PCR污染的產(chǎn)生及防治

1、PCR污染的產(chǎn)生及防治污染的產(chǎn)生及防治PCR實驗室污染的特點實驗室污染的特點 概念：由于各種原因，造成的PCR 擴增體系中出現(xiàn)了非目的檢測樣本本身的模板，使得PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽性。 PCR實驗室的污染不同于一般生物安全實驗室的污染 PCR污染總是產(chǎn)生假陽性結(jié)果PCR流程流程 樣品準備（sample preparation） 反應(yīng)體系配置（PCR reaction assembly） PCR反應(yīng)（PCR execution） 反應(yīng)后分析（post-PCR analysis）PCR污染的途徑污染的途徑 操作錯誤或者誤差造成的樣品間交差污染 PCR試劑的污染 PCR實驗器材的污染 氣溶膠（Ampli

2、con Aerosol）PCR污染的四種來源污染的四種來源 標本或模板間的交叉污染 PCR試劑的污染 PCR擴增產(chǎn)物的污染 實驗室克隆質(zhì)粒的污染 引起引起PCR污染的原因污染的原因 標本或模板間交叉污染 容器被污染容器被污染標本或模板放置時標本或模板放置時, 由于密封不嚴溢于容器外由于密封不嚴溢于容器外容器外粘有模板而造成相互間交叉污染容器外粘有模板而造成相互間交叉污染標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染模板吸取過程中模板吸取過程中, 因氣溶膠（因氣溶膠（aerosol）或其他原因引起移液器）或其他原因引起移液器污染，從而

3、導致交叉污染污染，從而導致交叉污染有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染導致彼此間的污染引起引起PCR污染的原因污染的原因PCR試劑污染 PCR 試劑配制過程中, 移液器、容器、水及其他溶液等原因造成試劑被PCR 核酸模板污染。引起引起PCR污染的原因污染的原因PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染-最主要最常見最主要最常見PCR 產(chǎn)物拷貝量大產(chǎn)物拷貝量大(一般為一般為1013拷貝拷貝/ml) ，遠遠高于，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限。檢測數(shù)個拷貝的極限。極微量的極微量的PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染, 就可形成假陽性。就可形成

4、假陽性。移液器吸取移液器吸取PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，同一支移液器去準備產(chǎn)物進行電泳檢測，同一支移液器去準備PCR mixPCR產(chǎn)物的氣溶膠污染：據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊a(chǎn)物的氣溶膠污染：據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題的污染是一個值得特別重視的問題.氣溶膠（aerosol）：懸浮于氣體介質(zhì)中粒徑一般為 0.001m1000m的固體、液體微小粒子形成的膠溶狀態(tài)散體系?？諝馀c液體面摩擦時就可形成氣溶膠, 在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管, 開蓋時、吸樣時及移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠引起引起PCR污染的原因污染的原因?qū)嶒炇抑锌寺≠|(zhì)粒

5、的污染 在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見 克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量濃度高, 另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大PCR污染的監(jiān)測污染的監(jiān)測 一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染，是什么原因造成的污染，以便考慮有無污染，是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染采取措施，防止和消除污染. PCR強大擴增能力+檢測的敏感性經(jīng)30個周期后，特定DNA片段的數(shù)量在理論上可增加109倍極微量的污染便可導致假陽性，尤其

6、對定量造成很大的問題NTC (No Template Control):必須設(shè)置一個不含模板DNA但含有PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應(yīng)。 對照試驗 1.陽性對照:它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大，操作時需注意防止交叉污染。 2.陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照，它包括 陰性標本對照（NTC）:被檢的標本是血清，就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。 試劑空白對照（Blank）:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR

7、擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。 3.重復(fù)性試驗 4.選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增 污染的預(yù)防 進行PCR操作時，操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。 主要涉及： （1）劃分操作區(qū) （2）分裝試劑 （3）實驗操作注意事項 劃分操作區(qū)理想的劃分操作區(qū)理想的PCR實驗室分區(qū)實驗室分區(qū)污染的預(yù)防 分裝試劑分裝試劑PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA。無污染的試驗器材無污染的消耗品PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無

