天然手性小分子分離研究進(jìn)展

1、 綜述題目：天然手性小分子分離研究進(jìn)展 姓名： 吳文凡 學(xué)號： z1415005 科目：天然藥物化學(xué)天然手性小分子分離研究進(jìn)展摘要：綜述了色譜法和石英晶體微天平傳感器技術(shù)在天然手性小分子分離研究的新進(jìn)展，也同時介紹了分離天然手性小分子分離的手性固定相柱的制備，并探討手性分子與手性固定相間識別的方法；也同時對紫外光譜和熒光光譜等在天然手性小分子分離的應(yīng)用進(jìn)行了闡述。關(guān)鍵詞：天然手性小分子；手性固定相；石英晶體微天平傳感器；Abstract: The chromatography and quartz crystal microbalance sensor technology in the ne

2、w progress of the study of natural chiral separation of small molecules, and also describes the preparation of small molecule chiral separation natural separation of chiral stationary phase column, and to explore chiral molecules chiral stationary phase identification method; also for UV and fluores

3、cence spectra of small molecules in natural chiral separation applications are described.Key words: natural chiral small molecules; chiral stationary phase; quartz crystal microbalance sensors; 天然手性小分子是手性分子的一種，其分離方法類似于手性分子，手性是自然界特別是生物體的本質(zhì)屬性，作為生命活動重要基礎(chǔ)的生物大分子和許多作用于受體 的活性物質(zhì)均具有手性特征，如酶、載體、受體、血漿 蛋白和多糖等.對映

4、異構(gòu)體在生物活性、生理活性 和藥理活性等方面存在較大差異甚至可能完全相反 的作用，因此獲得單一的對映異構(gòu)體對生理學(xué)和藥理學(xué)的研究有著非常重要的意義1.近年來，有關(guān)手性識別與分離的技術(shù)發(fā)展迅速，其中色譜法、傳感器法和光譜法等具有適用性好、應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，在分離識別和純化手性化合物中受到研究者的極大關(guān)注。1.色譜法色譜法可滿足各種條件下對映體拆分和測定的要求，能夠快速對手性樣品進(jìn)行定性、定量分析和制備拆分.目前，高效液相色譜、氣相色譜、超臨界流體色譜、模擬移動床色譜和毛細(xì)管電泳等在手性研究中得到了廣泛應(yīng)用.其中，高效液相色譜法 (HPLC )進(jìn)行手性藥物對映體的光學(xué)拆分已成

5、為藥學(xué)研究中的一大熱點(diǎn)，開發(fā)一些新型、具有不對稱中心的手性固定相成為發(fā)展手性色譜技術(shù)的前沿領(lǐng)域之一.在手性固定相材料中，選擇劑和手性分子間形成非對映異構(gòu)體絡(luò)合物，但由于不同對映體分子間存在空間結(jié)構(gòu)的差異，直接影響兩者的結(jié)合和絡(luò)合物的穩(wěn)定性.根據(jù)這些差異有望實(shí)現(xiàn)對手性 底物的拆分2.以環(huán)糊精衍生物、多糖衍生物和蛋白質(zhì)等為手性選擇劑的手性固定相材料備受研究者的關(guān)注，它們對許多手性藥物對映體表現(xiàn)出良好的分離性能，已有許多填充手性固定相的色譜柱實(shí)現(xiàn)商品化，廣泛應(yīng)用在制藥工業(yè)、化學(xué)品和食品等行業(yè)中.下文針對新型環(huán)糊精手性固定相、多糖手性固定 相和蛋白質(zhì)手性分離材料的制備及在拆分手性對映體方面的研究進(jìn)行綜

6、述。1.1環(huán)糊精類手性固定相澤環(huán)糊精由7個葡萄糖單元通過糖苷鍵連接形成，內(nèi)部有一個疏水性手性空腔，可與有機(jī)物、無機(jī)物及生物分子形成主客體包合物.1965年，Solms等3 首先開發(fā)了適用于液相色譜標(biāo)準(zhǔn)粒徑的環(huán)糊精聚合物固定相.通過化學(xué)修飾可改變澤環(huán)糊精的內(nèi)腔深度和氫鍵作用位點(diǎn)，引人靜電作用和n- n作用位點(diǎn)，滿足識別不同類型和結(jié)構(gòu)的底物要求，提高澤環(huán)糊精衍生物的手性識別能力。環(huán)糊精手性固定相在巴比妥酸、阻斷劑、鎮(zhèn)靜安眠劑、抗組胺劑、生物堿、胡蘿卜素、二肽、多肽、氨基酸、芳香醇、黃酮 類等的分析檢測和制備方面得到很好的應(yīng)用4 。目前，研究主要集中在開發(fā)環(huán)糊精與基質(zhì)材料間新型鍵合方式5-6 和探討

