補(bǔ)體C1抑制劑探究進(jìn)展

1、補(bǔ)體cl抑制劑探究進(jìn)展摘要補(bǔ)體cl抑制劑(cl inhibitor,c1inh)是絲 氨酸蛋白酶抑制劑( serine protease inhibitors, serpins)"家族"的成員之一，對補(bǔ)體，凝血、纖溶、激 肽釋放等蛋白酶激活系統(tǒng)有重要的抑制功能。clinh通過其 分子表面的反應(yīng)中心環(huán)與靶酶的活性中心結(jié)合形成共價(jià)復(fù) 合物從而達(dá)到抑制靶酶活性的作用。clinh的遺傳基因位于 11號常染色體的pll.2-ql3,遺傳基因中的部分缺失、插入, 以及單一堿基對的替代，都將導(dǎo)致血漿clinh水平低下或功 能異常。clinh的遺傳性或獲得性缺乏與血管神經(jīng)性水腫有 著密切的

2、關(guān)系。clinh濃縮制劑對遺傳性或獲得性clinh 水平低下患者有治療作用。關(guān)鍵詞：補(bǔ)體cl抑制劑絲氨酸蛋白酶抑制劑遺傳性 血管神經(jīng)性水腫獲得性血管神經(jīng)性水腫1 c1inh的分子結(jié)構(gòu)及生理功能補(bǔ)體cl抑制劑(cl inhibitor,clinh)是血漿中重 要的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpins)家族成員之一，具有 抑制多種絲氨酸內(nèi)肽酶的活性，與補(bǔ)體、凝血、纖溶和激肽 釋放的活化與拮抗平衡有密切的聯(lián)系1。clinh是血漿補(bǔ) 體成分cl的唯一抑制劑，通過抑制活化補(bǔ)體成分cl的酯 酶活性調(diào)節(jié)補(bǔ)體活化途徑；它也是fxii a的主要滅活劑， 占血漿f xii a抑制活性的90%；它可抑制血漿中50%的

3、激 肽釋放酶活性；clinh亦能抑制纖維蛋白溶解酶的活性，從 而對纖溶平衡具有調(diào)節(jié)作用2 oclinh為單肽鏈糖蛋白，由478個(gè)氨基酸殘基組成。肽鏈的63-97重復(fù)出現(xiàn)四肽順序glx-pro-thr-thr及其變異 結(jié)構(gòu)glx-pro-thr,重復(fù)次數(shù)高達(dá)7次。肽鏈內(nèi)有兩對二硫 鍵，分別為 cyslol-cys406、cysl08-cysl83o clinh 高度 糖基化，糖含量約占分子總量的33%35%。肽鏈上連接有約 20個(gè)側(cè)糖鏈，大多數(shù)糖基（可能是17個(gè)）位于肽鏈的n- 末端1-120肽段內(nèi)，側(cè)糖鏈中有6個(gè)葡萄糖胺基連接（n- 糖胺鍵）。至少有5個(gè)半乳糖胺基連接（o-糖胺鍵），分別 連接

4、于 thr26、ser42、thr66、thr70. thr74o 其它可 能被糖基化的氨基酸殘基為thr77、 thr84、 thr85、 thr89、thr93、thr96、thr97o 完整的 clinh 分子量為 104kda,等電點(diǎn)為ph2. 72. 8。血漿中clinh的含量約為 2u mole/l（約 220mg/l） 1。clinh主要是在肝臟合成，纖維母細(xì)胞、單核細(xì)胞、 巨核細(xì)胞等多種肝外細(xì)胞具有合成clinh的能力。纖維母細(xì) 胞合成clinh的能力比單核細(xì)胞的能力大3050倍， inf-丫、 inf-b2、tnf等細(xì)胞因子能促進(jìn)clinh的合成 3oclinh屬serpin

5、s家族中的一員，與其它serpins成 員如al-抗胰蛋白酶、al-抗胰凝乳蛋白酶、at-iii、hc-ii 等具有不同程度的同源性2, 3 o perkins等4通過中子 散射(neutron scattering)分析，推斷clinh分子由頭- 尾兩結(jié)構(gòu)組成，n-末端的113個(gè)氨基酸殘基組成棒狀尾部 結(jié)構(gòu)區(qū)，它高度糖基化，無serpins功能，推測它可能與防 止cl自身聚集性自激活、以及在與白細(xì)胞表面的結(jié)合等方 面起作用4, 5 o c-末端的365個(gè)殘基組成球狀頭部結(jié)構(gòu) 區(qū)，是serpins同源區(qū)，具有serpins的功能。serpins 同源區(qū)由8個(gè)a -螺旋結(jié)構(gòu)、3個(gè)b-折疊結(jié)構(gòu)、1

