藥品微生物限度與無菌檢查

1、Luzhou Institutes for Food and Drug Control藥品微生物限度與無菌檢查藥品微生物限度與無菌檢查風(fēng)險管理風(fēng)險管理 風(fēng)險調(diào)查風(fēng)險調(diào)查/ /評估評估微生物實驗微生物實驗室技術(shù)能力室技術(shù)能力藥品微生物控制藥品微生物控制風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查風(fēng)險管理、風(fēng)險調(diào)查/ /評估評估Luzhou Institutes for Food and Drug Control藥品微生物檢驗的過程控制藥品微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and D

2、rug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug ControlUSP35USP35部分章節(jié)部分章節(jié)中國藥典中國藥典20152015年版年版Antimicrobial Effectiveness Testing抑菌效力檢查法抑菌效力檢查法Biological Indicators-Resistance Performance Tests生物指示劑抗性檢查法生物指示劑抗性檢查法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Microbial Enumeration Tests非無菌產(chǎn)品微生物檢查

3、：微生物計數(shù)法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法Microbiological Examination of Nonsterile Products: Tests for Specified Microorganisms非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法Microbiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical Product非無菌藥品微生物限度標準非無菌藥品微生物限度標準Mycoplasma Tests支原體檢查法支原體檢查法Sterility Tests無菌檢查法無菌檢查法Biological Indic

4、ators for Sterilization滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則滅菌用生物指示劑指導(dǎo)原則Aplication of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical Products水活度檢查法用于非無菌藥品微生物評價水活度檢查法用于非無菌藥品微生物評價Microbial Characterization, Identification, and Strain Typing微生物鑒定指導(dǎo)原則微生物鑒定指導(dǎo)原則Microbiological Evalution of Clean Rooms and Other Control

5、led Environments藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則Microbiological Best Laboratory Practices藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則Sterility Testing-Validation of Isolator Systems無菌檢查用隔離器系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則無菌檢查用隔離器系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則Sterilization and Sterility Assurance of Compendial Articles滅菌法滅菌法Validation of Alternative M

6、icrobiological Methods藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則/非無菌藥品微生物限度檢測指導(dǎo)原則非無菌藥品微生物限度檢測指導(dǎo)原則/（日本藥典收載）（日本藥典收載）中藥飲片微生物限度檢查法？中藥飲片微生物限度檢查法？藥品微生物檢驗的過程控制藥品微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷無菌檢查用隔離系無菌檢查用隔離系 統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則藥品微生物實驗室藥品微生物實驗室 質(zhì)量管理指導(dǎo)原則質(zhì)量管理指導(dǎo)原則藥品潔凈實驗室微生物藥品潔凈實驗室微生物 檢測和控制指導(dǎo)原則檢測和

7、控制指導(dǎo)原則微生物鑒定微生物鑒定 指導(dǎo)原則指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代藥品微生物檢驗替代 方法驗證指導(dǎo)原則方法驗證指導(dǎo)原則對照培養(yǎng)基al Institutes for Food and Drug Control案例案例陽性結(jié)果與玻璃安瓿表面采樣菌高度相陽性結(jié)果與玻璃安瓿表面采樣菌高度相似似NationLuzhou Institutes for Food and Dr無菌檢查過程微生物控制無菌檢查過程微生物控制 空氣微生空氣微生物物 浮游菌 沉降菌 表面微生物表面微生物 樣品包裝表面 操作人員手部易折方式影響折斷力易折方式影響折斷力 色環(huán)：通過在瓶頸噴涂與玻 璃膨脹系數(shù)不同的色釉產(chǎn)生 應(yīng)力，從而使

8、斷面平整灌裝工藝落后造成折斷灌裝工藝落后造成折斷 力差力差為防止灌裝中安瓿斷頭安瓿折斷后，斷安瓿折斷后，斷面應(yīng)平整。面應(yīng)平整。Luzhou Institutes for Food and Drug Control國家藥用包裝容器國家藥用包裝容器（材料）標準（材料）標準YBB00332002YBB00332002點刻痕易折玻璃安瓿點刻痕易折玻璃安瓿點刻痕易折安瓿的色點應(yīng)標記在刻痕的上方中心點刻痕易折安瓿的色點應(yīng)標記在刻痕的上方中心 與中心線的偏差不得過與中心線的偏差不得過1.0mm1.0mm刻痕工藝控制不好刻痕工藝控制不好 深淺、長短、高低位置不一 色點和刻痕位置偏離規(guī)格尺寸不規(guī)范規(guī)格尺寸不規(guī)范

