胞分化到脂肪細(xì)胞的過程中逐漸減少。Klotho蛋白與FGF 受體1c 和 4 相互作用，從而增強(qiáng)FGF 受體結(jié)合FGF21 的能力，進(jìn)而激活MAPK級(jí)聯(lián)。以 siRNA敲除脂肪細(xì)胞的Klotho 基因，可以使FGF21 誘導(dǎo)的葡萄糖攝取量減少。重要的是，給小鼠 FGF21 可以誘導(dǎo)白色脂肪組織內(nèi)的MAP 激酶途徑磷酸化，而失去Klotho表達(dá)的組織內(nèi)則

2、不會(huì)發(fā)生這種變化。因此，Klotho作為一種輔助因子，在FGF21 的功能中有著關(guān)鍵性的作用。關(guān)鍵詞Klotho |葡萄糖|脂肪細(xì)胞|葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 21（ FGF21）的識(shí)別，源于它與其他 FGF 具有同系環(huán)狀 DNA 序列。種系發(fā)生學(xué)以及結(jié)構(gòu)學(xué)的分析，將 FGF21 歸類為 FGF19 亞科，這一亞科由 FGF15（人類 FGF19 的小鼠直向同源物） ， FGF19， FGF21 和 FGF23 組成。 FGF19 亞科內(nèi)的生長(zhǎng)因子與其他 15 種 FGF 的區(qū)別之處在于， 前者以內(nèi)分泌的方式實(shí)現(xiàn)生物作用。FGF23 主要由骨組織分泌并作用于腎臟從而抑制磷酸鹽的重吸收和

3、維生素D 的生物合成。 FGF15 由腸粘膜上皮表達(dá)并參與肝臟中膽汁酸合成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。FGF21最主要的表達(dá)部位在肝臟，且已經(jīng)在一項(xiàng)針對(duì)具有治療糖尿病潛力的新因子的研究中顯現(xiàn)出了作為脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖的代謝性調(diào)節(jié)劑的作用。事實(shí)上，無論是給肥胖的小鼠還是已經(jīng)患有糖尿病的小鼠使用重組FGF21，都能降低其血糖水平。此外，過度表達(dá)FGF21 的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為低血糖，對(duì)胰島素敏感以及能夠抵抗由飲食誘導(dǎo)的肥胖。FGF21 可以活化 FGF 受體（ FGFRs）并向下游分子傳遞信號(hào)， 包括脂肪細(xì)胞中的 FGFR底物 2（ FRS2）以及 44/42MAP激酶（ ERK1/2 ）。然而，旨于論證FGF

4、受體與 FGF21之間的直接相互作用關(guān)系的試驗(yàn)都以失敗告終。另外，包括3T3-L1 前成脂肪細(xì)胞在內(nèi)的許多種非脂肪細(xì)胞的細(xì)胞類型，盡管它們表達(dá)多種亞型的FGF 受體，但對(duì) FGF21 卻沒有反應(yīng)。此外，過度表達(dá) FGF 受體的 BaF3 細(xì)胞需要高于藥理學(xué)劑量的FGF21（ 200-800nM ）才能產(chǎn)生可檢測(cè)到的促有絲分裂作用。這些觀察結(jié)論說明，在脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)GF21 可能需要輔助因子來完成 FGF 信號(hào)傳遞的激活。我們同其他人一起鑒定了Klotho ，一種單次跨膜蛋白質(zhì)，在FGF23 活化的 FGF23 信號(hào)傳遞過程中是一個(gè)起關(guān)鍵作用的輔助因子。Klotho 最初是作為一種基因突變?cè)陲@現(xiàn)