6、個(gè)反應(yīng) 中心環(huán)(reactive central loop,rcl)以及部分其它無規(guī)則結(jié)構(gòu)組成。clinhr的rcl為a-b -折疊結(jié)構(gòu)的第5肽段(s5a)與c-b-折疊結(jié)構(gòu)第1肽段(slc)間的連接肽， 在clinh分子表面向外伸展形成一個(gè)可折疊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。rcl長度約為20個(gè)氨基酸殘基，具有cl-底物結(jié)構(gòu)的相同特 征，包括氨基酸順序、酶反應(yīng)中心連接特征、柔韌性等，其空間結(jié)構(gòu)與靶酶活性中心的空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)4, 5 oclinh的反應(yīng)中心為肽鏈第444-445位的arg-thr, 位于rcl中。在靶酶抑制過程中，反應(yīng)中心的pl （ arg444） 被靶酶識別、捕獲，形成靶酶-抑制劑1: 1結(jié)合的

7、共價(jià)復(fù)合 物，clinh的arg444-thr445乙酰鍵被裂解，從c-末端裂 解下一個(gè)分子量為4kda的34個(gè)氨基酸殘基的小肽段，肽鍵 斷裂后在pl位產(chǎn)生的新竣基將靶酶反應(yīng)中心的ser乙酰 化，形成共價(jià)復(fù)合物，從而直到抑制酶活性的作用5。2 c1inh的分子遺傳學(xué)特征和變異clinh基因位于第11號染色體的pll. 2-ql3o據(jù)推斷, clinh基因全長至少16kb,由8個(gè)外顯子（exon）和7個(gè) 內(nèi)含子（intron）組成6。clinh遺傳缺陷表現(xiàn)為基因的 微小缺失、插入或有限堿基替換，或其它基因的缺陷導(dǎo)致血 漿中clinh被不正常地加工和修飾715。在hae的臨床 診斷中，根據(jù)clin

8、h抗原濃度與活性降低的程度分為i型和 ii型haeo i型hae患者血漿中的clinh抗原含量以及靶 酶抑制活性僅及正常水平的30%50%7為;而ii型hae患 者血漿中具有正常、略低或略髙的clinh抗原含量，但靶酶 抑制活性卻低于正常個(gè)體，在ii型hae患者的血漿中含有功能異常性clinh1015早期對i型hae患者的clinh基因的研究發(fā)現(xiàn)該類 患者有一個(gè)異常短的clinh mrnao采用pcr技術(shù)將患者 clinhmrna放大分析，提示了從異常clinh基因衍生出一個(gè) 較小的160bp dna,相應(yīng)于外顯子vii有核昔酸的丟失。因此 合成了小于正常分子量的clinh7 oernst等8

9、的研究發(fā)現(xiàn)了另一種類型的i型clinh 變異。患者clinh遺傳基因外顯子vid中第1414-1433的20 個(gè)堿基對出現(xiàn)了重復(fù)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了一個(gè)正常的終止密碼子缺 失，產(chǎn)生了一個(gè)比正常clinh多52個(gè)氨基酸殘基的異型 clinho將變異型基因重組到纖維母細(xì)胞中表達(dá)，胞內(nèi)clinh 的肽鏈分子量高達(dá)98kda,明顯高于正常clinh基因在纖維 母細(xì)胞中所表達(dá)的肽鏈分子量(78kda)；而變異型clinh表 達(dá)后分泌發(fā)生降解。ernst等8認(rèn)為這可能起因于異型 clinh的糖基化異常或分泌通道的識別異常導(dǎo)致分泌量減 少。kawachi等9報(bào)道了一類因內(nèi)含子單一堿基替代變異所致i型hae?；颊遚l

10、inh遺傳基因第7內(nèi)含子5-末端鏈接識別位點(diǎn)發(fā)生了 t-a單一堿基替代變異，印跡試驗(yàn)證 明患者具有正常大小的clinh mrna,但量僅及正常個(gè)體量 的50%。變異基因在轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)迅速的降解，導(dǎo)致mrna 的含量降低，引發(fā)血漿clinh水平低下，表現(xiàn)出i型haeoclinh的ii型變異為單一堿基變異，包括堿基替換或 缺失1015。多數(shù)ii變異發(fā)生在clinh的rcl上。編碼rcl氨基 酸順序的密碼子位于clinh基因的外顯子viii,當(dāng)發(fā)生單一 堿基對替代變異后，rcl±的氨基酸順序發(fā)生變異，由于產(chǎn) 生靶酶識別的異?；騝linh-靶酶中間復(fù)合物穩(wěn)定性減弱， 最終導(dǎo)致clinh功能

