動物細胞融合和單克隆抗體(公開課)

1、1 1、定義：、定義：指用自然或人工方指用自然或人工方法使兩個或多個不同的細胞法使兩個或多個不同的細胞融合成一個細胞的過程。融合成一個細胞的過程。一、動物細胞融合一、動物細胞融合細胞雜交：細胞雜交：不同基因型的細不同基因型的細胞之間的融合就是胞之間的融合就是細胞雜交細胞雜交。雜交細胞：雜交細胞：融合后形成的具融合后形成的具有原來有原來兩個或多個細胞遺傳兩個或多個細胞遺傳信息信息的的單核細胞單核細胞成為雜交細成為雜交細胞胞。 細胞融合是正常的生命活動細胞融合是正常的生命活動兩個細胞正在融合兩個細胞正在融合 受精作用受精作用 二二.動物細胞融合動物細胞融合2、誘導融合的因素誘導融合的因素 生物法：

2、生物法：滅活的病毒滅活的病毒誘導融誘導融合合.(.(利用滅活仙臺病毒是動物細利用滅活仙臺病毒是動物細胞融合所特有的。胞融合所特有的。 這是由于病毒這是由于病毒的磷脂外衣與動物細胞的膜十分的磷脂外衣與動物細胞的膜十分相似的緣故。病毒外殼上的某些相似的緣故。病毒外殼上的某些糖蛋白可能還有促進細胞融合的糖蛋白可能還有促進細胞融合的功能。功能。) ) 化學法：化學法：聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG誘導融誘導融合合. . 物理法：物理法：電激電激融合融合病毒顆粒黏病毒顆粒黏 附細胞表面附細胞表面細胞膜連接細胞膜連接細胞膜被細胞膜被 病毒顆粒穿通病毒顆粒穿通細胞融合、形成雜種細胞細胞融合、形成雜種細胞3 3

3、、動物細胞融合技術(shù)的應用、動物細胞融合技術(shù)的應用 細胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使細胞融合技術(shù)突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能。遠緣雜交成為可能。 利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。利用雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體。 因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂因為滅活的病毒能使細胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合，不滅質(zhì)分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合，不滅活的話會感染細胞，而不能誘導細胞融合?；畹脑挄腥炯毎?，而不能誘導細胞融合?？偨Y(jié)：比較植物體細胞雜交和動物細胞融合總結(jié)：比較植物體細胞雜交和動物細胞融合 人們獲得抗體的傳統(tǒng)方法是人們獲得抗體的傳統(tǒng)方

4、法是? ?將抗原注入動物體將抗原注入動物體, ,然后從動物血清中提取抗體然后從動物血清中提取抗體 這種方法的缺點是什么這種方法的缺點是什么? ?效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動物抗體注入人體可效率低，產(chǎn)量有限，純度低，動物抗體注入人體可能產(chǎn)生嚴重的過敏反應。能產(chǎn)生嚴重的過敏反應。 運用已學知識，設(shè)想怎樣獲得單一類型的抗體？運用已學知識，設(shè)想怎樣獲得單一類型的抗體？ 能否用單個能否用單個B B淋巴細胞通過克隆形成的細胞群來淋巴細胞通過克隆形成的細胞群來產(chǎn)生單一類型的抗體呢？產(chǎn)生單一類型的抗體呢？B B淋巴細胞在體外不能無限增殖。淋巴細胞在體外不能無限增殖。二：動物細胞融合的成功應用二：動物細胞融合的

5、成功應用 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備思思考考單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備極富創(chuàng)造性的方案極富創(chuàng)造性的方案 將能夠產(chǎn)生特定抗體的將能夠產(chǎn)生特定抗體的B B淋巴細胞淋巴細胞和具有無限增殖能和具有無限增殖能力的力的骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交融合在一起，形成雜交瘤細胞。雜交瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一瘤細胞既能在體外快速生長，又能持續(xù)分泌成分單一的特異性抗體。這種的特異性抗體。這種單一類型的只針對某一特定抗原單一類型的只針對某一特定抗原決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。決定簇的抗體分子，就是單克隆抗體。 米爾斯坦米爾斯坦( (阿根廷阿根廷) )和科