5、出與人類過早老化綜合征相似表型的Klotho 小鼠中得以被識(shí)別。通過對(duì)缺乏Klotho 蛋白的小鼠與敲除 FGF23 基因的小鼠的觀察，發(fā)現(xiàn)了較多的表型重疊，這說明，Klotho 和 FGF23 可能是通過共同的信號(hào)轉(zhuǎn)到通路實(shí)現(xiàn)作用。確實(shí)，在許多種人工培養(yǎng)的細(xì)胞中，Klotho 蛋白與 FGF受體相互錨定并在 FGF23 結(jié)合 FGF 受體及激活 FGF 信號(hào)傳出中發(fā)揮必要的作用。 在本次試驗(yàn)中，我們的目的是展示作為Klotho 蛋白家族一員的Klotho ，在 FGF21 的信號(hào)傳出中起著輔助因子的作用。結(jié)果和討論FGF21 需要 Klotho來激活 FGF 的信號(hào)傳遞。 FGF21 和傳遞

6、信號(hào)這一事實(shí)已經(jīng)由其對(duì)磷酸化的FRS2 和 ERK1/2FGF23 都不能在親代的293 細(xì)胞中缺乏感應(yīng)這一現(xiàn)象所證實(shí)（圖1）。我們之前曾報(bào)道過異位的過度表達(dá)的Klotho 可以引起293 細(xì)胞對(duì) FGF23 的反應(yīng)。然而，這些過度表達(dá)Klotho 的細(xì)胞并不對(duì)FGF21 的刺激產(chǎn)生反應(yīng)。相比之下，表達(dá)相關(guān)Klotho 蛋白的 293 細(xì)胞獲得了對(duì)FGF21 刺激的反應(yīng)能力 （圖 1）。我們發(fā)現(xiàn)， Klotho 蛋白通過與FGF23及 FGF 受體形成三元復(fù)合體來促進(jìn)FGF23 的信號(hào)傳遞。因此，我們檢測(cè)了是否在FGF21的信號(hào)傳遞中，Klotho 也是通過形成三元復(fù)合體而發(fā)揮類似的作用。圖

7、1圖 1：FGF21 的信號(hào)傳遞需要 Klotho 。分別將 Klotho 和 Klotho 的模擬載體（假載體）或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入 293 細(xì)胞，隨后給予其刺激，刺激物為賦形劑（對(duì)照）或300ng/ml重組人FGF21 或 300ng/mlFGF23 ，作用時(shí)間為10 分鐘。細(xì)胞溶解產(chǎn)物經(jīng)過處理分別與磷酸化的FRS2抗體，磷酸化的ERK1/2 抗體，完全 ERK1/2抗體， Klotho 抗體或 Klotho 抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)。 Klotho與 多 種FGF（FGFR1-FGFR4 ）。典型的受體結(jié)合。哺乳動(dòng)物的FGF受體由四種不同的基因編碼FGF 受體的胞外域由三種免疫球蛋白樣的區(qū)域組成

8、（D1-D3 ）。FGFR1-3 中 D3 可以經(jīng)由一種主要替代性mRNA 剪接事件產(chǎn)生“b”和“ c”兩種亞型，這兩種亞型可分別結(jié)合不同的FGF。另一種額外的剪接活動(dòng)可以產(chǎn)生缺乏D1 和 /或 D1-D2 銜接物的較短的FGFR1-3 亞型。我們簡(jiǎn)要描述了不同的FGF 受體亞型（見圖2）和 293 細(xì)胞的 Klotho 及其共免疫沉淀反應(yīng)試驗(yàn)。如圖2 所示， FGFR1c 和 FGFR4 可以比其他FGF 受體更有效的使Klotho發(fā)生沉淀。相比之下，F(xiàn)GFRb 亞型并沒能在試驗(yàn)條件下使Klotho沉淀。 Klotho 與 FGFR1c 亞型以及FGFR4 的結(jié)合優(yōu)勢(shì)使人聯(lián)想到Klotho

