熒光顯微鏡的分析

1、生物儀器分析綜述熒光顯微鏡分析技術(shù)熒光顯微鏡分析技術(shù)摘要：熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一，已有100多年歷史。近年來,由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用, FISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣,顯微照相、數(shù)字CCD

2、成像技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng),賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)更新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。本文主要介紹熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理、操作及應(yīng)用、特點(diǎn)。關(guān)鍵詞：熒光顯微鏡、原理、操作方法、應(yīng)用、特點(diǎn)1. 鑒別熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：1）照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；2）光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；3）有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人眼。熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要的區(qū)別是二者的激發(fā)波長不同。由此決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)和使用方法上的不同。2. 熒光顯微鏡原理及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)熒光顯微鏡是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)

3、過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍(lán)光4200入)作為激發(fā)光、激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。這樣在強(qiáng)烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學(xué)成分等的研究。熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都

4、吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。要根據(jù)對顯微熒光觀測技術(shù)的實(shí)際需求,考慮以下因素,配置相應(yīng)的功能附件：1)熒光照明器個(gè)別廠家的熒光光源收光鏡在質(zhì)量上有消色差和復(fù)消色差兩種,前者可滿足常規(guī)工作,特殊研究可選后者。如果觀測樣品熒光亮度強(qiáng),可選配適當(dāng)透過率的ND濾光片。2)激發(fā)/發(fā)射濾光片組件理論上應(yīng)當(dāng)針對擬使用的熒光色素

5、或樣品的熒光特性選擇對應(yīng)波譜的激發(fā)/發(fā)射熒光組件,做到合理搭配,但由于組件的種類繁多且價(jià)格較貴,一般常配寬帶/長通濾光片組件。如果實(shí)驗(yàn)條件明確,則可以選擇窄帶/短通組件,如GFP、FISH觀察。當(dāng)然還有多波長組合,同時(shí)觀測多個(gè)熒光光譜。除熒光顯微鏡生產(chǎn)廠家外,還可以向?qū)ｉT生產(chǎn)激發(fā)/發(fā)射濾光片的廠家(如, Chroma, Omega等)訂購。3）反光鏡反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因?yàn)殇X對紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上，而銀的反射只有70%；一般使用平面反光鏡。4）聚光鏡專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒

6、光聚光器。（1）明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng)，使用方便，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。（2）暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度，壓制濾板也可以很薄，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無色濾板（不透過紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度，提高了圖像的質(zhì)量，觀察舒適，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。（3）相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察，既能看到熒光圖像，又能看到相差圖像，有助于熒光

7、的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。5）物鏡各種物鏡均可應(yīng)用，但最好用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長范圍）適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大 時(shí)其影響非常明顯。因此對熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡，配合以盡可能低的目鏡（4×,5×，6.3×等）。6)顯微照相裝置要求應(yīng)當(dāng)是自動(dòng)機(jī)型但有手動(dòng)控制功能,另需具備011%或1%點(diǎn)測光和設(shè)有專用于熒光照相的拍攝模式,因熒光鏡像的背景或物像較暗,最好配置有照明調(diào)焦標(biāo)線的取景放

8、大鏡,以利于調(diào)焦。7)數(shù)字CCD相機(jī)數(shù)字CCD成像技術(shù)發(fā)展甚快,與顯微鏡配套使用的數(shù)字CCD相機(jī)種類較多。追求分辨率固然重要,但若獲取好的顯微熒光成像質(zhì)量,還要考慮CCD的成像方式、靈敏度、成像速度、芯片對所用熒光素發(fā)射波長的量子利用效率等技術(shù)參數(shù)。滿足一般熒光成像應(yīng)采用科學(xué)級芯片,最好是冷CCD,以消除熒光成像遇到的暗流(Dark Current)干擾。3. 分類熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：1） 透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是

9、隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱所以對觀察較大的標(biāo)本材料較好。 圖1 透射式熒光顯微鏡的原理2）落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈

10、強(qiáng)。缺點(diǎn)在用低倍率物鏡時(shí)，像比較暗因此必須用大數(shù)值孔徑的物鏡，濾光鏡系統(tǒng)必須有效地分離開激發(fā)光和熒光。 圖2 落射式熒光顯微鏡的原理5.操作方法：（1）打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱15min才能達(dá)到最亮點(diǎn)。（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。（3）用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。（4）放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必

11、須用無熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需待汞燈完全冷卻后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命。（5）觀察。例如：在熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，觀察到經(jīng)0.01%吖啶橙熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。6.注意事項(xiàng)：（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。（2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈515min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。（3）防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。（4）檢查時(shí)間每次以12h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)

12、度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射35min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過23h。（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。（6）標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。長時(shí)間的激發(fā)光照射標(biāo)本，會(huì)使得熒光衰減和消失現(xiàn)象，故應(yīng)盡可能縮短照射時(shí)間。暫時(shí)不觀察時(shí)可用擋光板遮蓋激發(fā)光。（7）標(biāo)本觀察時(shí)候應(yīng)采用無熒光油，應(yīng)避免眼睛直視紫外光源。（8）電源應(yīng)安裝穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會(huì)降低熒光燈的壽命。7.優(yōu)點(diǎn)：1）檢出能力高2）對細(xì)胞的刺激小3）能進(jìn)行多重染色8.用途：1）物體構(gòu)造