7、衍生基團(tuán)對手性固定相分離能力的影響7-8.環(huán)糊精（衍生物）與硅膠間通過酰胺鍵、氨酯鍵和醚鍵等形成手性固定相，但這些鍵合臂存在易水解和穩(wěn)定性差的不足；同時環(huán)糊精與硅膠間鍵合位點(diǎn)不確定，手性固定相結(jié)構(gòu)不明確，反應(yīng)的重現(xiàn)性差9.針對這些問題，研究者應(yīng)用施陶丁格（Staudinger)反應(yīng)或點(diǎn)擊化學(xué)（Click Chemis-try)反應(yīng)來開發(fā)一些新型環(huán)糊精手性固定相6-7. 施陶丁格反應(yīng)在含疊氮基的手性選擇劑和硅膠基質(zhì)發(fā)生施陶丁格反應(yīng)后，新生成的脲鍵將兩者連接，與此前通過酰胺鍵、氨酯鍵和醚鍵等方式形成的材料相比，脲鍵連接的環(huán)糊精固定相材料在正相、極性相和含水比例較高的反相等條件中穩(wěn)定性高，對手性底物

8、的分離性能好，同時發(fā)生施陶丁格反應(yīng)的反應(yīng)點(diǎn)確定、條件溫和、重現(xiàn)性好10.它對哌嗪衍生物對映體表現(xiàn)出良好的分離性能;應(yīng)用SCDP半制備柱（250 x 10. 0 mm ID )對氧氟沙星實(shí)現(xiàn)半制備分離12，氧氟沙星對映體的純度超過98% ;探討基質(zhì)粒徑（3、5、10 pm )和孔徑（10、30、50 nm )等對固定相分離性能的影響13.結(jié)果表明，10nm3 pm環(huán)糊精手性固定 相對底物表現(xiàn)出了最佳的分離性能，硅膠粒徑增大導(dǎo)致色譜柱的理論塔板數(shù)和手性拆分能力降低；隨著孔徑增大，底物在色譜柱上的保留時間變短，分離度下降，這意味著在大孔填料上，分析物與手性固定相間不能充分接觸就被沖出色譜柱，分離效果

9、差。此外，還改變苯異氰酸酯上的取代基（如H和 CH3等)制備得到2種新的單脲鍵環(huán)糊精手性固定相（SPCP和SDMP等），探討了取代基對分離性能的影響。芳環(huán)上的氫原子被氯原子取代后，芳環(huán)n-電子密度降低而顯n-酸性，而甲基取代使其n-電子密度升高.研究表明，n-酸性的手性固定相對n-堿的底物的分離效果更好，反之亦然，同屬 n-酸或n-堿性的手性底物和固定相之間作用較差.手性選擇劑和基質(zhì)間的多鍵鍵合可提高手性固定相材料的耐酸和耐水性能9.以七取代氯苯氨基甲?；疭-環(huán)糊精和硅膠反應(yīng)得到一種新的多脲鍵S-環(huán)糊精手性固定相材料，在極性有機(jī)相模式下對手性鋨苯配合物進(jìn)行制備拆分，對映體的純度在98%以上.鋨

10、苯陽離子和流動相中環(huán)糊精形成的離子對增強(qiáng)了環(huán)糊精疏水性空腔對底 物的包合作用，促進(jìn)了手性固定相對底物的分離。同時，結(jié)合圓二色譜及理論計(jì)算確定手性鋨苯配合物的絕對構(gòu)型，首先被洗脫的為4-對映體，而A-對映體與固定相間作用要強(qiáng)于4-異構(gòu)體.這是首例運(yùn)用環(huán)糊精手性固定相拆分惟手性金屬中心（Chiral- only-at-Metal )鋨苯配合物的報道.手性金屬苯配合物具有獨(dú)特的配位結(jié)構(gòu)、特殊的催化活性、磁力敏感性及分子識別能力在生物無機(jī)化學(xué)、不對稱催化和超分子化學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景14-15.這種高效的色譜分離方法為研究者獲得單一對映體成為可能。1.2多糖手性固定相在多糖中，一些葡萄糖單元間通