9、蛋白。圖 2圖 2： Klotho可與多種FGF 受體結(jié)合。轉(zhuǎn)染了Klotho表達(dá)載體的293 細(xì)胞的溶解產(chǎn)物同V5單抗元決定簇標(biāo)記的FGF 受體亞型與抗V5抗體共同溫育，經(jīng)過免疫沉淀的蛋白質(zhì)根據(jù)Klotho （兩端）的出現(xiàn)或FGF 受體的出現(xiàn)（中間）進(jìn)行分析。用于免疫沉淀（i.p.）及免疫印跡（i.b.）試驗(yàn)的抗體已在圖中標(biāo)示。用于此次試驗(yàn)的FGF 受體亞型方案已在結(jié)果項(xiàng)的上面給出。FGFR1-3 的 b 亞型和c 亞型之間的不同之處在于第三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（D3 ）的 C 末端，在圖中分別以陰影條和黑色條表示。另一個(gè)選擇性的剪接事件發(fā)生在第一個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域（D1 ）和“ acid

10、ic box ”之中，產(chǎn)生了FGFR1 和 FGFR2的長(zhǎng)（ L ）、中（M ）、短（ S）亞型。每一個(gè)細(xì)胞溶解產(chǎn)物樣本中的一部分都在經(jīng)過處理后與抗Klotho抗體進(jìn)行了免疫印跡試驗(yàn)，從而確認(rèn)在這些細(xì)胞樣本中Klotho表達(dá)的一致性。同 Klotho與FGFR1c和4 強(qiáng)烈相互作用相一致的是，Klotho-FGFR1c以及Klotho-FGFR4 復(fù)合體都能夠比單獨(dú)的FGFR 和其他種類的Klotho-GFGR 復(fù)合物更有效的使 FGF21 發(fā)生沉淀， 這些都說明， FGF21 與其同源受體的穩(wěn)定結(jié)合需要Klotho 的參與（圖3）。圖 3圖 3：FGF21 優(yōu)先與Klotho-FGFR復(fù)合物

11、結(jié)合。將單獨(dú)轉(zhuǎn)染了FGFR 或聯(lián)合轉(zhuǎn)染了FGFR 與 Klotho的293 細(xì)胞溶解， 載有抗V5抗體的瓊脂糖小球使細(xì)胞溶解物中的FGFR 或 Klotho-FGFR復(fù)合物發(fā)生免疫沉淀。隨后將瓊脂糖珠同經(jīng)過調(diào)配的包含F(xiàn)GF21 的培養(yǎng)液共同溫育，在生成瓊脂糖小球蛋白復(fù)合物之后，根據(jù) Klotho 或 FGF21 或 FGF 受體的出現(xiàn)進(jìn)行免疫印跡分析試驗(yàn)。每一個(gè)細(xì)胞的溶解產(chǎn)物樣本中的一部分都在經(jīng)過處理后與抗Klotho 抗體進(jìn)行了免疫印跡分析試驗(yàn)，從而確認(rèn)在這些細(xì)胞樣本中Klotho 表達(dá)的一致性。脂肪細(xì)胞中 FGF21 的作用取決于 Klotho 的表達(dá)。 鑒于 FGF21 只能刺激分化型脂

12、肪細(xì)胞的葡萄糖攝取而對(duì)前成脂肪細(xì)胞沒有刺激作用，我們推斷是由分化型的脂肪細(xì)胞表達(dá)Klotho ，而不是前成脂肪細(xì)胞。確實(shí)，我們沒能在前成脂肪細(xì)胞中檢測(cè)到Klotho的表達(dá)，此外， FGF21 也無法在這些前成脂肪細(xì)胞中引出信號(hào)傳遞。然而，分化型的脂肪細(xì)胞可以大量表達(dá) Klotho 并對(duì) FGF21 的刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng)（圖4A ）。為了進(jìn)一步證實(shí) FGF21 的作用對(duì) Klotho 的依賴性， 我們?cè)谇俺芍炯?xì)胞分化為脂肪細(xì)胞的過程中，持續(xù)監(jiān)測(cè) Klotho的表達(dá)。最早在第四天即可檢測(cè)到Klotho的表達(dá)并持續(xù)增加直到第十天。這種短暫的Klotho 表達(dá)增加與 FGF21 誘導(dǎo) FRS2和 ER

