微小核糖核酸—21反義寡核苷酸對人舌鱗癌細(xì)胞生長抑制體內(nèi)探究

1、微小核糖核酸一21反義寡核昔酸對人舌鱗癌細(xì)胞生長抑制體內(nèi)探究摘要目的研究微小核糖核酸-21 (mir-21)反義寡核 昔酸(as-mir-21)對人舌鱗癌生長的抑制作用。方法采用 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pgl6熒光素酶報告基因質(zhì)粒的舌鱗癌細(xì)胞 tca8113-luc接種裸鼠，建立移植瘤動物模型，瘤體內(nèi)注射 as-mir-21 ,應(yīng)用活體成像和tunel等實驗技術(shù)進(jìn)行 as-mir-21對人舌鱗癌細(xì)胞系生長抑制的體內(nèi)研究。結(jié)果 通 過轉(zhuǎn)染pgl6熒光素酶報告基因質(zhì)粒構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)熒光素 酶活性的tca8113-luc細(xì)胞株。裸鼠皮下荷瘤模型成瘤率高, 腫瘤生長穩(wěn)定。在瘤體內(nèi)注射as-mir-21后腫瘤生長減慢

2、， 活體成像中光子數(shù)偏低，腫瘤標(biāo)本中壞死灶少見，細(xì)胞核變 小，染色變淺，異型性減低，新生血管數(shù)減少。腫瘤組織中 mir-21表達(dá)明顯下降，凋亡指數(shù)升高。結(jié)論腫瘤內(nèi)注射 as-mir-21可以降低舌鱗癌細(xì)胞中mir-21的表達(dá)，促進(jìn)舌鱗 癌腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長。關(guān)鍵詞舌鱗癌；微小核糖核酸-21；微小核糖核酸 -21反義寡核昔酸；基因治療；活體成像中圖分類號r 739. 86 文獻(xiàn)標(biāo)志碼a doi 10. 3969/j. issn. 1000-1182. 2012.06.002靶向微小核糖核酸-21 (micro ribonucleic acid-21, mir-21)的反義寡核昔酸可以有

3、效抑制舌鱗癌細(xì)胞 的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。筆者 采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pgl6熒光素酶報告基因質(zhì)粒的舌鱗癌細(xì)胞tca8113-luc接種裸鼠，建立舌鱗癌 移植瘤動物模型，利用脂質(zhì)體oligofectaminetm為載體， 瘤體內(nèi)注射mir-21反義寡核昔酸(antisense-mir-21 oligonucleotide, as-mir-21),應(yīng)用活體成像 和tunel等實驗技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行as-mir-21對人舌鱗狀細(xì)胞 癌細(xì)胞系生長抑制的體內(nèi)研究。1材料和方法1.1材料1. 1. 1細(xì)胞系 人舌鱗癌細(xì)胞系tca8113由上海交通大 學(xué)口腔腫瘤生物實驗室建立并提供。1. 1.

4、2 sirna oligo 根據(jù) microrna 數(shù)據(jù)庫(http： /www. sanger. ac. uk)提供的基因序列，獲取人mir-21的 序列，依序列互補原理設(shè)計相應(yīng)的反義寡核昔酸序列和隨機 對照序列，并采用blast軟件分析，人工合成的寡核昔酸序 列以 2， o-me 修飾。as-mir-21 序列：5， -gucaacaucagucugauaagcua-3，； scrambled 序列：5 ' -aaggcaagcugacccugaagu-3，。1. 1.3質(zhì)粒pgl6熒光素酶報告基因質(zhì)粒購自江蘇碧云 天生物技術(shù)公司，含有熒光素酶編碼1uc基因和g418抗性 的neo

5、基因。1. 1.4實驗動物balb/c-nu （spf）雌性裸小鼠，46 周齡，體重1518 g,共24只，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗 動物科學(xué)部。1. 1. 5 主要試 劑 和儀器 lipofectaminetm 及 oligofec-taminetm reagent（invitrogen 公司，美國）,tunel 細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（南京凱基生物公司），精諾真活 體動物體內(nèi)可見光成像系統(tǒng)ivis200及氣體麻醉系統(tǒng)xgi-8 （xenogen公司，美國）。1. 2方法1.2. 1細(xì)胞處理方法 將tca8113細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇、傳代, 于37 °c. 5%c02孵箱中培養(yǎng)，選用對數(shù)生長

