植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)修改

1、廣東省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)教材植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)陳遠(yuǎn)玲 李 靜 編著華南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室植物細(xì)胞工程分室2005年2月編 者 的 話這本教材是為廣東省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)課程編寫的，所開實(shí)驗(yàn)面向石牌地區(qū)六所高校的高年級(jí)本科生和本校研究生。本課程總學(xué)時(shí)52.5。實(shí)驗(yàn)一至六及實(shí)驗(yàn)八為本科生課程內(nèi)容；實(shí)驗(yàn)一至七及實(shí)驗(yàn)九為研究生課程內(nèi)容。在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容選擇上，兼顧不同專業(yè)、不同層次學(xué)生的要求，既有較為實(shí)用化的技術(shù)如快繁、微莖尖培養(yǎng)脫毒、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)等技術(shù)，也有研究性較強(qiáng)的技術(shù)如原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞融合、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù),力爭(zhēng)使選課者對(duì)植物細(xì)胞工程技

2、術(shù)有一個(gè)較全面的了解和掌握。各校選課者可根據(jù)自己的需要選修其中的內(nèi)容。在實(shí)驗(yàn)順序安排上，遵循由易到難的原則，由培養(yǎng)基配制器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞融合遺傳轉(zhuǎn)化。本教材是在總結(jié)我室多年的研究經(jīng)驗(yàn)和成果，以及多年來對(duì)研究生和本科生開課經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上寫成的。教材的最初版本寫于1996年，2000年作了部分修改。為了適應(yīng)新的教學(xué)需要，培養(yǎng)學(xué)生進(jìn)行研究性學(xué)習(xí)的能力，這次編寫對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容作了較大增改，并提高了教學(xué)要求。近年來我們對(duì)研究生試行3期開出了5個(gè)、本科生試行1期開出了4個(gè)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)，取得了很好的教學(xué)效果。在本次改編時(shí)，正式編寫了6個(gè)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)2、3為綜合及設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)6

3、9為綜合性實(shí)驗(yàn)）。有能力、感興趣的學(xué)生可自行設(shè)計(jì)試驗(yàn)，探索有關(guān)的科學(xué)問題或解決生產(chǎn)實(shí)際問題。我們衷心希望本書的使用者提出寶貴意見，以使本課程教學(xué)收到更好的效果。編 者 2005年2月 目 錄實(shí)驗(yàn)一培養(yǎng)基的配制與滅菌1實(shí)驗(yàn)二愈傷組織的誘導(dǎo)與分化5實(shí)驗(yàn)三幾種植物快速無性繁殖方案的探索7實(shí)驗(yàn)四微莖尖脫毒培養(yǎng)12實(shí)驗(yàn)五植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)14實(shí)驗(yàn)六植物原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)16實(shí)驗(yàn)七植物細(xì)胞融合19實(shí)驗(yàn)八植物遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法21實(shí)驗(yàn)九植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)法24附錄1植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基27附錄2常用激素的溶解28附錄3常用消毒劑的使用和效果28附錄4水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)所用洗液及培養(yǎng)基29附錄5Sartori

4、us PB-10 型酸度計(jì)簡(jiǎn)明操作指南31參考文獻(xiàn)32實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制與滅菌一、目的掌握植物培養(yǎng)基的基本成分及其作用；掌握植物培養(yǎng)基的配制方法；掌握培養(yǎng)基及各種用具的滅菌方法二、原理（一）培養(yǎng)基在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分、生長(zhǎng)因子、理化環(huán)境等主要由培養(yǎng)基提供。不同材料對(duì)培養(yǎng)基的要求不盡相同，適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)和選用培養(yǎng)基，對(duì)組織培養(yǎng)取得成功是至關(guān)重要的。另外，組織培養(yǎng)物的脫分化、分化等狀態(tài)的調(diào)控，次生代謝物的產(chǎn)出等都要通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分來實(shí)現(xiàn)。培養(yǎng)基實(shí)際上是一個(gè)人工模擬的植物生長(zhǎng)、發(fā)育環(huán)境，它通常包括下列成分（表1）：表1培養(yǎng)基的組成成分及其作用類 別成分作用無機(jī)鹽大量元素：

5、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、I、Co等植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素有機(jī)物營(yíng)養(yǎng)物：糖類、氨基酸及酰胺類 生理活性物：維生素等為植物細(xì)胞提供C、H、O、N等必要元素；作為生理活性物質(zhì)在細(xì)胞代謝中起一定作用；糖類還可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑植物天然的五類激素及其人工合成的類似物作為生理活性物質(zhì)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中重要的化學(xué)信號(hào)分子附加物如瓊脂、活性C等固化劑可使外植體固著、定位生長(zhǎng)；活性C可吸附外植體所分泌的有害物質(zhì)，利于細(xì)胞生長(zhǎng)其他未加復(fù)合成分如椰子水、酵母提取物、香蕉、西瓜水、馬蹄汁供給一些必要的微量營(yíng)養(yǎng)成分、生理活性

6、物和生長(zhǎng)激素等，緩沖pH值幾種常見的培養(yǎng)基配方見附錄1。配制培養(yǎng)基可以直接稱量。但為了提高稱量的準(zhǔn)確性并減少多次稱量的麻煩，通常都按配方濃度的若干倍稱量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用時(shí)按比例稀釋。一般要配下列母液：1. 微量元素母液：除鐵鹽外的其他微量元素鹽類的混合液，配成1000倍母液。2. 有機(jī)化合物母液：除肌醇外其他有機(jī)成分的混合液，配成1000倍母液。3. 鐵鹽母液：鐵鹽與其他無機(jī)成分混合易產(chǎn)生沉淀，須單獨(dú)配制。通常與Na2EDTA配成100倍的螯合鐵鹽母液。4. 激素母液：各種激素單獨(dú)配制成母液，濃度從0.1mg/mL到1.0mg/mL不等。各種激素的溶解見附錄2。5. 10倍

7、培養(yǎng)基母液：培養(yǎng)基配方中除激素、糖、固化劑外，其他成分（大量元素、微量元素、有機(jī)成分、鐵鹽、肌醇等）混合配成10倍液1000mL，等分為10瓶，置于冰箱冷凍保存。用時(shí)取1瓶該母液，加入激素、糖、固化劑等成分配成1000mL即可。此法方便快捷，但某些配方（如KC培養(yǎng)基）中有些成分溶解度很小，不能配成10倍母液。培養(yǎng)基的pH值會(huì)影響植物對(duì)養(yǎng)分的吸收與利用，還會(huì)影響瓊脂等固化劑的凝固，因此培養(yǎng)基必須調(diào)至一定的pH值。不同植物培養(yǎng)所要求的pH值有所不同。此外，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后pH值一般要降低0.10.2，所以在滅菌前調(diào)pH值時(shí)要相應(yīng)調(diào)高。（二）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基必須保證絕對(duì)無菌，否則因其營(yíng)養(yǎng)豐富，細(xì)