13、K1/2 磷酸化的能力相關(guān)（圖4B ）。我們同樣研究了 FGF21 誘導(dǎo)的 FRS2和 ERK1/2 磷酸化的時(shí)間和劑量反應(yīng)性。如圖4C 所示， FRS2和 ERK1/2 分別在 3 分鐘和 5 分鐘時(shí)出現(xiàn)明顯的磷酸化，并在細(xì)胞接受刺激之后約60 分鐘時(shí)開始下降。 FGF21 信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化在FGF21 濃度為 10ng/ml（ 0.3nM ）時(shí)始可被檢測(cè)到，在濃度為 1000ng/ml （ 30nM ）時(shí)達(dá)到飽和。最后，我們展示了在分化型的脂肪細(xì)胞中，內(nèi)源性的 Klotho 可以使內(nèi)源性的FGFR1c發(fā)生沉淀（圖 4D ），這表明在生理?xiàng)l件下，Klotho 會(huì)同 FGFR1c 生成復(fù)合物

14、。圖 4圖 4：表達(dá) Klotho 的脂肪細(xì)胞可以對(duì) FGF21 的刺激發(fā)生反應(yīng)。（A ）在分化型的3T3-L1 脂肪細(xì)胞中， FGF21可活化 FRS2和 ERK1/2 。以經(jīng)過調(diào)配的含有鼠FGF21 或鼠 FGF23 的培養(yǎng)液刺激 3T3-L1前成脂肪細(xì)胞和分化型脂肪細(xì)胞。 以同等劑量的提取自經(jīng)過模擬載體轉(zhuǎn)染的293 細(xì)胞的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照（對(duì)照組）。以重組 FGF21（ 100ng/ml ）作為陽性對(duì)照。 （B ） Klotho表達(dá)于由前成脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過程中。誘導(dǎo) 3T3-1L 前成脂肪細(xì)胞分化，在分化經(jīng)過如圖中所示的天數(shù)后，以含有FGF21 的調(diào)制培養(yǎng)液刺激這些細(xì)胞 10

15、 分鐘。細(xì)胞溶解產(chǎn)物經(jīng)過處理后同圖中所示抗體分別進(jìn)行免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)。（C） FGF21 介導(dǎo)的3T3-L1 脂肪細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的劑量依賴性和時(shí)程。以遞增劑量的重組人FGF21 刺激分化型3T3-L1 脂肪細(xì)胞10 分鐘（左）或以 1 g/ml 的重組人 FGF21 按不同時(shí)長(zhǎng)刺激分化型3T3-L1 脂肪細(xì)胞（右） 。相應(yīng)的細(xì)胞溶解產(chǎn)物以如圖所示的抗體進(jìn)行免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)。（ D）脂肪細(xì)胞中，內(nèi)源性 Klotho與 FGFR1c 形成復(fù)合物。3T3-L1 脂肪細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物同抗 FGFR1 抗體或正常 IgG 進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng) （ i.p. ），隨后與抗 Klotho 抗體或抗 FGFR1 抗體

16、進(jìn)行免疫印跡分析試驗(yàn)（ i.b. ）。經(jīng)過預(yù)處理的分化型 3T3-L1 脂肪細(xì)胞（上部，代表輸入量的5%）或轉(zhuǎn)染了FGFR1c（ L ）和 FGFR1c（ S）的293 細(xì)胞（下部，作為這些受體的大小標(biāo)準(zhǔn)參照物）的溶胞產(chǎn)物分別被直接用于免疫印跡分析從而證實(shí) Klotho 和 FGFR1c 的存在。為了提供更強(qiáng)有力的證據(jù)證明 FGF21 信號(hào)傳遞對(duì) Klotho 的依賴性，我們使用 siRNA 敲除了分化型脂肪細(xì)胞中的 Klotho 表達(dá)。分別針對(duì) Klotho 基因中不同序列的四種不同的 siRNA 都可以抑制 FGF21 對(duì) FRS2和 ERK1/2 的活化作用（圖 5A ），更重要的是，可