6、期、0.2%臺盼 藍(lán)拒染率95%的細(xì)胞。1.2.2質(zhì)粒擴增提純及質(zhì)粒酶切、轉(zhuǎn)染按德國qia-gen 公司大量質(zhì)粒擴增純化試劑盒要求擴增提純pgl6熒光素酶 報告基因質(zhì)粒后，以hind iii酶切并再次提純，利用 lipofectaminetm將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染tca8113細(xì)胞。1.2.3細(xì)胞篩選及穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因細(xì)胞克隆的 培養(yǎng)和鑒定以g418篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的 tca8113-luc細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞克隆。倍比稀釋細(xì)胞克隆，采 用可見光成像系統(tǒng)成像，檢測tca8113-luc細(xì)胞熒光素酶基 因表達(dá)效率，分析熒光強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性，繪制tca8113-luc細(xì)胞生長曲線。1.2.4人

7、舌鱗癌tca8113-luc裸鼠模型的建立 將24只 裸鼠隨機分為空白對照(control)組、無義序列(scr-mir) 組和反義序列(as-mir-21)組，每組8只。取對數(shù)生長期 的tca8113-luc細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至每毫升1x107個， 每只200 ul接種于裸鼠右側(cè)鼠蹊部皮下。1.2.5裸鼠荷瘤生長及治療情況接種腫瘤細(xì)胞第15 天，23只裸鼠成瘤，成瘤率為95. 83% ,腫瘤大小為 (0. 109±0. 076) cm3,最小腫瘤為 0.2 cmxo. 2 cm 時開始治療。將 20 pmol u lt 的 as-mir-21 及 scrambled 寡核昔酸各 1

8、50 ul 分別與 60 ul oligofectaminetm rea-gent混勻后，以無菌微量注射器腫瘤內(nèi)多點緩慢注射， 每只裸鼠每次注射混合物25 ulo每4 d治療1次，至觀察 期結(jié)束(4周)。自裸鼠開始治療之日起，每次治療前用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑(a)及寬徑(b),腫 瘤體積計算公式為：v二(ab2) /2；觀察腫瘤界限，浸潤情 況，有無壞死、破潰、感染及裸鼠全身狀況。1.2.6活體成像裸鼠接種tca8113-luc細(xì)胞當(dāng)日及之后每7d行活體成像1次。電子天平稱重后腹腔注射熒光素以氣體酶底物150 mg kg-1體重（含量為15 mg ml-1）,麻醉系統(tǒng)xgi-8麻醉，待底物作用

9、10 min后，將裸鼠按順序放入暗箱，平臥位，曝光成像。屏蔽原位瘤，可成像觀察 有無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。應(yīng)用成像系統(tǒng)軟件完成圖像分析過 程。 1.2.7裸鼠腫瘤組織實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (po-lymerase chain reaction, pcr)、蘇木精-伊紅(hema- toxylin-eosin, he)及tunel檢測 治療后第28天斷 頸處死所有裸鼠，解剖原位腫瘤，提取rna后行實時熒光定 量pcr檢測mir-21表達(dá)；原位腫瘤及腫大淋巴結(jié)常規(guī)石蠟 包埋切片，he染色行腫瘤組織病理檢查；石蠟切片fitc標(biāo) 記pod法進(jìn)行tunel實驗，檢測細(xì)胞凋亡，陽性結(jié)果判斷標(biāo) 準(zhǔn)：紫外光下

10、所有細(xì)胞核均被染成藍(lán)色，在495 nm激發(fā)波 長下可在熒光顯微鏡下看到凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的綠色熒光。每 張切片隨機選取8個視野(400x),每個視野至少計數(shù)100 個細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)，以百分比表示。1. 3統(tǒng)計學(xué)分析采用spss 10. 0統(tǒng)計軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析， 實時熒光定量pcr采用an0va單因素方差分析;計量資料(或 經(jīng)轉(zhuǎn)換后變?yōu)橛嬃抠Y料)多組間均數(shù)的比較采用單因素方差 分析；光子數(shù)和細(xì)胞數(shù)的關(guān)系分析采取二元變量的相關(guān)分 析，p0. 05)o從第21天起，as-mir-21組腫瘤體積與另外2組腫瘤生長出現(xiàn)明顯差異 (p<0. 05),這種差異持續(xù)到觀察期結(jié)束(圖3)。