8、菌、真菌極易滋生，從而導(dǎo)致外植體死亡。培養(yǎng)基滅菌方法有下列幾種：1. 高溫高壓滅菌：將培養(yǎng)基放入高壓鍋內(nèi)，121、108KPa（1.1 kg/cm2）的壓力下持續(xù)20min。2. 過濾除菌：帶菌的溶液通過孔經(jīng)為0.22m（或更?。┑奈⒖诪V器裝置，雜菌阻隔留在濾膜上，而溶液進(jìn)入無菌空瓶?jī)?nèi)，從而達(dá)到除菌的目的。此法用于不能高溫高壓滅菌的溶液的除菌。360Co射線照射：用射線過量照射可達(dá)到滅菌目的。三、實(shí)驗(yàn)材料 稱量紙 牛皮紙 標(biāo)簽紙 瓶塞 橡筋 四、儀器設(shè)備及用具（一）儀器設(shè)備精度0.1mg電子天平 精度10mg電子天平 超凈工作臺(tái) 高壓鍋 酸度計(jì) 磁力攪拌器 電動(dòng)吸引器 過濾器 玻璃蒸餾水器或去

9、離子水儀 普通冰箱 微波爐（二）用具（每組用量）燒杯：100mL×10, 200mL×10, 500mL×5, l000mL×5量筒：100mL×5, 500mL×5, 1000mL×5磨口試劑瓶：100mL×l0, 500mL×5三角瓶：100mL×30, 500mL×5，1000mL×5刻度吸管：1mL×l0, 2mL×l0, 5mL×l0, 10mL×10塑料瓶：100mL×20洗瓶：500mL×2微孔濾膜：（

10、孔徑0.22m、60mm）×2藥匙：5五、試劑1 mol/L HCl 1 mol/L KOH 標(biāo)準(zhǔn)pH溶液（25下 pH4.003和 pH6.864的標(biāo)準(zhǔn)液各100mL） 蔗糖 瓊脂NH4NO3KI甘氨酸2,4-DKNO3H3BO3鹽酸硫胺素6-BACaCl2·2H2OMnSO4·H2O鹽酸吡哆醇NAAMgSO4·7H2OZnSO4·7H2O煙酸KH2PO4Na2MoO4·2H2O肌醇(NH4)2SO4CuSO4·5H2OCoCl2·6H2OFeSO4·7H2O六、實(shí)驗(yàn)步驟（一）母液配制微量元素母液1.

11、按培養(yǎng)基配方所列微量元素成分，取相應(yīng)分析純化學(xué)試劑（對(duì)水合分子不同的試劑要進(jìn)行換算）。2. 將1L培養(yǎng)基所需各種微量元素?cái)U(kuò)大100倍，進(jìn)行實(shí)際稱量。3. 在100mL燒杯中加入約80mL蒸餾水，用精度0.1mg電子天平稱量每種微量元素，依次溶解。4. 用量筒定容為100mL，轉(zhuǎn)入試劑瓶中。貼上標(biāo)簽，注明配制人、溶液濃度、配制日期，4貯存。鐵鹽母液按培養(yǎng)基配方所列FeSO4·7H2O和EDTANa2·2H2O含量擴(kuò)大10倍進(jìn)行實(shí)際稱量，分別用50mL蒸餾水完全溶解后混合，4貯存。有機(jī)成分母液按培養(yǎng)基配方所列有機(jī)成分含量擴(kuò)大100倍后，用精度0.1mg電子天平分別稱量，加入蒸餾

12、水充分溶解，混勻，定容至100mL，4貯存。激素母液IAA, IBA, NAA, 2,4-D, BA, Zeatin 等激素用少量 95% 乙醇 或 1 mol/L KOH完全溶解后加水定容；KT 和 ABA 用 少量1 mol/L KOH完全溶解后加水定容。1. 2,4-D母液（0.5mg/mL）：用精度0.1mg天平稱取2,4-D 25mg 用幾mL 95%乙醇充分溶解 加水定容為50mL。2. 6-BA母液（0.5mg/mL）：用精度0.1mg天平稱取6-BA 25mg 用少量1 mol/L KOH充分溶解 加水定容為50mL。3. NAA母液（0.2mg/mL）：用精度0.1mg天平稱

13、取NAA20mg 用幾mL 95%乙醇充分溶解 加水定容為100mL。（二）培養(yǎng)基濃縮液配制按培養(yǎng)基配方所列大量元素和肌醇含量擴(kuò)大10倍，分別稱量，依次加入蒸餾水中充分溶解，并加入鐵鹽母液100mL、微量元素母液10mL、有機(jī)成分母液10mL，用1000mL量筒或容量瓶定容為1L，充分混勻，平均分裝至10個(gè)100mL塑料試劑瓶中，0以下貯存。（三）培養(yǎng)基配制1. 將100mL培養(yǎng)基濃縮液解凍后，加入實(shí)際所需的蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其它附加物，加入蒸餾水定容至500 mL。2. 稱取8g瓊脂或2.6g植物膠，置于500mL蒸餾水中，加熱煮溶。3. 將 500mL的培養(yǎng)基與500mL的瓊脂或植物膠熔化

14、液充分混合，按下列方法調(diào)pH后分裝。（四）調(diào)節(jié)pH值（使用前請(qǐng)閱讀附錄5：酸度計(jì)使用指南）1. 用pH標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)酸度計(jì)。2. 測(cè)量及調(diào)節(jié)溶液pH值：用蒸餾水或脫離子水清洗電極，吸水紙吸干后將電極浸入待測(cè)溶液，邊攪拌邊測(cè)pH。待數(shù)值達(dá)到穩(wěn)定，出現(xiàn)“S”時(shí)，即可讀取測(cè)量值。如該值高于所需值，逐滴加入1 mol/L HCl，調(diào)至所需值并顯示“S”；如該值低于所需值，則逐滴加入1 mol/L NaOH/KOH，調(diào)至所需值并顯示“S”。3. 測(cè)量完畢，用蒸餾水沖洗電極，用吸水紙小心擦干，將電極放回保存液中。（五）滅菌1. 高溫高壓滅菌高壓鍋內(nèi)加水 將待滅菌物品放入鍋內(nèi)，蓋好，打開排氣閥 通電 水沸后排氣

15、10min 關(guān)上排氣閥 壓力升至108 KPa（1.1 kg/cm2）時(shí)開始計(jì)時(shí)，維持此壓力20min 斷電 壓力表降至0后，打開放氣閥放氣，開蓋，取出物品。2. 抽濾除菌準(zhǔn)備濾器及分裝器皿 濾器及器皿高溫高壓滅菌 在超凈臺(tái)內(nèi)抽濾分裝。七、注意事項(xiàng)1. 配制培養(yǎng)基必須用去離子水或玻璃器蒸餾水，化學(xué)藥品必須是高純度的。2. 配培養(yǎng)基時(shí)有些成分易與其他成分結(jié)合形成溶解度很小的物質(zhì)而沉淀，故應(yīng)單獨(dú)溶解后再加到混合液中，如CaCl2·2H2O、Na2MoO4·2H2O。3. 貯存一定時(shí)間后的母液如果長(zhǎng)霉或形成沉淀，則需重新配制。4. 滅菌好的培養(yǎng)基一般要觀察4天左右，確定徹底滅菌后

