2022年抗青霉素單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用1

1、抗青霉素單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用preparation and primary application of monoclonal antibody against benzylpenicillinabstractaim: to develop monoclonal antibodymab against benzylpenicillin andto establish a sandwich elisa method for relative quantitative analysis ofthe allergen whichinduced penicillin allergy common

2、ly in clinic. methods: penicillin, as a kind of hapten, was conjugated with carrier protein to form complete antigen and then was used to immunize balb/c mice. hybridoma cells secrecting mab against penicillin were developed.ascites from the immunized mice were purified by caprylic acid. ammonium su

3、lfateprecipitation. the specificity of the purified antibodies was detected and the suitable antibodies were used for establishing sandwich elisa. results: nine hybridoma cells stably secrecting mab were prepared through cell fusion, screening and cloning, and five of these purified mab had relative

4、 highaffinity. the double.antibodysandwich elisa for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein was established with a sensitivity of 870u/l.the average recovery rate was 107.81% and the average intra. and inter.coefficient of varitation cv was 6.7% and 9.3% respectively. the method

5、 was applied for relative quantitative analysis of benzylpenicilloyl protein from group a streptococcus preparation. conclusion: nine hybridoma cell strains stably secreting mab against benzylpenicillin were obtained. the double.antibody sandwich elisa for relative quantitative analysis of benzylpen

6、icilloyl proteinwas established.keywordsbenzylpenicillin;benzylpenicilloyl;mab;double.antibody sandwich elisa 摘 要目的:制備抗青霉素的單克隆抗體 mab并建立雙抗體夾心 elisa檢測方法 , 對臨床上引起青霉素過敏反應(yīng)的過敏原青霉噻唑蛋白進(jìn)行討論；方法:將半抗原青霉素和載體蛋白偶聯(lián)后免疫 balb/c 小鼠,應(yīng)用雜交瘤技術(shù)建立穩(wěn)固分泌抗青霉素mab的雜交瘤細(xì)胞株；常規(guī)制備腹水 ,用辛酸.硫酸銨法純化 ,并對純化的 mab進(jìn)行特異性鑒定；通過對不同抗體組合的分析和條件的優(yōu)化 ,建立檢

7、測過敏原的雙抗體夾心elisa方法；結(jié)果 :經(jīng)細(xì)胞融合、 挑選及克隆化 ,共獲得 9 株穩(wěn)固分泌抗青霉素mab的雜交瘤細(xì)胞株 ,其中 5 株親和力較高；建立了雙抗體夾心elisa 相對定量檢測方法 ,該方法靈敏度達(dá)到 870u/l,平均回收率為 107.81%, 批內(nèi)變異系數(shù)平均為 6.7%, 批間變異系數(shù)平均為 9.3%, 可用于 a 群鏈球菌制劑中青霉噻唑蛋白的檢測；結(jié)論 :勝利地制備了抗青霉素的 mab, 并建立了相對定量檢測青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心 elisa法； 關(guān)鍵詞 青霉素;青霉噻唑基 ;單克隆抗體 ;雙抗體夾心 elisa青霉素因其高效、 低毒的特點(diǎn)在臨床上被廣泛應(yīng)用,但其結(jié)構(gòu)

8、中的 .內(nèi)酰胺環(huán)很不穩(wěn)固,在溶液狀態(tài)特別是堿性條件下易開環(huán)與蛋白、多肽的氨基發(fā)生親核反應(yīng)生成穩(wěn)固的 青霉噻唑蛋白 ,形成臨床主要的過敏原 1 ；青霉素類抗生素的過敏反應(yīng)發(fā)生率居各種藥物之首2,青霉素不純物 0.0 1 g即可使青霉素高度敏銳者產(chǎn)生嚴(yán)峻的過敏反應(yīng)3 ；生理?xiàng)l件下青霉素開環(huán)后大約95%與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合形成青霉噻唑基（ benzyl penicilloyl, bpo）主要抗原打算簇 ,而其他一些共扼物如 penicillanyl, penicillenate、 青霉烯酸、 penamaldate, penaldate, d.青霉胺和 penicoyl等就為次要抗原打算簇 ,后者僅占

9、5%4 ；理論上連接有兩個青霉噻唑基的蛋白、多肽就可能與 ige 分子形成橋式結(jié)構(gòu)從而引發(fā) i 型超敏反應(yīng)；青霉素的這種不穩(wěn)固性使得在制備過程中添加有青霉素的生物制品以及食品中都可能殘留有青霉噻唑蛋白,而目前的檢測方法通常是針對游離的有抗菌活性的青霉素,尚無特地針對具有免疫原性且有潛在致敏危急的青霉噻唑蛋白的檢測方法；本討論中, 采納雜交瘤技術(shù)制備了穩(wěn)固分泌抗青霉素mab的雜交瘤細(xì)胞 ,并建立了相對定量檢測青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心 elisa法,該方法特異性強(qiáng)、 靈敏度高 ,有望對藥品、 食品中可能殘留的青霉噻唑蛋白進(jìn)行痕量檢測；1 材料和方法1.1 材料青霉素鉀標(biāo)準(zhǔn)品 ,為本所制備 , 相對