17、以使 FGF21 失去促進(jìn)葡萄糖攝取的作用， 這表明 Klotho 在 FGF21 發(fā)揮其對(duì)脂肪細(xì)胞的代謝性作用時(shí)起著關(guān)鍵性的作用（圖5B ）。FGF21 誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖伴隨著葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1 （ GLUT1 ）的上調(diào)，已知GLUT1 的作用是調(diào)節(jié)胰島素依賴的葡萄糖攝取，但FGF21 并不能使GLUT4 上調(diào)， GLUT4的主要功能亦是促進(jìn)胰島素依賴的葡萄糖攝取。所以，我們檢測(cè)了GLUT1 和 GLUT4 蛋白水平，并發(fā)現(xiàn)以 siRNA 敲除了 Klotho 表達(dá)后， FGF21 促進(jìn) GLUT1 表達(dá)的能力也被減弱（圖 5C）。因此， FGF21-Klotho 復(fù)合體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞可

18、能是脂肪細(xì)胞中胰島素依賴的葡萄糖攝取的重要調(diào)節(jié)因子。圖 5圖 5： FGF21 需要Klotho借以激活脂肪細(xì)胞中的FGF 信號(hào)傳遞，增加葡萄糖攝取，增加GLUT1 的表達(dá)。（ A ）分化型 3T3-L1 脂肪細(xì)胞分別被轉(zhuǎn)染了針對(duì)四種Klotho（ Klotho1-4 ）的 siRNA 或與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的對(duì)照性siRNA （對(duì)照 1,2）；轉(zhuǎn)染兩天后，以重組人FGF21，F(xiàn)GF1或賦形劑刺激細(xì)胞10 分鐘。溶胞產(chǎn)物與圖中所示的抗體進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)（i.b.）。（ B）將試驗(yàn) A 中所示的轉(zhuǎn)染了Klotho 或?qū)φ?siRNA 的分化型3T3-L1 脂肪細(xì)胞分別與重組人FGF21或賦形劑共同溫育18

19、 小時(shí)后，檢測(cè)其葡萄糖攝取情況。結(jié)果以黑白SD誤差條形圖顯示（ n=3 ）。 * ，由學(xué)生檢測(cè)p<0.001。（C） GLUT1 和 GLUT4 的表達(dá)情況由使用B 試驗(yàn)中的溶胞產(chǎn)物經(jīng)免疫印跡分析而檢測(cè)。胰島素的促葡萄糖攝取作用遠(yuǎn)強(qiáng)于FGF21 對(duì) 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的作用 （相關(guān)數(shù)據(jù)并未在此給出）。然而，這一發(fā)現(xiàn)可能并不一定意味著FGF21 對(duì)于糖代謝的影響并不具有重要意義。FGF21 對(duì)于葡萄糖攝取的促進(jìn)作用在刺激開始后的幾小時(shí)后即十分明顯，即便FGF21 誘導(dǎo)的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的蛋白激酶磷酸化在 30 分鐘內(nèi)即開始減少，其促進(jìn)糖攝取的作用卻可持續(xù) 24 小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。

20、相比之下，胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取在刺激后的幾分鐘內(nèi)即有十分明顯的增加并在幾小時(shí)內(nèi)減弱。 FGF21 的延長(zhǎng)效應(yīng)可能在生理?xiàng)l件下影響著糖代謝。事實(shí)上， 當(dāng) FGF21 被輸入患有糖尿病或肥胖的小鼠體內(nèi)后， 可以發(fā)揮持久有力的降血糖作用。這些觀察結(jié)果表明 FGF 21 和胰島素在糖代謝的調(diào)控中分別起著不同的作用： FGF21 主要通過上調(diào) GLUT1 的表達(dá)從而誘導(dǎo)出中等程度的持久的葡萄糖攝取增加，然而胰島素是通過促進(jìn) GLUT4 經(jīng)由胞內(nèi)池向細(xì)胞質(zhì)膜移位而誘導(dǎo)出一種強(qiáng)效的短暫的葡萄糖攝取增加。為了判斷在活體環(huán)境下FGF21 信號(hào)傳遞對(duì) Klotho 的依賴性，我們向小鼠體內(nèi)注入FGF21 并分析