8、PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制。引物和dNTP應(yīng)分裝儲存，分裝時應(yīng)標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。污染的預(yù)防 實驗操作注意事項實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1.在準備樣品時，著清潔的工作服和手套，切忌著已污染過PCR產(chǎn)物的工作服和手套； 2.戴一次性手套，發(fā)現(xiàn)手套有污染時應(yīng)立即更換手套；實驗完成后離開所工作場所時，脫掉手套，放置在專用垃圾桶中； 3. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 4.

9、準備專供自己使用的PCR試劑，分裝為小份。不要與樣品存放在一起；污染的預(yù)防 實驗操作注意事項實驗操作注意事項 5. 開管動作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；所有含質(zhì)粒模板和PCR產(chǎn)物的EP管開蓋前高速離心1-3分鐘； 6. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 7. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性； 8. 由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加

10、樣器不能拿到其它兩個區(qū)； 污染的預(yù)防 實驗操作注意事項實驗操作注意事項 9.禁止把PCR產(chǎn)物帶到配制PCR體系的場所；禁止在配制PCR體系的場所操作質(zhì)粒和含克隆質(zhì)粒的菌液； 10.在從有蓋的容器中取樣時，把蓋子拿在手中，或者確保它放到清潔和不會污染周圍環(huán)境的地方。 11.盡量保證反應(yīng)體系和試劑在一個密封的容器中； 12.PCR反應(yīng)完成后，盡量減少打開密封反應(yīng)體系的機會；如必須打開，應(yīng)在獨立專用房間內(nèi)打開； 13.實驗結(jié)束后或定期清潔工作臺面和儀器。 污染的預(yù)防移液器操作移液器操作移液器操作移液器操作由于操作時不慎將模板吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣時要十分小心。1）準備PCR的

11、移液器專用2）吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成噴霧，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。3）最好在加完所有其他反應(yīng)成分后才吸加模板。4）推薦在準備PCR過程中使用濾芯槍頭污染的預(yù)防 首要原則首要原則 永遠要設(shè)置NTC對照 如果不能在污染出現(xiàn)的第一時間發(fā)現(xiàn)，會導致嚴重的后果：一大段時間的數(shù)據(jù)不可信 準備PCR的移液器要專用 千萬不能用吸取PCR產(chǎn)物/克隆質(zhì)粒的移液器去準備PCR 體系追蹤污染源設(shè)立陰陽性對照 有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。 選擇陽性對照時，應(yīng)選擇擴增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。 此外，每次擴增均應(yīng)包括

12、PCR體系中各試劑的時機對照，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。追蹤污染源環(huán)境污染 在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴密，則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的污染源主要有：1. 加樣器；2. 電泳裝置；3. 切膠用刀或手術(shù)刀片；4. 離心機；5. 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒炁_面等；6. 氣溶膠。 選用含選用含UNGUNG（尿嘧（尿嘧啶啶DNADNA糖基酶糖基酶 Uracil-N-Uracil-N-Glycosylase)Glycosylase)的試的試劑，有助于防止劑，有助于防止PCRPCR產(chǎn)物引起的污產(chǎn)物引起的污染。染。UNGUNG：5050攝氏度，攝氏度，2 2分分鐘，作用于含有鐘，作用于含有dUdU的的DNADNA雙鏈或單鏈雙鏈或單鏈然后開始然后開始PCRPCR反應(yīng)的預(yù)反應(yīng)的預(yù)變性步驟，同時變性步驟，同時UNGUNG失活失活使用使用UNG酶控制污染酶控制污染對于不含dU的PCR產(chǎn)物無效污染處理反應(yīng)液污染 問題：問題： PCR產(chǎn)物越長，該