16、才用。綜合及設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二 愈傷組織的誘導(dǎo)與分化一、目的通過添加及不添加激素的對(duì)比培養(yǎng)基了解愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的過程與激素的作用；掌握外植體的消毒方法和接種技術(shù)；通過使用不同的消毒劑認(rèn)識(shí)消毒效率的不同二、原理以植物器官、組織、細(xì)胞等作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)都能形成愈傷組織。愈傷組織再經(jīng)分化培養(yǎng)，通過器官發(fā)生途徑或體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑可再生成完整植株。組織培養(yǎng)物的脫分化、生長(zhǎng)及分化均是基因選擇性地表達(dá)和關(guān)閉的結(jié)果，作為第一信使的植物激素在這些過程中是信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)起者。因此，培養(yǎng)物的生長(zhǎng)、分化方向的控制主要是通過添加不同種類和濃度的植物激素來實(shí)現(xiàn)的。由外植體誘導(dǎo)愈傷組織是一個(gè)脫分化的過程，通常需

17、要加入較高比例的生長(zhǎng)激素，如2,4-D。由愈傷組織再生植株則是一個(gè)再分化過程。一般而言，高比例的細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素有利于芽的形成；低比例時(shí)有利于根的形成。再分化過程一般使用NAA及BA。除植物激素外，培養(yǎng)基的其他成分如C源、氨基酸附加物、瓊脂濃度等也可影響培養(yǎng)物的狀態(tài)和再生能力。外植體如果是帶菌的，在接種前都必須消毒。常用的消毒劑及其使用效果見附錄3。不同植物、不同部位的外植體對(duì)消毒劑的耐受性不同，幼嫩材料消毒濃度要適當(dāng)降低。對(duì)于難消毒的材料，有時(shí)要幾種消毒劑配合使用；對(duì)于多茸毛、表面粗糙不平的材料，要加少量展著劑（如吐溫20）以增強(qiáng)消毒效果。三、實(shí)驗(yàn)材料水稻成熟種子（用于誘導(dǎo)愈傷組織）水稻胚

18、性愈傷組織（用于分化培養(yǎng)）四、儀器設(shè)備及用具（一）儀器設(shè)備 電子天平 酸度計(jì) 高壓滅菌鍋 超凈工作臺(tái) 培養(yǎng)室（二）用具 微量移液器 無菌培養(yǎng)皿 槍形鑷 電熱滅菌器 無菌三角瓶 五、試劑及培養(yǎng)基（一）試劑 75%乙醇 1%NaClO 0.2%HgCl2 無菌水（二）培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基：a. N6大量MS微量B5有機(jī)2,4-D 2.5mg/L蔗糖30g/L瓊脂8g/L pH5.8b. N6大量MS微量B5有機(jī)蔗糖30g/L瓊脂8g/L pH5.8分化培養(yǎng)基：c. N6大量MS微量B5有機(jī)NAA1mg/LBA3mg/L蔗糖30g/L瓊脂8g/L pH5.8d. N6大量MS微量B5有機(jī)蔗糖30g/L瓊

19、脂8g/L pH5.8六、實(shí)驗(yàn)步驟1. 培養(yǎng)基的配制及滅菌：配制a,b,c,d 四種培養(yǎng)基并分裝于50mL三角瓶，滅菌2. 接種室及用具表面消毒：75%酒精棉球擦拭超凈工作臺(tái)，將培養(yǎng)基及用具放入工作臺(tái)，打開紫外燈，照射20min，關(guān)閉紫外燈，打開工作臺(tái)風(fēng)機(jī)，通風(fēng)15min后可進(jìn)行無菌操作3. 消毒劑的配制：75%酒精 1NaClO 0.2% HgCl24. 水稻種子去殼：用自制的脫殼砂紙脫去谷殼，注意保持種胚完整5. 外植體消毒：兩種消毒方案a 脫殼種子放入20mL三角瓶加75%酒精約30mL，搖動(dòng)數(shù)次 棄酒精 加0.2%HgCl2，搖動(dòng)，20min 棄HgCl2 加1%NaClO，搖動(dòng)，10

20、min 棄NaClO 無菌水洗4次 棄無菌水，種子放在鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上吸干水分，備用（注意：HgCl2是劇毒藥品！消毒后的廢液要回收統(tǒng)一處理，不得自行廢棄）b 脫殼種子放入20mL三角瓶 加75%酒精約30mL，搖動(dòng)數(shù)次 棄酒精 加1%NaClO，搖動(dòng)，30min 棄NaClO 無菌水洗4次 棄無菌水，種子放在鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿上吸干水分，備用6. 接種與觀察愈傷組織誘導(dǎo)：將吸干水分的種子均勻平放在a、b兩種培養(yǎng)基上，每瓶接種10粒，每人3瓶。放入培養(yǎng)室25ºC暗培養(yǎng)。1w后調(diào)查計(jì)算污染率，3w后調(diào)查計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率：污染率（）污染的種子數(shù)/接種的總種子數(shù)×100

21、誘導(dǎo)率（）形成愈傷組織的種子數(shù)/接種的總種子數(shù)×100植株分化：挑選新鮮，結(jié)構(gòu)比較致密的顆粒狀胚性愈傷組織接入c、d兩種培養(yǎng)基，每瓶接種10塊，每人2瓶。放入培養(yǎng)室，25ºC，2000Lux每天光照10h 培養(yǎng)。一個(gè)月后調(diào)查計(jì)算分化率：分化率（）分化植株的愈傷塊數(shù)/接種分化的總塊數(shù)×100七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1. 簡(jiǎn)要說明實(shí)驗(yàn)?zāi)康募霸恚?. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：統(tǒng)計(jì)污染率、誘導(dǎo)率、分化率；3. 比較a、b兩種培養(yǎng)基間及c、d兩種培養(yǎng)基間對(duì)誘導(dǎo)和分化的不同影響，描述外觀形態(tài)區(qū)別，并分析原因；4. 比較a、b兩種消毒方法對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不同影響，并分析原因，找出合適的消毒劑種