11、性異常，表現(xiàn)出hae1014。在rcl上的變異中，多數(shù)變異發(fā)生在反應(yīng)中心的pl(arg444)上。編碼arg444的密碼子cgc含有一個(gè)極易 突變的cpg二聚核昔酸，當(dāng)c被t替代后，反應(yīng)中心的 arg444變異為cys,發(fā)生了已被命名的da、 ca、 fe的 clinh變異；當(dāng)g被a替代后，反應(yīng)中心的arg444被his 替代，發(fā)生了 ri. sp型變異；at、 bo、 gu> za等型 的變異皆為類似的變異，arg444分別被his、his、leu、 ser、his替代1012。當(dāng)pl位的arg發(fā)生替代變異后， clinh發(fā)生了靶酶識別異常，cl-抑制功能異常。ocejo-vinyal

12、s等13報(bào)道了 一個(gè)ii型hae變異的西 班牙家族，在該家庭中發(fā)現(xiàn)了 pl' ( thr445)的替代變異。 pl'是反應(yīng)中心的另一靶酶識別位點(diǎn)；當(dāng)編碼thr的密碼子 發(fā)生ac的替代變異，thr445被cys所替代，變異后的 clinh由靶酶的抑制劑特性轉(zhuǎn)變成為底物特性，導(dǎo)致血漿 clinh的靶酶抑制活性降低，引發(fā)ii型haeo在鄰近反應(yīng)中心pl ( arg444)的plo、pl2、pl4 位的ala(即肽鏈ala436、ala434、ala432)亦是突變熱 點(diǎn)，對抑制劑-靶酶復(fù)合物的穩(wěn)定性至關(guān)重要。當(dāng)編碼ala 的密碼子突變，ala被glu替代，發(fā)生ma型(ala434f

13、glu)變異和we型(ala432 glu)變異；被thr替代， 發(fā)生 mo 型(ala436 thr)變異和 ca 型(ala436-* thr)變 異14。ala443的替代變異發(fā)現(xiàn)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡 (systemic lupus erythematosus, sle)而未出現(xiàn) hae 的 家族。ala443緊鄰反應(yīng)中心arg444當(dāng)它被val替代后， 大分子氨基酸的側(cè)鏈基因影響到clinh對靶酸的識別， clinh對cl亞組分的抑制活性減弱，因而引發(fā)補(bǔ)體激活-抑 制調(diào)節(jié)失衡的疾病sleo但變異型clinh對fxii a、激肽釋放酶的抑制活性正常，在臨床上未表現(xiàn)出haell, 12ta型c

14、linh變異是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一發(fā)生在rcl以外 氨基酸缺失性變異。由于編碼lys251的密碼子缺失，合成 的ta型clinh的肽鏈結(jié)構(gòu)缺少lys251。因此lys251相鄰 位置的氨基酸順序由asn-lys-ile-ser變異成為 asn-ile-ser,產(chǎn)生了一個(gè)新的糖基化位點(diǎn)。lys251位于 f-a-螺旋與a-b-折疊之間，變異結(jié)構(gòu)通過f-a-螺旋直 接或間接地破壞了 a-b-折疊結(jié)構(gòu)，對形成蛋白酶-抑制劑 穩(wěn)定復(fù)合物產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致酶抑制功能低下15。3 c1inh缺乏相關(guān)性疾病血 管神經(jīng) 性水腫(&amp； nbs p； angioeurotic edema,ae)是因血漿中血

15、管滲透活性增強(qiáng)所致，這與補(bǔ)體系 統(tǒng)或接觸系統(tǒng)的激活產(chǎn)生與血管滲透性有關(guān)的激肽類物質(zhì) 有關(guān)。clinh作為補(bǔ)體組分cl唯一的抑制劑，fxiia的 主要抑制劑，其缺乏將導(dǎo)致補(bǔ)體系統(tǒng)和/或接觸系統(tǒng)活化的 調(diào)節(jié)失衡，使激肽濃度增高，血管滲透性增強(qiáng)，從而表現(xiàn)出 血管神經(jīng)性水腫的臨床癥狀，如體表水腫或粘膜水腫，全身 性任何部位發(fā)生自限性血管性水腫。當(dāng)發(fā)生粘膜水腫時(shí)，三 分之二的病人出現(xiàn)突發(fā)性腹痛、腹脹、嘔吐、不能排氣等腸 梗阻等表現(xiàn)。半數(shù)以上的病人有咽部水腫、吞咽困難、聲嘶、 憋氣。約有80%的病人發(fā)生喉頭水腫窒息而死亡1, 2o遺傳性血管神經(jīng)性水腫(hereditary angioeurotic ede