11、所有裸鼠腫瘤全部界限清楚，無明顯浸潤，未見轉(zhuǎn)移灶。 空白對照組和scr-mir組較大的腫瘤有明顯出血、液化和壞 死，局部表面有潰破；荷瘤較大的裸鼠全身狀況較差，體重 減輕。而as-mir-21組腫瘤個體較小，均為實體性，無明顯 液化、壞死灶。as-mir-21組裸鼠瘤體內(nèi)注射as-mir-21后 能減緩腫瘤生長（腫瘤沒有減小但生長速度變慢，生長趨勢 減緩）（圖4）。2. 5活體成像每只裸鼠接種部位均有熒光成像，且光子數(shù)比較均一， 提示接種于裸鼠的tca8113-luc細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶活 性（圖5）。實驗第1周裸鼠接種腫瘤細(xì)胞至第3周裸鼠成瘤，活體 成像光子數(shù)無差異（圖6、7）o經(jīng)as-m

12、ir-21治療2周后，光子數(shù)出現(xiàn)差異，as-mir-21組數(shù)值明顯低 于其他2組，表明as-mir-21有效抑制了腫瘤的生長。而在 治療第3周之后，空白對照組和scr-mir組的光子數(shù)有所下 降，使3組間的差別消失?；铙w成像顯示各組裸鼠腫瘤均未 見遠(yuǎn)處和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。2.6 he染色檢測腫瘤組織病理學(xué)改變裸鼠腫瘤病理形態(tài)觀察結(jié)果見圖8?？瞻讓φ战M及 scr-mir組腫瘤細(xì)胞生長旺盛，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大，染 色深，核分裂相多見，異型性明顯，瘤巨細(xì)胞較多，新生血 管數(shù)也較多，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)大面積壞死。而as-mir-21組腫瘤 壞死灶少見，細(xì)胞核小，染色變淺，異型性減低，新生血管 數(shù)減少。所有腫瘤組織

13、可見少量炎性細(xì)胞浸潤。切取的腫大 淋巴結(jié)均為正常淋巴結(jié)組織，未見轉(zhuǎn)移癌。2. 7裸鼠腫瘤組織中mir-21的表達(dá)實時熒光定量pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖9。as-mir-21組mir-21表達(dá)比空白對照組和scr-mir組明顯 減低。裸鼠經(jīng)as-mir-21治療后，腫瘤組織中的mir-21表 達(dá)下降，分別是空白對照組及scr-mir組的36%和29.5%, 二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）；空白對照組及scr-mir 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2. 8 tunel原位凋亡檢測紫外光下所有細(xì)胞核均被染成藍(lán)色，凋亡細(xì)胞在495 run 激發(fā)波長下可在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞核的綠色熒光（圖 10）o as

14、-mir-21治療后凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，凋亡指數(shù)為37%,與空白對照組和scr-mir 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）。提示瘤體內(nèi)注射as-mir-21能有效促進(jìn)舌鱗癌腫瘤細(xì)胞凋亡。3討論mirna在細(xì)胞的增殖、分化等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作 用，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中基因表達(dá)的有力調(diào)節(jié)者。以mirna 為靶點設(shè)計的基因藥物為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及基因治療 提供了新的手段和途徑。當(dāng)mirna在腫瘤中低表達(dá)或作為腫 瘤抑癌基因時，可以采用mirna的替代療法，在腫瘤組織中 用病毒或脂質(zhì)體等系統(tǒng)轉(zhuǎn)染模擬內(nèi)源性mirna的人工合成的 mirna,使其過量表達(dá)，以達(dá)到靶向抑制腫瘤、誘導(dǎo)調(diào)亡的 作用1

15、。而當(dāng)mirna在腫瘤中髙表達(dá)或作為癌基因時，導(dǎo)入與mirna互補的反義寡聚核昔酸 序列，與mirna結(jié)合形成雜化雙鏈，激活rna酶h,進(jìn)而降 解并抑制mirna活性，干擾其表達(dá)水平，被認(rèn)為是目前最好 的方法2。此前的體外實驗研究證實口腔鱗癌中存在mir-21高表達(dá)。它發(fā)揮著原癌基因的作用，通過反向調(diào)節(jié)腫 瘤抑制基因和/或控制細(xì)胞分化或凋亡的基因而促進(jìn)腫瘤的 形成3,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。mir-21與腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡及侵襲性相關(guān)的 功能，以及其對多種促凋亡抗侵襲的腫瘤抑制基因的直接調(diào) 控，使其序列特異性的抑制物能對癌癥中表達(dá)失調(diào)的多種蛋 白進(jìn)行生理性調(diào)控，為癌癥提供一個新的治