22、類、濃度及消毒時(shí)間；5. 回答問題：如何在接種過程中降低污染率？八、說明本實(shí)驗(yàn)為綜合及設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)使學(xué)生對(duì)植物激素在組織培養(yǎng)中的作用及不同消毒劑的使用效果有一感性認(rèn)識(shí)；同時(shí)向?qū)W生傳輸一種理念，即科學(xué)實(shí)驗(yàn)需要不斷摸索不同的實(shí)驗(yàn)條件，才能取得理想的效果。本實(shí)驗(yàn)綜合了實(shí)驗(yàn)一的內(nèi)容，可使學(xué)生進(jìn)一步掌握培養(yǎng)基配制、滅菌及無菌操作技術(shù)。綜合及設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)三 幾種植物快速無性繁殖方案的探索一、目的本實(shí)驗(yàn)旨在培養(yǎng)學(xué)生提出問題、分析問題和設(shè)計(jì)方案解決問題的能力。通過實(shí)驗(yàn)學(xué)生要：1.學(xué)會(huì)利用各種渠道查閱相關(guān)專業(yè)文獻(xiàn)，綜合分析前人的研究結(jié)果，并在此基礎(chǔ)上提出待解決的問題；2.了解各類植物在快速無性繁殖

23、中的形態(tài)發(fā)生類型，并根據(jù)植物的不同形態(tài)發(fā)生類型設(shè)計(jì)培養(yǎng)方案，探索提高快繁系數(shù)的途徑二、原理植物的快速無性繁殖技術(shù)是指：選取合適的外植體作為起始材料，在無菌條件下，借助合適的培養(yǎng)技術(shù)，利用多層集約化培養(yǎng)架在有限空間快速生產(chǎn)大量植株的技術(shù)。在確定快繁植物種類時(shí)，首先要看該植物是否有必要利用組培進(jìn)行快速繁殖。一般選擇標(biāo)準(zhǔn)為：1.經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，自然繁殖系數(shù)低的植物；2.珍稀、瀕危植物；3.常規(guī)方法脫毒困難，必須通過微莖尖培養(yǎng)來脫除病毒的植物；4.遠(yuǎn)緣雜交不育，需利用離體培養(yǎng)進(jìn)行胚挽救的植物；5.特殊用途者（如用于遺傳轉(zhuǎn)化）。一種植物在離體培養(yǎng)時(shí)可能存在不同的形態(tài)發(fā)生方式，例如香蕉，既可以經(jīng)過愈傷組織階段

24、以體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式再生植株，又可以以不定芽方式再生植株。以快繁為目的時(shí)應(yīng)選擇易于誘導(dǎo)、增殖系數(shù)高、易分化成苗并且變異率低的形態(tài)發(fā)生方式。植物離體培養(yǎng)中常見的形態(tài)發(fā)生類型有：器官增殖型、器官發(fā)生型、胚狀體、原球莖狀體、根狀莖、鱗莖、塊莖等等。植物快速無性繁殖包括以下技術(shù)環(huán)節(jié)：1. 建立無菌培養(yǎng)物。此階段應(yīng)設(shè)法降低污染率，提高誘導(dǎo)率；2. 培養(yǎng)物的大量增殖。該階段主要問題是設(shè)法提高繁殖系數(shù)；3. 植株分化。設(shè)法提高分化率和成苗率；4. 試管苗移植。設(shè)法提高小苗成活率。本試驗(yàn)主要針對(duì)前2個(gè)階段進(jìn)行調(diào)控。試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)參閱本實(shí)驗(yàn)附件試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)要求。三、實(shí)驗(yàn)材料有快繁價(jià)值的植物，如花卉、林木、果樹、

25、蔬菜等均可。本實(shí)驗(yàn)室常備一些有代表性的無菌植物材料，各組也可自行準(zhǔn)備有價(jià)值的材料四、儀器設(shè)備及用具（一）儀器設(shè)備 電子天平 酸度計(jì) 高壓滅菌鍋 超凈工作臺(tái) 電熱滅菌器 培養(yǎng)室 （二）用具 解剖刀，無菌培養(yǎng)皿（墊濾紙），槍形鑷等，視具體方案而定 五、試劑及培養(yǎng)基視各組方案而定。六、實(shí)驗(yàn)步驟1. 自行查閱相關(guān)資料確定試驗(yàn)植物種類，提出擬解決的問題2. 分組 (46人/組) 設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案3. 教師審閱方案，提出修改意見，返回學(xué)生修改4. 準(zhǔn)備培養(yǎng)基及接種用具5. 依試驗(yàn)方案進(jìn)行外植體處理和接種培養(yǎng)6. 通過分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果確立最佳快繁方案七、結(jié)果與分析1. 統(tǒng)計(jì)全組數(shù)據(jù)，比較分析不同處理的快繁效果

26、，提出最佳方案2. 分析試驗(yàn)可能存在的問題及待改進(jìn)之處實(shí)驗(yàn)3幾種植物快速無性繁殖方案的探索附件1試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)要求1. 分組自行查閱相關(guān)資料，確定試驗(yàn)植物種類，提出擬解決的問題 有代表性地選擇經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、自然繁殖力低、珍稀瀕危、需脫除病毒等有快繁必要的植物種類，花卉、林木、果蔬均可。 文獻(xiàn)查閱途徑：電子期刊（中國(guó)學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)，ElsevierSDOS, National Library of Medicine, Highwire, Kluwer Online, Springer Link 等可免費(fèi)查閱全文）、圖書資料等。 2. 分組(46人/組)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子包括不同外植體、不同激素

27、組合、不同添加物等。濃度梯度宜設(shè)計(jì)為等差或等比數(shù)列。3. 教師審閱方案后再行實(shí)施4. 通過分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果確立最佳快繁方案。提交方案應(yīng)包括以下內(nèi)容：1. 所用植物種類及其快繁的意義2. 對(duì)查閱的相關(guān)研究文獻(xiàn)做一簡(jiǎn)要的綜述，并正確引用參考文獻(xiàn)3. 根據(jù)文獻(xiàn)分析結(jié)果確立所要研究的因子4. 培養(yǎng)基配方5. 試驗(yàn)規(guī)模：培養(yǎng)基用量及瓶數(shù)、植物材料用量6. 所需特殊試劑或有機(jī)添加物（常用激素及化學(xué)試劑不必列出，如需用到特殊的試劑要提前告知教師準(zhǔn)備；椰子汁、馬鈴薯汁或其它水果類有機(jī)添加物，需學(xué)生自行購(gòu)買和制備，費(fèi)用可報(bào)銷。）7. 試驗(yàn)用具：如培養(yǎng)瓶、無菌培養(yǎng)皿、解剖刀等8. 預(yù)期結(jié)果9. 按規(guī)范格式列出所

28、引用的參考文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)3幾種植物快速無性繁殖方案的探索附件2：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范例紅 掌 的 快 速 無 性 繁 殖02生物技術(shù)（基地班）第二組：黃翠顏 蔣臻 賴宇雄 李利佳 勞承杏E-mail: laiyuxiong163前 言：紅掌（Anthurium scherzerianum）又名火鶴,花燭。是天南星科花燭屬多年生常綠草本植物。原產(chǎn)于南美洲熱帶雨林，性喜陰蔽，濕潤(rùn)。紅掌葉為長(zhǎng)柄，單生，心型，鮮綠色，葉脈凹陷。單花頂生，花梗細(xì)長(zhǎng)約40-70厘米，挺直,其佛焰苞為心型，平直展開，鮮紅有光澤。其真正的花卻不顯眼，是其苞片中抽出的圓柱形的肉穗花序，花序淡黃直立的，略向前傾， 就好像一支小蠟燭。紅掌花型獨(dú)特