21、白色脂肪組織（ WAT ），骨骼肌和腎臟中 ERK1/2的磷酸化情況。重要的是，Klotho 只在白色脂肪組織中表達(dá)， 而不在骨骼肌和腎臟中表達(dá)（圖 6A ）。與 Klotho 的表達(dá)模式相一致的是， FGF21 誘導(dǎo)的 TRK1/2 磷酸化也僅存在于白色脂肪組織中（圖6B ）。作為對(duì)照組，注入小鼠體內(nèi)的FGF23 只能刺激腎臟內(nèi)的 ERK1/2 磷酸化，腎臟中表達(dá)的是 Klotho（圖 6C）。這些數(shù)據(jù)分別為FGF21 和 FGF23 介導(dǎo)的組織反應(yīng)對(duì)Klotho 和 Klotho 的依賴性提供了強(qiáng)有力的活體證據(jù)。圖6圖 6：FGF 21 激活小鼠白色脂肪組織中的 FGF 信號(hào)傳遞。（ A

22、）兩種野生型小鼠后肢肌肉（肌肉），生殖腺周圍脂肪墊（白色脂肪組織）和腎臟的 Klotho 和 Klotho 表達(dá)經(jīng)由免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。 （ B ）給小鼠注入重組人 FGF21（ n=2 ）或賦形劑（ n=2），后切除其肌肉，脂肪和腎臟組織。溶組織產(chǎn)物同圖中所示抗體進(jìn)行免疫印跡分析。 （C）步驟同 B，不同之處在于將FGF21 替換為 FGF23.Klotho基因家族調(diào)控著FGF 激素的代謝活動(dòng)。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中， 我們展示了脂肪細(xì)胞中表達(dá)的 Klotho 可使 FGF21 具有結(jié)合并活化其同源的FGF 受體的能力， 從而導(dǎo)致葡萄糖攝取的增加。 FGF21 對(duì) Klotho 的這種依賴性代表

23、著FGF21 對(duì)脂肪組織特有的作用機(jī)制。同樣地，我們以及其他科學(xué)家也證實(shí)了Klotho 可以使 FGF23 具有結(jié)合并活化其同源FGF 受體的能力。 Klotho 基于和 Klotho 具有同源性的環(huán)狀DNA 序列而得以被分離。Klotho 基因編碼的是一種與Klotho 蛋白有41%的相似性氨基酸序列的單跨膜蛋白，并且除外在脂肪組織中表達(dá)外，此種蛋白還在肝臟和胰腺內(nèi)表達(dá)。 缺乏 Klotho 的小鼠與缺乏 FGF15 或 FGFR4 的小鼠在表型上具有重疊性。 這些表型包括膽汁酸合成增加和肝臟中兩種關(guān)鍵性的膽汁酸合酶（ CYP7A1 和 CYP8B1 ）的表達(dá)增加?；谶@些基因?qū)W上的數(shù)據(jù)以及

24、主要針對(duì)于肝細(xì)胞的一些研究，一個(gè)關(guān)于 FGF15/FGF19 如何與 FGFR4 和 Klotho 協(xié)同對(duì)膽汁酸合成進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)的模型已經(jīng)顯現(xiàn)。因此，Klotho 在 FGF19/15 的信號(hào)傳遞過程中也起著輔助因子作用這一看法似乎是有道理的?？傊?Klotho 基因家族可能已經(jīng)進(jìn)化至對(duì)FGF19 亞科的成員具有組織特異性的生物活性。需要關(guān)于Klotho 和 Klotho 的進(jìn)一步研究以提供關(guān)于FGF19 亞科對(duì)糖代謝，膽汁酸合成及磷酸鹽 /維生素 D 代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的更多認(rèn)識(shí)。FGF21 和 FGF23 可能在諸如糖尿病，肥胖， 慢性腎病， 骨骼疾病等人類疾病中作為病理性因素而發(fā)生作用