16、ma,hae)是一種常染色體遺傳病，發(fā)病率約為五萬分之 -o 85%的hae病人屬i型，患者血漿中clinh抗原含量降 低并且酶抑制活性水平降低，約為正常人的30%,甚至更低。 ii型hae患者的血漿clinh抗原含量正常或略高，但靶酶 抑制活性異常或低下1,曠15。獲得性血管神經(jīng)性水腫(acquired angioneurotic edema,aae)是正常clinh遺傳個(gè)體，因某種特定病理生理 過程引起clinh消耗增加所致，其特征為clinh、ch50、 clq、cl、c4以及c2水平均低下。與hae不同的是，aae 病人的clinh代謝正?；蜉p微的升高16遼3。隨著病理診 斷學(xué)的發(fā)展，

17、已根據(jù)診斷特征將aae分為i型和ii型兩大類 型。i型aae與淋巴細(xì)胞增生異常性疾病或其它惡性腫瘤如 淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等有關(guān)，尤其是淋巴瘤17, 18 o此類患者體內(nèi)產(chǎn)生了針對獨(dú)特型(idiotype)抗原的 抗體。抗體識別新生b-細(xì)胞的獨(dú)特型抗原，形成獨(dú)特型抗 原-抗體復(fù)合物。這類抗原抗體復(fù)合物對cl的活化能力比其 它類型的抗原-復(fù)合物對cl的活化能力強(qiáng)，過量的活化c-1 導(dǎo)致clinh的大量消耗，引發(fā)血漿clinh水平低下，從而 使補(bǔ)體激活途徑和/或接觸系統(tǒng)的活化調(diào)節(jié)失衡，引發(fā) aael,1618。donaldson等19發(fā)現(xiàn)了另一種類型的aae病例（ii 型）?；颊哐獫{中產(chǎn)生

18、了針對clinh的自身抗體。他們從這 類aae患者發(fā)病期間的血漿中純化出抗自身clinh抗體并 證明該抗體識別clinh反應(yīng)中心約8個(gè)氨基酸長度的抗原決 定簇。clinh反應(yīng)中心與抗clinh抗體結(jié)合后，clinh不 能與活化的c-1形成穩(wěn)定的復(fù)合物，喪失抑制靶酶的活性， 從而加快了在血漿中的消耗，使血漿中的clinh酶解片段增 加1923。4 c1inh在血管神經(jīng)性水腫治療中的應(yīng)用急性期、威脅生命的hae或aae已成功地采用clinh 制劑靜脈輸注，使血液clinh的水平迅速得到提高，恢復(fù)對 補(bǔ)體活化、接觸系統(tǒng)活化的調(diào)節(jié)功能，以迅速控制hae或 aaeo自80年代初，clinh濃縮制劑應(yīng)用于

19、臨床以來，除1 例長期使用clinh濃縮制劑產(chǎn)生抗clinh抗體外，未見有 其它副作用的報(bào)道2426 o1996年,donaldson等24報(bào)道了用clinh濃縮制 劑治療1例hae伴sle合并抗clinh抗體的病例?；颊呙?周接受21801u的clinh濃縮制劑的靜脈輸注治療，患者的 hae伴sle并發(fā)癥得到良好的控制，在用clinh濃縮制劑8 個(gè)月后，患者產(chǎn)生了對clinh的抗體，方停止使用clinho 在此期間，患者一直未出現(xiàn)其他副作用，身體亦得到良好的 恢復(fù)。在對ii型aae的clinh的補(bǔ)充治療過程中發(fā)現(xiàn),clinh靜脈輸注有加重aae的現(xiàn)象?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用研究證明， 當(dāng)ii型aae患

20、者接受低劑量的clinh的輸注后，由于clinh 被抗clinh抗體中和，產(chǎn)生了更多的抗原-抗體復(fù)合物，激 活cl從而加快了 clinh的消耗，而clinh的低劑量補(bǔ)充又不足以抑制補(bǔ)體激活途徑，因而加重了 ii型aae病癥。ii型 aae患者需要一次性接受更高劑量的clinh的輸注，才能克 服患者血漿中抗clinh抗體對clinh的中和作用。ii型aae 患者所需適當(dāng)劑量可通過體外測定血漿與clinh形成抗原 一抗體復(fù)合物的量來進(jìn)行清除后，clinh水平得到恢復(fù)， cl、c4水平相繼得到提高。早期的clinh濃縮制劑具有一定的傳播病毒性疾病 的可能性，特別是c型肝炎的傳播。隨著病毒滅活方法的成

21、 熟并成功的組合到c1inh的生產(chǎn)工藝中，c1inh濃縮制劑 的使用更加安全可靠26 o參考文獻(xiàn)1 davis aei11. adv exp med biol, 1997；425： 1852 cugno m, cicardi m, bottasso b, etal.blood,1997；89：32133 heda gd, kehoe kj, mahdi f, etal.blood,1996；87：28314 perkins sj, smith kf, amatayakul s, et al. jmol biol,1990；214：7515 wuillemin wa, te velthuis h

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