29、，佛焰苞明艷華麗，色彩豐富變化，而且花期長(zhǎng)，四季開花不斷，作為切花材料輕巧耐運(yùn)輸，瓶插壽命很長(zhǎng)，水養(yǎng)期可達(dá)一個(gè)月。紅掌為目前世界上流行的觀賞花卉,已成為僅次于熱帶蘭的第二宗熱帶花卉商品。紅掌繁殖以分株為主，有時(shí)也用扦插等方法，但繁殖速度慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)的需要。采用組織培養(yǎng)可以加速其繁殖速度，而且成本也較低。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^不同激素組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行無性快速繁殖效率的比較，確立紅掌組培的最佳快繁方案。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理：目前，紅掌種苗生產(chǎn)主要通過組織培養(yǎng)進(jìn)行種苗的快速繁殖，也可以被認(rèn)為是紅掌的克隆技術(shù)。這樣就可以在較短的時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出整齊一致的優(yōu)質(zhì)種苗，適應(yīng)生產(chǎn)的需要。通過組織培養(yǎng)的技術(shù)生產(chǎn)

30、紅掌種苗的技術(shù)可以分為愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽的誘導(dǎo)、壯苗生根、移栽和室溫育苗等技術(shù)環(huán)節(jié)。紅掌的組織培養(yǎng)中可以選取的外植體部位有：莖尖、莖段、幼嫩葉片和葉柄等。不同的外植體誘導(dǎo)再生的能力（即誘導(dǎo)率）及途徑是不同的：用莖尖或芽培養(yǎng)可以直接誘導(dǎo)不定芽或側(cè)芽的發(fā)生，可以不斷增殖，以達(dá)到培養(yǎng)種苗的目的；而對(duì)于葉片、葉柄及莖段的培養(yǎng)則先是誘導(dǎo)其形成愈傷組織，再誘導(dǎo)使之產(chǎn)生不定芽。由大量對(duì)紅掌的組織培養(yǎng)可知，對(duì)于需要先誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的外植體來說，不同外植體的誘導(dǎo)效果是：莖段>葉片>葉柄。本實(shí)驗(yàn)選取莖尖及莖段分別對(duì)紅掌組織進(jìn)行組培。由于紅掌愈傷組織的誘導(dǎo)過程對(duì)大量元素的需求較低，因而實(shí)驗(yàn)中易選用

31、1/2MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基（適當(dāng)降低NH4NO3濃度有利于愈傷組織形成及芽分化）。另外，激素對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)以及不定芽的分化起著較為重要的調(diào)節(jié)作用。其中又以生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素(如：IAA,NAA,2,4-D以及6-BA,KT及2-ip等)對(duì)紅掌組織的誘導(dǎo)和分化影響較為明顯，其中IAA，NAA可以誘導(dǎo)離體胚芽鞘或幼莖生長(zhǎng)（實(shí)驗(yàn)資料顯示：NAA對(duì)芽的誘導(dǎo)效果較IAA好）；6-BA和KT對(duì)愈傷組織及芽的分化也有一定的效果，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞分裂也較為有效；2,4-D是愈傷組織誘導(dǎo)的主要因子（可以配合KT使用）。 因此，實(shí)驗(yàn)中以這幾種激素的不同濃度配比進(jìn)行組培(各因子濃度設(shè)置為等差)。此外，培養(yǎng)時(shí)還應(yīng)向

32、培養(yǎng)基中添加蔗糖等物質(zhì)以提供碳源。三、實(shí)驗(yàn)材料： 生命科學(xué)學(xué)院植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室提供的紅掌無菌試管苗。四、儀器設(shè)備及用具：（一） 儀器設(shè)備：精度0.1 mg電子天平 超凈工作臺(tái) 高壓鍋 酸度計(jì) 磁力攪拌器 電動(dòng)引力器 過濾器 玻璃蒸餾水器 普通冰箱 微波爐（二） 用具：三角瓶（100mL）54個(gè)，酒精燈一臺(tái)，濾紙若干，燒杯1000mL（2個(gè)）、500mL（2個(gè)）、100mL（9個(gè)）、50mL （2個(gè)），量筒1000mL、500mL、200mL、100mL、50mL各1，無菌操作臺(tái)，移液槍（能移25微升），解剖刀5把，鋁碟5個(gè)，槍形鑷10把，酸度計(jì)、分析天平（0.001g）、磁力攪拌器，高壓滅菌

33、鍋等五、實(shí)驗(yàn)方案：母液配制： MS大量元素母液：按培養(yǎng)基配方所列大量元素成分（NH4NO3400mg/L），將1L培養(yǎng)基所需各種大量元素?cái)U(kuò)大5倍，定容到100 mL，貼好標(biāo)簽，冰箱保存。 MS微量元素母液：按培養(yǎng)基配方所列微量元素成分，將1L培養(yǎng)基所需各種微量元素?cái)U(kuò)大50倍，定容到50 mL ，貼好標(biāo)簽，冰箱保存。 MS有機(jī)元素母液：按培養(yǎng)基配方所列有機(jī)成分，將1L培養(yǎng)基所需各種有機(jī)元素?cái)U(kuò)大50倍，定容到50 mL，貼好標(biāo)簽，冰箱保存。 鐵鹽母液：按培養(yǎng)基配方FeSO4·7H2O EDTA-NA2·2H2O含量擴(kuò)大5倍，定容到50 mL ，貼好標(biāo)簽，冰箱保存。愈傷組織的誘導(dǎo)

34、：表1. 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素含量正交試驗(yàn)的因素及水平 因 素水 平6-BA(mg/L)2,4-D(mg/L)NAA(mg/L)10.50.00.021.00.10.131.50.20.2培養(yǎng)基配方：1/2MS（僅大量元素減半，其余成分為全量）+ 1.0mg/L KT + 6-BA（以上各濃度）+ NAA (以上各濃度) +2,4-D(以上各濃度) 瓊脂7g/L， 蔗糖30g/L, pH5.7, 共3因子3水平， 每種組合各3個(gè)重復(fù)， 每瓶培養(yǎng)基50mL，共配27瓶。正交試驗(yàn)表：表2. 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)方案表L9(34)：（均有1/2MS, 1.0mg/L KT, 30g/L蔗糖

35、）因 素培養(yǎng)基代號(hào) 6-BA(mg/L)2,4-D(mg/L)NAA(mg/L)A10.50.00.0B10.50.10.1C10.50.20.2D11.00.00.1E11.00.10.2F11.00.20.0G11.50.00.2H11.50.10.0I11.50.20.1操作步驟：1> 配制1/2MS基本培養(yǎng)基：取MS大量元素母液(50x)15mL、 微量元素母液（鐵鹽除外）(1000x)1.5mL、 有機(jī)成分母液（蔗糖及肌醇除外）(1000x)1.5mL、 Fe鹽母液（含Na-EDTA）（100x）15mL、 肌醇150mg, 蔗糖45g, KT1.5mg， 溶解定容1500mL