25、。在探索以這些內(nèi)分泌的 FGF 為治療手段的科研活動(dòng)中， Klotho 和 Klotho 將成為重要的研究對(duì)象。材料和方法表達(dá)載體。 帶有 C 末端 V5 單抗原決定簇標(biāo)記物的FGF 受體表達(dá)載體和鼠FGF23（R179Q）表達(dá)載體前已述及。鼠 Klotho 環(huán)狀 DNA 由 3T3-L1 脂肪細(xì)胞中的mRNA 反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)PCR擴(kuò)增而來。 編碼鼠 FGF21 或鼠 Klotho 的環(huán)狀 DNA 被克隆為pEF 1 表達(dá)載體。 在亞克隆之前，在 Klotho 的 C 末端加入FLAG 單抗元決定簇標(biāo)記物，并以合成的寡核苷酸和PCR 在其兩端分別加入適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)。 3T3-L1

26、前成脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% 小牛血清的DMEM 中。將細(xì)胞在分化誘導(dǎo)液【 DMEM/10%FBS/10mM Hepes/MEM 非必須氨基酸（ NEAA ） /青霉素 /鏈霉素（ PC/SM ） /2 M 胰島素 /1 M 地塞米松 /0.25mM 3- 異丁基 1-甲基黃嘌呤（ IBMX ）】中培養(yǎng)兩天，隨后在不含地塞米松和 IBMX 的誘導(dǎo)液中再培養(yǎng)兩天，使其向脂肪細(xì)胞分化。其后，每隔兩天更換一次DMEM誘導(dǎo)液，補(bǔ)充10%FBS/10mMHepes/MEM 非必須氨基酸（NEAA ） /青霉素/ 鏈霉素（ PC/SM ）。7 天后， 95%以上的細(xì)胞中可以觀察到脂滴的積聚，實(shí)驗(yàn)中所用的是

27、處于 7-10 天之間的細(xì)胞。FGF21 和 FGF23 的預(yù)處理。 人重組 FGF21 和 FGF23（ R179Q）由埃希氏大腸桿菌表達(dá)，隨后在體外環(huán)境進(jìn)行再折疊，并按照我們之前曾發(fā)表的原始記錄，根據(jù)親和力，離子交換，分子篩，色譜分析法對(duì)其進(jìn)行純化。含有鼠FGF21 但不含血清的條件培養(yǎng)液收集自轉(zhuǎn)染了FGF21 表達(dá)載體的 293 細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液中FGF21 活性的檢測(cè)是通過對(duì)比其誘導(dǎo)分化型3T3-L1 脂肪細(xì)胞內(nèi) ERK1/2 磷酸化的能力與已知的濃集的重組人FGF21 的誘導(dǎo)能力而實(shí)現(xiàn)的。培養(yǎng)液中鼠FGF23（ R179Q）的活性是通過前已述及的穩(wěn)定表達(dá)Klotho 的 293 細(xì)胞

28、來檢測(cè)的。分別與2000ng/ml（ 67nM）重組人 FGF21 和 300ng/ml（ 10nM）FGF23 具有同等活性的調(diào)制培養(yǎng)液被用于刺激培養(yǎng)中的細(xì)胞。同等劑量的來自于轉(zhuǎn)染了假性載體的293 細(xì)胞的不含血清的調(diào)制培養(yǎng)液用作陰性對(duì)照。免疫沉淀和免疫印跡。 試驗(yàn)開始前36 小時(shí)，使用脂質(zhì)體作為運(yùn)載體將表達(dá)Klotho 和 Klotho基因轉(zhuǎn)染至未融合的293 細(xì)胞。將細(xì)胞溶解于含有前已述及的磷酸化抑制劑和蛋白酶的緩沖劑中。在保留每份細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的一部分用以同抗Klotho 抗體進(jìn)行免疫印跡后， 其余的溶胞產(chǎn)物與抗 V5 瓊脂糖小球在 4下共同溫育3 小時(shí)。以含有 1%Triton X-