6、勒和科勒( (德國德國) )因此在因此在19841984年獲諾年獲諾貝爾獎。貝爾獎。提取提取用特定的用特定的選選擇性培養(yǎng)基擇性培養(yǎng)基1.動物特異性免疫動物特異性免疫2.分離分離B淋巴細胞（淋巴細胞（B）；找到骨髓瘤細胞（）；找到骨髓瘤細胞（G）。注意）。注意B淋巴細淋巴細胞是一個系列。（胞是一個系列。（B1,B2,B3,-Bn）3.細胞融合細胞融合三種融合方式三種融合方式:（BB;BG;GG）4.第一次篩選第一次篩選：在：在“選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)”上培養(yǎng)篩選上培養(yǎng)篩選雜交瘤細胞雜交瘤細胞（只有（只有BG雜交瘤細胞存活。但雜交瘤細胞存活。但BG雜交瘤細胞也是一個系列：雜交瘤細胞也是一個系

7、列：如如B1G,B2G-BnG。而。而BB,GG在此培養(yǎng)基上不能存活。）在此培養(yǎng)基上不能存活。）5.第二次篩選第二次篩選：在：在“多孔培養(yǎng)板上多孔培養(yǎng)板上”培養(yǎng)培養(yǎng)雜交瘤細胞系列雜交瘤細胞系列每孔每孔只放一個雜交瘤細胞。只放一個雜交瘤細胞。“克隆化培養(yǎng)克隆化培養(yǎng)”每個雜交瘤細胞，并進每個雜交瘤細胞，并進行行“單一抗體檢測單一抗體檢測”，“檢測陽性檢測陽性”的孔內(nèi)即是所需要的雜交的孔內(nèi)即是所需要的雜交瘤細胞。瘤細胞。6.選擇所需要的雜交瘤克隆細胞群，選擇所需要的雜交瘤克隆細胞群，體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)或注射到或注射到小鼠腹腔小鼠腹腔內(nèi)增殖內(nèi)增殖。7.提取單克隆抗體。提取單克隆抗體。1、單抗的制備過程要

8、點：、單抗的制備過程要點：4 4）、如何進行第）、如何進行第2 2次篩選？次篩選？培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細胞。培養(yǎng)在多孔培養(yǎng)板上，每孔只有一個雜交瘤細胞。第第1 1次篩選得到雜交瘤細胞（多種）。第次篩選得到雜交瘤細胞（多種）。第2 2次篩選得次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞群。到能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞群。問題強化：問題強化：1 1）、本過程利用了哪些原理？）、本過程利用了哪些原理？免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理免疫原理，細胞融合原理和動物細胞培養(yǎng)原理2 2）、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與）、為什么選用小鼠骨髓瘤細胞與B B細胞融合？細胞融合？這樣融合成的雜交

9、瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，這樣融合成的雜交瘤細胞，繼承了雙親細胞的遺傳物質(zhì)，不僅具有不僅具有B B細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的細胞分泌抗體的能力，而且還有無限增殖的本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體本領(lǐng)，因而可以獲得大量單克隆抗體 1、作為診斷試劑作為診斷試劑：在臨床生化診斷、病理組織定位、在臨床生化診斷、病理組織定位、體內(nèi)腫瘤的定位等體內(nèi)腫瘤的定位等, ,與常規(guī)抗體相比與常規(guī)抗體相比, ,具有具有準確、高效、準確、高效、簡易、快速簡易、快速特點特點. 2、用于治療疾病和運載藥物用于治療疾病和運載藥物： 主要用于癌癥治療。主要用于癌癥治療。 生物導彈：生物導彈：抗癌細胞的單克隆

10、抗體抗癌細胞的單克隆抗體+ +放射性同位素放射性同位素+ +化學化學藥物或細胞毒素藥物或細胞毒素。（單克隆抗體：導向。準確找到癌細。（單克隆抗體：導向。準確找到癌細胞位置，原位殺死癌細胞。）胞位置，原位殺死癌細胞。） 特異性強，靈敏度高，可大量制備。特異性強，靈敏度高，可大量制備。3 3、單克隆抗體的應用、單克隆抗體的應用B體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞雜交瘤細胞足夠數(shù)量的細胞群足夠數(shù)量的細胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔AC 下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷下圖為某同學根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風桿菌單克隆抗體的實驗方案風桿菌單克隆抗體的實驗方案2、該方案能達到預期效果嗎？為什么？、該方案能達到預期效果嗎？為什么？4、圖中、圖中B為為_過程，常用過程，常用_作為誘導劑，該細胞繼作為誘導劑，該細胞繼承承_的遺傳特性，既能的遺傳特性，既能_,又能又能_。1、該實驗方案的目的是、該實驗方案的目的是_3、A是從小鼠的脾臟中取得是從小鼠的脾臟中取得_,該細胞能夠