36、，調(diào)pH至5.8，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入合適容器加入瓊脂粉10.5g，高壓滅菌。另取30個(gè)廣口瓶及9個(gè)250mL三角瓶滅菌備用。2> 趁熱搖勻培養(yǎng)基，依次各取150mL培養(yǎng)基裝入無菌的250mL三角瓶，再按上邊所列正交表經(jīng)換算后加入各激素，混勻, 趁熱分裝入3個(gè)無菌廣口瓶（50mL/瓶），冷卻待用。3> 取材：切取紅掌無菌苗莖部中間段約0.6cm作為外植體。4> 每瓶放置10個(gè)莖段進(jìn)行培養(yǎng)，每周觀察一次，做好記錄，并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。六、預(yù)期結(jié)果根據(jù)小組各成員查閱相關(guān)文獻(xiàn)并討論，推測(cè)合理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)該是：（1） 莖段誘導(dǎo)愈傷組織經(jīng)過4045天的培養(yǎng)應(yīng)該可以看到明顯的結(jié)果，且在此過程中可以

37、觀察到一系列的變化。（2） 預(yù)測(cè)培養(yǎng)基最佳激素組合為6-BA1.0mg/L + NAA0.5 mg/L + 2，4-D0.1 mg/L 但以上結(jié)果只是預(yù)測(cè)而已，不能影響實(shí)際的培養(yǎng)狀態(tài)和實(shí)際統(tǒng)計(jì)情況，一切以實(shí)踐結(jié)果為準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)（略）正確列出文獻(xiàn)的格式：前3名作者姓名. 年份. 題名. 期刊名，卷（期）：頁(yè)碼。如：胡國(guó)成，肖晗，于永紅等. 2000. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗除草劑基因轉(zhuǎn)入兩系雜交稻恢復(fù)系的研究. 應(yīng)用環(huán)境生物學(xué)報(bào), 6(6): 511-515.實(shí)驗(yàn)四微莖尖脫毒培養(yǎng)一、目的學(xué)習(xí)微莖尖培養(yǎng)脫病毒技術(shù)二、原理植物病毒在被感染植物內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散包括三個(gè)步驟。首先，病毒從最先感染的細(xì)胞通過細(xì)胞間傳

38、播侵入相鄰的細(xì)胞；第二，病毒進(jìn)入維管束組織而進(jìn)行長(zhǎng)距離的擴(kuò)散，以便感染整株植物；第三，病毒從維管束運(yùn)動(dòng)出來再進(jìn)入非維管束組織，通過細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)感染整個(gè)植株。植物的莖尖分生區(qū)域內(nèi)由于無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞分裂的生長(zhǎng)速度。因此，在生長(zhǎng)點(diǎn)區(qū)域病毒的數(shù)量極少。在進(jìn)行莖尖培養(yǎng)時(shí)，切取的莖尖越小，帶病毒的可能性就越小，但太小則不易成活。就不同種類的植物和不同的病毒而言，切取莖尖的大小亦不同，一般長(zhǎng)度不超過0.20.5mm。植株在切取微莖尖培養(yǎng)之前，如果能結(jié)合使用物理療法（如熱處理植株使病毒部分鈍化）或化學(xué)療法（如采用抗病毒藥物抑制植物體內(nèi)的病毒），則脫毒效果會(huì)更好。具體選用哪種方法要

39、視目標(biāo)病毒的種類和特性而定。用于大田生產(chǎn)的脫毒苗，每株原種種苗都必須經(jīng)過病毒檢定，證明確已脫除目標(biāo)病毒，才能進(jìn)行大量繁殖。微莖尖培養(yǎng)生產(chǎn)無毒苗的程序如下：三、實(shí)驗(yàn)材料香蕉試管苗或其他植物材料四、儀器設(shè)備及用具（一）儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)立體解剖鏡 高壓滅菌鍋 電子天平 酸度計(jì) 培養(yǎng)室（二）用具（2人小組用量）無菌培養(yǎng)皿：9cm×2（每皿內(nèi)墊濾紙1張）無菌刀片：4片（放在墊有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)滅菌）刀柄：×2槍形攝：×2解剖針：×2手術(shù)剪：×2無菌三角瓶：100mL×1廢液缸：1五、試劑及培養(yǎng)基（一）試劑75%酒精 0.5%NaClO 1% N

40、aClO 無菌水（每2人組1瓶，300mL）（二）培養(yǎng)基MSBA 5mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖 30g/L十瓊脂8g/L， pH5.8六、實(shí)驗(yàn)步驟1. 材料消毒（以無菌苗做材料可免）依次剝?nèi)ブ参锏娜~鞘，取出整個(gè)生長(zhǎng)錐 75%酒精表面消毒約15s 棄酒精，加入1% NaClO浸泡10 min，不時(shí)搖動(dòng) 取出材料，在濾紙上剝?nèi)蓪佑兹~ 0.5% NaClO 浸泡5 min 無菌水洗4次 吸干水分2. 剝?nèi)∥⑶o尖及接種在超凈工作臺(tái)內(nèi)，借助立體解剖鏡，用解剖刀和解剖針將生長(zhǎng)點(diǎn)周圍的幼葉及葉原基逐個(gè)剝?nèi)?，用解剖針挑取生長(zhǎng)點(diǎn)（0.2-0.5mm長(zhǎng)）接種至培養(yǎng)基。每人剝?nèi)?020個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，分接為

41、3瓶。3. 培養(yǎng)起始培養(yǎng)為防止褐變，采用弱光照，300Lux，光周期1012h。一個(gè)月后光強(qiáng)改為2000Lux，光周期1012h。培養(yǎng)溫度25。4. 脫毒效果檢查根據(jù)所要脫除的病毒的不同形態(tài)或特性，利用電鏡撿測(cè)或其他方法檢測(cè)七、思考1. 植物病毒的運(yùn)動(dòng)與擴(kuò)散機(jī)制與動(dòng)物病毒相比有何特點(diǎn)？2. 組培脫毒苗種植到大田后仍有可能重新感染病毒，你認(rèn)為應(yīng)采取哪些措施才能合理利用脫毒苗？實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)一目的了解植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程，掌握懸浮系起始建立和繼代保持的方法二原理20世紀(jì)50年代，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞在液體培養(yǎng)基上的分裂速度，比在固體培養(yǎng)基上的要快得多。后來，在液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來了