11、過氫鍵形成不對稱的單螺旋結(jié)構(gòu)鏈，相鄰的螺旋結(jié)構(gòu)鏈排列形成 有序的超分子手性區(qū)域，因而多糖分子具有大量的手性活性點(diǎn)，表現(xiàn)出優(yōu)良的手性識別性能18.在多 糖骨架上引人取代基（如苯甲酸酯基和苯氨基甲酸 酯基等)很好地增強(qiáng)手性固定相的手性選擇性19 . 常用的多糖手性固定相分為涂敷型和鍵合型.其中，涂敷型材料在HPLC手性分離中應(yīng)用較多，但在一些非常規(guī)溶劑（如四氫呋喃、氯仿和丙酮等）中，多糖衍生物容易溶脹或溶解，其應(yīng)用范圍受到一些限制;而鍵合型多糖固定相在各種流動相條件下穩(wěn)定 性好，在制備色譜中應(yīng)用潛力巨大，成為當(dāng)前多糖固定相研究的主要內(nèi)容之一20.目前采用施陶丁格反應(yīng)將含疊氮的多糖衍生物鍵合到硅膠基

12、質(zhì)表面，得到一系列新型鍵合型多糖手性固定相材料21-24.鍵合型纖維素手性固定相在正相和反相條件下拆分30種手性底物21 ，探討了酸/堿添加劑對手性分離性能的影響22.結(jié)果表明，手性固定相對底物的包合作用、n-n堆積、氫鍵和空間位阻等都是手性拆分的主要作用力;在流動相中加人酸/堿添加劑后，手性固定相對底物的分離性能加強(qiáng)，酸性分析物洗脫加快，而加人二乙胺則使堿性分析物的保留變強(qiáng).并與商品柱Chiralcel OF(涂敷型手性柱）的分離性能進(jìn)行對比.盡管它們擁有相同的衍生基團(tuán)和纖維素骨架，但其分離性能然不同。1.3蛋白質(zhì)類手性固定相在蛋白質(zhì)中，手性亞單位L-氨基酸能特異性地 結(jié)合手性分子，常作為手

13、性固定相使用，其中對牛血清白蛋白（BSA )30-3|、人血清白蛋白32、心酸性糖蛋白33 、卵粘蛋白34 、纖維二糖水解酶和胃蛋白酶等研究較多。在反相體系下拆分色氨酸、匹多莫德、氨基酸衍生物、甘草素、安息香和氧氟沙星等底物，考察了流動相 pH值、離子強(qiáng)度、有機(jī)改性劑的比例、進(jìn)樣濃度和柱 溫等條件對分離性能的影響。由于流動相pH改變會影響到BSA的表面電荷，影響底物分子和BSA間的靜電作用，因而pH是影響蛋白質(zhì)手性固定相手性拆分性能的重要因素之一.另一方面，有機(jī)修飾劑（如甲醇、乙腈等)會改變BSA的空間構(gòu)型和立體環(huán)境，對BSA的拆分能力產(chǎn)生影響.在拆分脯氨酸（DNP-pro )和絲氨酸（DNP

14、-ser)時，也意外發(fā)現(xiàn)了由流動相中乙腈含量、pH值和醇的種類改變引起的手性識別反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，手性識別反轉(zhuǎn)區(qū)域隨乙腈濃度變化而變化28 .1.4其他類型手性固定相Pirkle型、大環(huán)類（冠醚/抗生素）、分子印跡和配體交換色譜手性固定相等均有各自的優(yōu)勢，在手性分離中占據(jù)著不可替代的地位35 .此外，手性多孔金屬有機(jī)框架材料（MOFs )具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和手性孔道，在高效液相色譜36 和氣相色譜手性分離中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。2手性傳感器識別法手性傳感器識別法具有簡單快捷、高效靈敏和選擇性高的特點(diǎn).電化學(xué)傳感器主要通過主體選擇性鍵合客體分子引起傳感器的電信號變化而實(shí)現(xiàn)手性識別;熒光傳感器基于對映體分