16、療途徑4-7 o筆者采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pgl6熒光素酶報告基因質(zhì)粒的 tca8113-luc細(xì)胞接種裸鼠，建立移植瘤動物模型，通過瘤 體內(nèi)給藥，進(jìn)行as-mir-21對人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系生長抑 制的體內(nèi)研究。通過對裸鼠進(jìn)行為期28 d的治療和觀察， as-mir-21組腫瘤生長速度慢，腫瘤體積較小，腫瘤標(biāo)本中 壞死灶少見，細(xì)胞核變小，染色變淺，異型性減低，新生血 管數(shù)減少。經(jīng)實時熒光定量pcr檢測表明裸鼠經(jīng)as-mir-21 治療后，腫瘤細(xì)胞中mir-21表達(dá)明顯下降，tunel檢測顯示 as-mir-21組凋亡指數(shù)升高，提示以01 igofec-taminetm為 載體行as-mir-21瘤體內(nèi)

17、注射可有效降低腫瘤細(xì)胞中mir-21 的表達(dá)，有效促進(jìn)舌鱗癌腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長，提 示了 as-mir-21作為人口腔鱗癌治療靶標(biāo)的可能性?；铙w生物體內(nèi)成像技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué) 研究及藥物開發(fā)等方面8-9 o本研究利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法， 將酶切后的pgl6熒光素酶報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)入tca8113細(xì)胞 中。應(yīng)用g418 （最佳篩選終濃度為400 ugml-1）篩選出 穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶活性的tca8113-luc細(xì)胞系。將tca8113-luc細(xì)胞接種于裸鼠, 建立舌癌的動物模型，以進(jìn)行活體成像實驗。觀測前需注射 熒光素酶底物一熒光素。美國xeno-gen公司生產(chǎn)的ivis成 像系統(tǒng)

18、，在動物體內(nèi)可監(jiān)測到102個細(xì)胞10-12 o筆者構(gòu) 建的tca8113-luc細(xì)胞株在接種于裸鼠當(dāng)時及接種后2周成 瘤時均有熒光素酶表達(dá)且接種腫瘤細(xì)胞和成瘤時各組活體 成像光子數(shù)測定無差別。隨著腫瘤的增長，空白對照組和 scr-mir組熒光值快速增加，在成瘤治療后2周就已達(dá)到飽 和，到第3周時，腫瘤中心已出現(xiàn)壞死，中心熒光值降低。 而as-mir-21組的熒光值增加則比較緩慢，從治療后2周就 與其他兩組有顯著性差異。但到第3周以后，空白對照組和 scr-mir組由于部分腫瘤體積較大，發(fā)生液化壞死，使熒光 值降低，各組之間無差異。實驗觀察期為4周，可明顯看到 對照組和實驗組的腫瘤生長體積的差別

19、。但后期各組活體成 像的熒光信號差異卻與各組腫瘤大小差異產(chǎn)生矛盾，考慮可 能是空白對照組和scr-mir組腫瘤組織產(chǎn)生了大量壞死，使 活體成像信號減弱的原因。但如果縮短觀察時間又無法足夠 且正確地評價as-mir-21對腫瘤的抑制作用。這個問題還有 待于進(jìn)一步探索解決。應(yīng)用活體成像監(jiān)測tca8113-luc腫瘤 體內(nèi)生長情況，治療前后各組均未發(fā)現(xiàn)腫瘤有淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處 轉(zhuǎn)移，這可能和腫瘤細(xì)胞的接種方式有關(guān)。應(yīng)用的是鼠蹊部 皮下成瘤的方法，如果釆用細(xì)胞尾靜脈注射裸鼠成瘤，得到 腫瘤轉(zhuǎn)移模型的可能性會增加，將使as-mir-21對腫瘤生長、 轉(zhuǎn)移的抑制作用得到更有說服力的體現(xiàn)。隨著人類基因組計劃的完成

20、、細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā) 展和其他腫瘤治療手段的日益完善，基因治療可望成為腫瘤 治療的又一常規(guī)手段。通過細(xì)胞特異性病毒或脂質(zhì)體，把靶 標(biāo)mir-21抑制劑傳送至疾病的（如腫瘤）細(xì)胞中，可以作 為mir-21抑制作用的一項有效途徑。無論如何，mir-21與 人類多種疾病的密切相關(guān)及其在許多關(guān)鍵癌基因中的調(diào)控 作用使這個小分子成為日后研究和基因治療的一個重要的 靶標(biāo)。參考文獻(xiàn)1 dahan m, levi s, luccardini c, et al.diffusion dynamics of gly-cine receptors revealed by single-quantum dot tr

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