42、一種新的培養(yǎng)技術(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。此項(xiàng)技術(shù)發(fā)展很快，目前已發(fā)展到全自動(dòng)控制的大容積發(fā)酵罐的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的連續(xù)培養(yǎng)。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)即植物單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中于搖床上振蕩培養(yǎng)。由于不停振蕩容易打斷細(xì)胞之間的聯(lián)系，使增殖細(xì)胞脫落下來，并且處于理化環(huán)境均一的液體培養(yǎng)基中，有害物質(zhì)不易積累，因而可以獲得快速增殖的（細(xì)胞量23d 增加一倍）、分散性好、均一性好（細(xì)胞形狀和大小基本相同，細(xì)胞等徑，細(xì)胞質(zhì)濃密）的小細(xì)胞團(tuán)，并保持培養(yǎng)基清澈透亮。懸浮培養(yǎng)還可以增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，并適當(dāng)改善氣體的交換。在懸浮培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)目會(huì)發(fā)生不斷變化。密閉系統(tǒng)中植物懸浮細(xì)胞呈現(xiàn)“S”型生

43、長(zhǎng)曲線，可分為4個(gè)時(shí)期：滯后期、指數(shù)生長(zhǎng)期、線性生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期（見下圖）。初期生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞很少分裂，細(xì)胞數(shù)增加不多；中期生長(zhǎng)最快，細(xì)胞數(shù)目迅速增加，增長(zhǎng)速率保持不變；隨后由于養(yǎng)分供應(yīng)差和代謝物積累，環(huán)境惡化，細(xì)胞分裂生長(zhǎng)減慢；最后養(yǎng)分基本耗盡，有害代謝物積累，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。長(zhǎng)期處于這個(gè)時(shí)期的細(xì)胞往往會(huì)出現(xiàn)死亡和生活力下降，從而影響整個(gè)懸浮細(xì)胞系的狀態(tài)。因此，在通常情況下，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入減緩期時(shí)就要及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，即繼代培養(yǎng)，這樣懸浮細(xì)胞可以保持處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的良好狀態(tài)。每次繼代時(shí)均要進(jìn)行選擇，篩選生活力好的細(xì)胞繼代，淘汰過大和生理狀態(tài)不好的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)。圖1密閉系統(tǒng)中植物懸浮細(xì)胞的

44、生長(zhǎng)曲線模型胚性懸浮細(xì)胞系是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和獲得有活力的原生質(zhì)體的最適材料。通常采用胚性愈傷組織建立優(yōu)質(zhì)的胚性懸浮細(xì)胞系，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，懸浮細(xì)胞通常會(huì)喪失胚性，這時(shí)把懸浮細(xì)胞重新轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上，再次選擇具有再生能力的顆粒狀胚性愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，這樣有助于保持懸浮系的胚性。正因具備上述優(yōu)點(diǎn)，所以植物懸浮培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用相當(dāng)廣泛，可用于植物細(xì)胞生理、酶學(xué)、細(xì)胞周期、原生質(zhì)體培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生及次生代謝物生產(chǎn)等各方面的研究。三實(shí)驗(yàn)材料水稻愈傷組織四儀器設(shè)備及用具（一）儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái) 搖床 pH計(jì) 磁力攪拌器 全自動(dòng)高壓滅菌器（二）用具（每2人組用量）無菌刻度粗吸管（10mL）4支

45、無菌槍形鑷4把 手動(dòng)吸管泵1個(gè)五培養(yǎng)基N6（液體，含2,4-D 4 mg/L），pH5.8，25mL/瓶，2瓶/人六實(shí)驗(yàn)步驟1. 愈傷組織的誘導(dǎo)：見實(shí)驗(yàn)二。2懸浮細(xì)胞系的起始建立：挑選分散性好、致密、鮮黃色或乳白色、生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，放入N6液體培養(yǎng)基，用鑷子輕輕夾碎愈傷組織（注意不要損傷愈傷組織）。每瓶接入約2g愈傷組織。置于100rpm弱散射光下振蕩培養(yǎng)。3懸浮系的繼代與選擇：用手動(dòng)吸管泵吸取己建立的懸浮系的細(xì)胞小顆粒懸液，吐出培養(yǎng)液，保留2mL壓縮體積的細(xì)胞，轉(zhuǎn)至25mL新鮮培養(yǎng)液中。培養(yǎng)條件同2。每人2瓶。最初幾代要勤換培養(yǎng)液，以防止褐化，一般3d左右更換一次新鮮培養(yǎng)基。2w后即可恢

46、復(fù)正常，即1w更換一次新鮮培養(yǎng)基。每次繼代，要用寬口吸管或一定孔徑的細(xì)胞篩來選擇細(xì)胞團(tuán)，留下生長(zhǎng)旺盛的小細(xì)胞團(tuán)，棄去大的細(xì)胞團(tuán)。如此反復(fù)多代選擇，才能建立較理想的懸浮系。4生長(zhǎng)量測(cè)定：取一瓶生長(zhǎng)1w的懸浮系，用吸管泵吸出所有細(xì)胞，測(cè)量其壓縮細(xì)胞體積（pcv），計(jì)算1w的增長(zhǎng)量： 1w后的pcv 初始pcv×100初始 pcv七思考1植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可用于哪些領(lǐng)域？2一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須具備哪幾個(gè)條件？3在懸浮細(xì)胞系的建立和繼代過程中你都遇到了哪些問題，是如何解決的？綜合性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)六 植物原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)一目的掌握原生質(zhì)體游離與培養(yǎng)的方法、細(xì)胞活力與密度的測(cè)定方法；觀察原生

47、質(zhì)體培養(yǎng)過程中細(xì)胞壁的再生、細(xì)胞分裂、愈傷組織形成與植株再生二原理植物原生質(zhì)體(protoplast)是除去細(xì)胞壁后被原生質(zhì)膜所包圍的“裸露細(xì)胞”，是開展基礎(chǔ)研究的理想材料。原生質(zhì)體在離體培養(yǎng)條件下能夠再生細(xì)胞壁，繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂，形成愈傷組織，經(jīng)誘導(dǎo)分化再生成完整植株，即實(shí)現(xiàn)從原生質(zhì)體到完整植株的克隆。一般用酶解去壁法獲得原生質(zhì)體。細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁，獲得原生質(zhì)體。由于去除了細(xì)胞壁，原生質(zhì)體對(duì)滲透壓的改變非常敏感，故必須將其保持在等滲的溶液中，外界滲透壓過高和過低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的破裂。細(xì)胞壁再生后應(yīng)逐步降低滲透壓，以利于細(xì)胞

48、生長(zhǎng)和增殖。理論上，各種植物組織都可用來產(chǎn)生原生質(zhì)體。在實(shí)際操作中，具有薄的表皮的組織（如葉肉細(xì)胞）最適合作為原生質(zhì)體制備的材料。也可以用懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞游離原生質(zhì)體。測(cè)定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯（FDA）染色是常用的一種方法。FDA本身無熒光、無極性，可自由透過原生質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，受活細(xì)胞內(nèi)酯酶的分解而產(chǎn)生有熒光的極性物質(zhì)熒光素，它不能自由出入原生質(zhì)膜，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)熒光者為活細(xì)胞，否則為死細(xì)胞。原生質(zhì)體培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分和培養(yǎng)環(huán)境的要求較嚴(yán)，需設(shè)計(jì)特殊的培養(yǎng)基（見附錄4），并采用特殊的培養(yǎng)方法，如飼養(yǎng)培養(yǎng)、淺層培養(yǎng)等。起始培養(yǎng)密度也有一定要求，一般為105個(gè)原生質(zhì)體/mL培