10、分子質(zhì)量（ mr）為 372.49,純度為99.9%; 牛血清白蛋白（ bsa）、 卵清蛋白（ oa）、 多聚賴氨酸（ poly.l.lysine, pll）為 sigma公司產(chǎn)品 ; dmem培育液為 gibcobrl公司產(chǎn)品 ,新生牛血清購自杭州四季清公司;hat、 ht、 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、 ig 亞類試劑盒均購自 sigma公司, peg4000 購自 fluke 公司, bca 蛋白濃度測定試劑盒購自 pierce 公司, 所用二抗均為 jakson 公司產(chǎn)品, 其余均為國產(chǎn)分析純試劑； sp2/0 細(xì)胞由本所細(xì)胞室供應(yīng) , balb/c 雌鼠（ 68 周齡）由本所試驗(yàn)動

11、物中心供應(yīng)；1.2 方法1.2.1 完全抗原的制備免疫原的制備 : 參照 haan的方法 5,將 25 mg 青霉素鉀溶于 ph9.6 na2co3緩沖液中 ,充分混勻后加入 5 mg 牛血清白蛋白 bsa（或卵清蛋白 oa）, 調(diào)劑 ph值至 11, 37 攪拌過夜 ,在 0.01 mol/l pbs中充分透析至透析液中不再檢出有抑 菌活性；將透析物分裝于 - 20儲存；挑選用包被抗原的制備 :用直鏈結(jié)構(gòu)的多聚賴氨酸（poly.l.lysine, pll）與青霉素偶聯(lián)成 bpo.pll, 方法同；1.2.2 balb/c 小鼠的免疫分別用兩種載體偶聯(lián)的免疫原免疫小鼠,每只 20g, 皮下多點(diǎn)

12、及四腳掌初次免疫 ; 14 d后相同劑量腹腔加強(qiáng)免疫 ,每 2 周加強(qiáng) 1 次,加強(qiáng)后每隔 7 d 眼眶采血 ,分別測定針對半抗原和載體蛋白的抗體效價(jià),于細(xì)胞融合前 3 d 尾靜脈加強(qiáng)免疫；121.2.3 細(xì)胞融合、 挑選及克隆依據(jù)常規(guī)法 peg融合6 ；分別用 bpo.pl、l pll作為包被抗原和對比抗原（均為 1 mg/l 包被）、 工作濃度兔抗鼠二抗 , 用間接 elisa檢測上清液；以免疫小鼠的血清為陽性對比 , 以 sp2/0 細(xì)胞培育的上清液為空白對比 , 以細(xì)胞培育板中未長出克隆的細(xì)胞培育液上清為陰性對比 , 選取 p/n 值最高的采納有限稀釋法進(jìn)行 3 或 4 次克隆；每次克

13、隆后對擴(kuò)大培育建庫的細(xì)胞上清再分別用陰性對比 pll、 bsa、 oa和檢測用抗原 bpo.pl、lbpo.bs、abpo.oa包被,間接 elisa檢測；1.2.4 腹水誘生及 mab純化建株細(xì)胞擴(kuò)大培育后常規(guī)法制備腹水并采納辛酸.硫酸銨法進(jìn)行純化；經(jīng)仍原 sds.pag電e 泳檢測純度 , bca 試劑盒測定純化抗體濃度；1.2.5 mab特性鑒定亞類測定 :依據(jù) sigma 亞類測定試劑盒說明書測定；效價(jià)的檢測 :采納間接 elisa法測定；相對親和力的比較:采納間接 elisa法,加入倍比稀釋的抗體與包被抗原反應(yīng)30 min,以 mab濃度對 a450 值作圖,依據(jù)反應(yīng)曲線以達(dá)到 50%最大結(jié)合的 mab的濃度來比較相對親和力； mab特異性分析 :用 western blot檢測；分別將 bsa、 oa 和 bpo.bs、a bpo.oa以合適濃度進(jìn)行 sds.pag電e 泳,轉(zhuǎn)膜（ 15v 恒壓, 20min）后脫脂奶粉封閉過夜；加入合適濃度的純化抗體,室溫孵育 1 h,洗后加入工作濃度 的堿磷酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗室溫孵育45 min,充分洗滌