15、子和手性選擇劑形成締合物的熒光差異來實(shí)現(xiàn)識別.在壓電傳感器中，手性選擇膜鍍在石英晶體上，當(dāng)手性分子與手性膜發(fā)生作用時，會引起石英晶體的質(zhì)量和振動頻率改變，故稱為石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance, QCM )。 QCM 技術(shù)始于 20世紀(jì)60年代初期，因具有靈敏度高、檢測限低（達(dá)到納克級）、快速、容易實(shí)現(xiàn)在線分析檢測的特點(diǎn)，在手性化合物的識別和檢測方面得到很好的應(yīng)用。2.1氣相QCM傳感器傳感器感應(yīng)手性化合物的關(guān)鍵條件是在石英晶體上構(gòu)建具有手性識別位點(diǎn)的手性選擇劑.研究者選擇L-苯丙氨酸、杯芳烴類化合物、環(huán)糊精衍生物和血清蛋白等作為手性選擇劑，用于開發(fā)QCM

16、手性傳感器。 2.2液相QCM傳感器20世紀(jì)80年代開始發(fā)展了液相介質(zhì)的QCM 傳感器.Inagaki等47報道根據(jù)QCM傳感器與手性化合物的作用結(jié)果預(yù)測手性化合物在HPLC柱上的分離趨勢和效果.近年來，流動注射分析（FIA )-QCM傳感器可實(shí)時、動態(tài)和連續(xù)監(jiān)測生物分子與傳感器間的相互作用.Liu等48將HSA結(jié)合到石英晶片表面，研究其 在液相條件下對抗體的識別作用。目前采用自組裝FIA-QCM系統(tǒng)研究了 BSA和GSA對扁桃酸的手性識別作用，其中血清蛋白與R-扁桃酸作用強(qiáng) 于與S-對映體的作用力；從識別因子看，GSA對扁 桃酸的手性識別能力優(yōu)于BSA。3光譜法采用紫外-可見光譜、熒光光譜、

17、紅外光 譜和圓二色光譜法等考察手性選擇劑和手性底物的混合溶液在光譜上的細(xì)微變化，輔助以化學(xué)計(jì)量學(xué)分析或其它光譜聯(lián)用也可用于手性識別研究.在開展QCM生物傳感器手性識別研究的同時，分別采UV光譜和熒光光譜的方法深人研究 HSA、BSA、GSA和RbSA與手性分子間的手性識別機(jī)理.在血清蛋白溶液中，加人四氫萘胺、（4- 甲氧基苯基）乙胺和（3-甲氧基苯基）乙胺后，紫外吸收峰藍(lán)移，說明加人這些底物分子會使血清蛋白的疏水作用減弱，底物與血清蛋白間通過疏水作用結(jié)合；而加人2-辛醇和乳酸甲酯后，血清蛋白的紫外吸收峰強(qiáng)度明顯降低，歸因于底物分子與血清蛋白上氨基酸殘基形成氫鍵引起振動減弱.在熒光光譜上，血清蛋

18、白的內(nèi)源性熒光猝滅，而手性底物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，可解釋為手性分子與蛋白質(zhì)間形成靜態(tài)復(fù)合物，底物進(jìn)人血清蛋白的疏水空腔，改變了血 清蛋白的內(nèi)部微環(huán)境，從而對血清蛋白的熒光行為產(chǎn)生影響.同時，血清蛋白的紫外識別因子、熒光識別因子與QCM識別因子的變化趨勢一致.此外，對（4-甲氧基苯基）乙胺、（3-甲 氧基苯基）乙胺與血清蛋白的混合體系進(jìn)行同步熒光光譜和熒光壽命研究，這為探討手性藥物分子對生命體系的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。4展望天然手性小分子與生命過程息息相關(guān)，如手性小分藥物的藥效和作用機(jī)制、生化反應(yīng)過程的立體選擇性等和物質(zhì)的立體構(gòu)型間聯(lián)系密切.自第一批商品化手性柱成功上市以來，高效液相色譜手性分離技術(shù)

19、經(jīng)過近30年的發(fā)展?jié)u趨成熟，在手性藥物的分析檢測和制備拆分中占據(jù)了極為重要的位置.然而，隨著手性藥物、生命科學(xué)和材料科學(xué)等的迅速發(fā)展，對手性識別 和分離的研究提出了新的要求.在復(fù)雜結(jié)構(gòu)的手性 藥物的開發(fā)和生產(chǎn)中，不對稱合成和手性拆分串聯(lián)應(yīng)用、新型手性固定相材料的設(shè)計(jì)、新的手性分離制備技術(shù)的開展(如模擬移動床色譜和超臨界流體色譜技術(shù)等)必將引起研究者的更大關(guān)注。參考文獻(xiàn)：1 Berthofl A. Chiral recognition mechanismsJ. Analyti-cal Chemistry， 2010, 78( 7 ): 2093-2099.2 Lainmerhofer M. Ch

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