49、養(yǎng)基，密度過高或過低都不利于原生質(zhì)體的生長(zhǎng)。三實(shí)驗(yàn)材料成熟疏菜或花卉葉片水稻懸浮細(xì)胞系四儀器設(shè)備及用具（一）儀器設(shè)備 超凈工作臺(tái) 普通搖床 桌式小搖床 水平低速離心機(jī) 恒溫水浴鍋 熒光倒置顯微鏡 電子天平 磁力攪拌器 pH計(jì) 電動(dòng)吸引器微孔濾器及濾膜 全自動(dòng)高壓滅菌器 移液槍（二）用具（每2人組用量）一個(gè)鋁飯盒內(nèi)裝入：移液管(5mL)若干 離心管(10mL)10支 培養(yǎng)皿(3.5cm)6個(gè)另外：培養(yǎng)皿(9cm)2個(gè) 細(xì)胞篩及漏斗(250/320/500目) 2套 三角瓶(50mL)2個(gè) 手術(shù)刀片1片（以上用具需高壓滅菌）鐘表鑷2把 血球計(jì)數(shù)板1塊 細(xì)胞計(jì)數(shù)器1個(gè) 石蠟?zāi)ぃ╬arafilm）若干

50、五試劑1CPW（洗液）：高壓滅菌，配方見附錄4，50mL組2酶液：酶液I（水稻懸浮細(xì)胞用）：Cellulase Onozuka RS 1% Pectolyase Y-23 0.1%酶液II（葉片用）：Cellulase onozuka R101% Macerozyme R100.2%冰浴下溶于CPW，調(diào)pH至5.7，抽濾除菌，置于9cm培養(yǎng)皿，10mL/人3無菌水（pH5.7）4FDA母液：50mg FDA溶于100 mL丙酮，貯于冰箱50.l%HgC12六培養(yǎng)基（KPR配方見附錄4，NT培養(yǎng)基為煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)專用，見附錄1）12×KPR，抽濾除菌。50 mL組。2KPR：上述2&

51、#215;KPR與等體積的pH5.7的無菌水混合制得。60mL組。31.6%瓊脂，高壓滅菌。10mL組。4低滲KPR（含葡萄糖0.25molL），抽濾除菌。5原生質(zhì)體愈傷組織增殖培養(yǎng)基（單位mg/L）：N6十谷氨酸胺100十水解乳蛋白2002,4-D 0.56-BA0.56分化培養(yǎng)基（單位mg/L）：N6CuSO4·5H2O l.25BA2NAA l七實(shí)驗(yàn)步驟1葉片表面消毒（如果植物材料為懸浮細(xì)胞則無需此步）取成熟展開的葉片，自來水洗凈后，于超凈臺(tái)中操作70%酒精10s 無菌水洗1次 0.1%HgCl2浸10min 無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干水分2酶解（酶解溫度約26）葉 片：將表

52、面消毒后的葉片用無菌手術(shù)刀片切成12mm寬的細(xì)絲，完全浸沒于酶液，培養(yǎng)皿用parafilm封口，放入暗盒。桌式小搖床100rpm 34h。懸浮細(xì)胞：吸取 1mL pcv的懸浮細(xì)胞（約 1g），完全浸沒于酶液，培養(yǎng)皿用parafilm封好，放入暗盒，桌式小搖床100rpm過夜（約16h）。3鏡檢酶解效果將上述培養(yǎng)皿放在倒置顯微鏡下，觀察原生質(zhì)體游離的數(shù)量與質(zhì)量。4過篩：輕輕搖動(dòng)酶液，用吸管吸取酶解產(chǎn)物依次通過250目十320目（500目）的兩層細(xì)胞篩過濾，使濾液流入離心管。5離心收集 800rpm離心5min，棄上清。6洗滌及純化用吸管加入CPW洗液5mL小心重新懸浮 800rpm離心6min

53、去上清 重復(fù)上述過程一次 加KPR培養(yǎng)基5mL重懸 800rpm離心6min 去上清7原生質(zhì)體活力及密度測(cè)定制備原生質(zhì)體懸浮液：上述沉淀加入5mL KPR，制成原生質(zhì)體懸浮液制備FDA混合液：2.0mL KPR加入10L FDA母液反應(yīng)：取180L FDA混合液，加20L原生質(zhì)體懸浮液，在小離心管中反應(yīng)5min原生質(zhì)體活力測(cè)定：上述反應(yīng)液充分混勻，滴加于血球計(jì)數(shù)板上，熒光顯微鏡觀察原生質(zhì)體活力百分率：發(fā)熒光原生質(zhì)體數(shù)×100觀察原生質(zhì)體總數(shù)原生質(zhì)體數(shù)目統(tǒng)計(jì)：將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，蓋上蓋片，將原生質(zhì)體懸浮液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。計(jì)數(shù)板每個(gè)大格為1m

54、m2區(qū)域，計(jì)算四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的，然后按下式計(jì)算原生質(zhì)體平均密度：細(xì)胞數(shù)/mL（4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4）×1048原生質(zhì)體熱激原生質(zhì)體懸浮液，45水浴5min，冰浴10s，800rpm離心6min，棄上清9培養(yǎng)與觀察上述剩余的原生質(zhì)體懸浮液800rpm離心5min 棄上清 加入等體積2KPR與預(yù)熔的1.6%瓊脂（45）迅速混勻（調(diào)整最終培養(yǎng)密度為105/mL）分裝于3.5cm培養(yǎng)皿制成平板（每皿1.5mL）parafilm密封26暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5d后在倒置顯微鏡下觀察原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生和細(xì)胞分裂情況。3w后統(tǒng)計(jì)分裂頻率：分裂的原生質(zhì)體數(shù)×100觀察原生質(zhì)體總數(shù)3w后分割包理塊，置于低滲KPR培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以促進(jìn)細(xì)胞增殖，待愈傷長(zhǎng)至肉眼可見時(shí)轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基。愈傷長(zhǎng)至1.52mm大小時(shí)，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)， 1個(gè)月后觀察植株再生情況。八思考1試分析原生質(zhì)體游離時(shí)各成分的作用。2滲透壓對(duì)于原生質(zhì)體游離和培養(yǎng)的各個(gè)階段有何作用？3在原生質(zhì)體操作的各個(gè)環(huán)節(jié)如何避免污染？4用葉片游離原生質(zhì)體時(shí)為什么需要將葉片切成小片？綜合性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)七植物細(xì)胞融合（化學(xué)法）一目的學(xué)習(xí)掌握誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的技術(shù)方法，了解植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的原理和意義二原理通過原生質(zhì)體融合可實(shí)現(xiàn)植物體細(xì)胞雜交，它能克服遠(yuǎn)緣雜交有