2020年冰凍切片步驟很全面

1、作者：非成敗作品編號(hào)： 92032155GZ5702241547853215475102時(shí)間: 2020.12.13冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片。它實(shí)際上 是以水為包埋劑，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。在冰凍切片前組 織不經(jīng)過任何化學(xué)藥品處理或加熱過程，大大縮短了制片時(shí)間。同時(shí) , 由于此法不需要經(jīng)過脫水、透明和浸蠟等步驟，因而較適合于脂肪、 神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床 診斷。1. 取材：應(yīng)盡可能快地采取新鮮的材料，防止組織發(fā)生死后變化。2. 速凍：為了較好地保存細(xì)胞內(nèi)的酶活性或盡快制成切片標(biāo)本的需 要，一般 在取材后就要立刻對(duì)組織塊進(jìn)行速凍

2、，使組織溫度驟降，縮 短降溫的時(shí) 間，減少冰晶的形成。液氮速凍切片法是實(shí)驗(yàn)室最常用的速凍切片方法。 具體做法是將 組 織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約 2cm ）,如組織塊小可 適量加 OCT 包埋劑浸沒組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮 的小杯內(nèi)， 當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位 切勿浸入液氮 中，大約 10-20S 組織即迅速冰結(jié)成塊。在制成凍塊后 , 即可置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。若需要保存，應(yīng)快速以鋁箔或塑料 薄膜封包，立即置 入-80 °C 冰箱貯存?zhèn)溆谩?. 固定：樣品托上涂一層OCT包埋膠，將速凍組織置于其上，49冰箱預(yù) 冷5-10min讓

3、OCT膠浸透組織。取下組織置于錫箔或者玻片上，樣品托速凍。組織置于樣品托上，其上再添一層 OCT膠，以完全覆蓋為宜，速 凍架（PE）上 30mino4. 切片：恒溫冰凍切片機(jī)為較理想的冰凍切片機(jī)， 其基木結(jié)構(gòu)是將切片機(jī) 置 于低溫密閉室內(nèi)，故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄 片至 5-lOnnio切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以？ 15 °? -20 C為宜，溫度過低 組織易 破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切 勿上下移 動(dòng)。切好室溫放置30min后，入4°C丙酮固定510min,烘 箱T?燥20min o PBS 洗 5minx3o 進(jìn)行抗原熱修復(fù)，微波

4、熱修復(fù)也可 , 室溫自然冷卻?？?用 3%H2O2 孵育 510min, 消除內(nèi)源性過氧化物酶 的活性。5. 免疫熒光染色：冰凍切片室溫晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室溫 封 閉切片 1 小時(shí)（此步可不洗）滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液 （抗體的量視組織大小而 定，原則是可以均勻覆蓋組織而，且保證整個(gè)過程中不會(huì)使組織干涸），將切片放在加了 PBS 的免疫組化濕盒，室溫孵育 2 小時(shí)或 4°C 過 夜。第二天先將濕盒放到37°C回溫lh,然后吸取片上的一抗進(jìn)行回收，將切片插入到小染缸 PBS沖洗。滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置于分子雜交箱中37°C孵育1小時(shí)?；厥斩?，切片置于染缸內(nèi)，PBS洗5minx3次。滴加 DAPI 工作液染核，室溫 10-20min （工作濃度 0.1%染色15min ）o回收DAPI,滴加5-10gl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠，用處理干凈的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。 做 好的片放在切片盒內(nèi)，置于4°