29、100 （ TBST ）的緩沖液沖洗瓊脂糖小球四次；以 Laemmli 緩沖液洗脫球結(jié)合蛋白， 經(jīng)過電泳， 轉(zhuǎn)移至 HybondC Extra 薄膜上。將這些蛋白同抗Klotho 抗體或抗V5 抗體共同溫育，隨后加入共軛辣根過氧化物酶抗山羊IgG 或抗鼠 IgG ?；瘜W(xué)熒光信號(hào)由SuperSignal West Dura 系統(tǒng)而來。為了檢測(cè)分化型 3T3-L1脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性 Klotho 和 FGFR1c 的相互作用，將溶胞產(chǎn)物樣本同抗 FGFR1c 抗體和 G-瓊脂糖蛋白在 4共同溫育2 小時(shí)。以完全性裂解緩沖液沖洗瓊脂糖小球 4 次，隨后以不含 Triton X-100的裂解緩沖液沖洗兩

30、次。 球結(jié)合蛋白由Laemmli 緩沖液洗脫并同抗 Klotho 抗體和抗 FGFR1c 抗體進(jìn)行免疫印跡分析試驗(yàn)。FGF21 沉淀試驗(yàn)。 單獨(dú)轉(zhuǎn)染 FGFR 和同時(shí)轉(zhuǎn)染了FGFR 和 Klotho 的 293 細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物樣本與抗 V5 瓊脂糖共同在4溫育 3 小時(shí)。以 TBST 沖洗瓊脂糖小球四次后與含有鼠FGF21但不含血清的培養(yǎng)液中于4 攝氏度共育3 小時(shí)。隨后，以含有1%Triton X-100 的Krebs-Ringer-Hepes 緩沖液（ 118 mM NaCl/4.96mM KCl/2.54 mM CaCl 2/1.19 mMKH 2PO4/1.19 mM MgSO 4 /

31、20 mM Hepes, pH7.4 ）洗球 3次，再以不含 Triton X-100 的上述緩沖液洗球 3 次。以 Laemmli 緩沖液洗脫球結(jié)合蛋白并同抗V5 抗體，抗 Klotho 抗體或抗鼠 FGF21抗體進(jìn)行免疫印跡分析試驗(yàn)。FGF信號(hào)傳遞的免疫印跡分析。多井盤中培養(yǎng)的細(xì)胞在剝奪血清培養(yǎng)一晚之后分別以人重組 FGF21 或 FGF23（ R179Q）或 FGF1 作用 10 分鐘。將細(xì)胞用液氮速凍后以如前所述的抗磷酸 -FRS2抗體，抗磷酸 -44/42MAP 激酶（ ERK1/2 ）抗體和抗 ERK 抗體處理進(jìn)行免疫印跡分析。向 8 周大的自交繁殖的雄性野生型129sv 小鼠下腔

32、靜脈內(nèi)注射人重組FGF21（ 0.3 g/g 鼠體重）或 FGF23（ R179Q，0.1 g/g 鼠體重） 或賦形劑 （ 10 mM Hepes ，pH 7.4/150 mMNaCl ）。在蛋白注射后15,17,19 分鐘，分別切除生殖腺周圍脂肪墊，腎臟和后肢肌肉。切除的組織經(jīng)液氮速凍后與抗-磷酸 -ERK ，抗 -ERK 和抗 -肌動(dòng)蛋白抗體行免疫印跡分析。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)德克薩斯州達(dá)拉斯西南大學(xué)醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)和科研顧問委員會(huì)批準(zhǔn)。以 RNA 敲除 Klotho基因。 如前所述，以電穿孔法將復(fù)式siRNA 轉(zhuǎn)染至 3T3-L1 脂肪細(xì)胞中。簡(jiǎn)言之，以0.5mg/ml 膠原蛋白酶作用于分化型3T3-L1脂肪細(xì)胞， PBS 洗滌兩次，并使其懸浮于 PBS中（ 2× 107/ml ）。將這些細(xì)胞與濃度為5