9、 瓶身外徑精度不夠 刻痕不易控制 瓶頸壁厚不均勻 折斷后斷面不平整玻璃材質(zhì)不佳玻璃材質(zhì)不佳 低硼硅玻璃：48.6% 中性硼硅玻璃：7.7% 我國90%以上低硼硅玻璃玻璃安瓿表面消毒方案比較玻璃安瓿表面消毒方案比較Luzhou Institutes for Food and Drug Control 殺孢子劑（過氧乙酸）噴灑后立即（3min、5min、10min）用 75%乙醇鈍化，再用濕棉簽擦拭取樣 酒精燈過火1秒鐘（3秒鐘、5秒鐘、10秒鐘）后直接用濕棉簽 擦拭取樣表面消毒方案表面消毒方案作用時間作用時間殘留菌落數(shù)殘留菌落數(shù)菌屬類型菌屬類型殺孢子劑立即2cfuBacillus3min0cfu

10、/5min0cfu/10min0cfu/棉簽擦拭&過火1秒鐘4cfuBacillus、Brevibacillus3秒鐘10cfuBacillus、Paenibacillus、Brevibacillus5秒鐘0cfu/10秒鐘0cfu/微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物實驗室工作流程微生物實驗室工作流程Luzhou Institutes for Food and Drug Control環(huán)境

11、保障環(huán)境保障WHO GPML 各區(qū)域等級Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物限度微生物限度 & & 無菌檢查環(huán)境要無菌檢查環(huán)境要求求無菌檢查：無菌檢查：環(huán)境潔凈度環(huán)境潔凈度B B級背景下的局部級背景下的局部A A級潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中級潔凈度的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中B+AB+Aoror隔離系統(tǒng)隔離系統(tǒng)中國藥典中國藥典20102010版版 萬級下的百級萬級下的百級中國藥典中國藥典20152015版版 藥品潔凈藥品潔凈實驗室微生物監(jiān)測和控制實驗室微生物監(jiān)測和控制指導(dǎo)原則指導(dǎo)原則無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原

12、無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則則Luzhou Institutes for Food and Drug Control9205920592069206微生物限度檢查：微生物限度檢查：受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B B級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)D+BSCD+BSC生物安全柜生物安全柜潔凈室潔凈室/ /臺工作原理臺工作原理層流層流 Laminar flowLaminar flow混流Conventional (mixed flow) cleanroomConventional (mixed flow) cleanroomLuzhou Institu

13、tes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control相關(guān)潔凈標準比較相關(guān)潔凈標準比較ISO 14644討論了潔凈室和受控環(huán)境的設(shè)計與建設(shè)按ISO 14644的分類分類是建立在環(huán)境中每單位體積的總體粒子數(shù)粒子數(shù)的基礎(chǔ)上分類不區(qū)分非生物粒子或生物粒子相關(guān)潔凈標準比較相關(guān)潔凈標準比較2010版GMP潔凈度級別標準“靜態(tài)靜態(tài)”百級，百級，“動態(tài)動態(tài)”萬級萬級Luzhou Institutes for Food and Drug Control相關(guān)潔凈標準比較相關(guān)潔凈標準比較20152015版版 建議的潔凈實驗室

14、環(huán)境監(jiān)測頻次及項建議的潔凈實驗室環(huán)境監(jiān)測頻次及項目目按ISO 14644的定級定級是建立在環(huán)境中每單位體積的總體粒子數(shù)粒子數(shù)的基礎(chǔ)上Luzhou Institutes for Food and Drug Control定級定級不區(qū)分非生物粒子或生物粒子受控區(qū)域受控區(qū)域潔凈級別潔凈級別采樣頻次采樣頻次檢測項目檢測項目粒子粒子相鄰?fù)獠棵堪肽炅Ｗ恿Ｗ?、浮游菌、沉降菌、表面菌粒子粒子B級每周粒子粒子、浮游菌、 沉降菌、表面菌粒子粒子D級每半年粒子粒子、浮游菌、 沉降菌、表面菌Luzhou Institutes for Food and Drug C“B級級”與與“C級級”的異同的異同ontrol懸浮粒

15、子與環(huán)境微生物懸浮粒子與環(huán)境微生物L(fēng)uzhou Institutes for Food and Drug Control非生物粒子數(shù)量和活的微生物濃度之間的關(guān)系在科學(xué) 上未達成絕對的一致當(dāng)操作人員是粒子的來源時，以下的結(jié)論是成立的， 即潔凈室中的粒子越少，空氣中微生物存在的可能性就潔凈室中的粒子越少，空氣中微生物存在的可能性就 越小越小。實驗設(shè)備運行時大量產(chǎn)生的粒子污染和人員產(chǎn)生的粒子污染之間是無法明確區(qū)分的大量的藥物除了微生物以外還有粒子限度的要求幾乎肯定的是，部分懸浮粒子與微生物有關(guān)因此，潔凈室監(jiān)測應(yīng)包括微生物微生物與粒子粒子數(shù)兩方面潔凈室使用次數(shù)與浮游菌數(shù)關(guān)系潔凈室使用次數(shù)與浮游菌數(shù)關(guān)系

16、416#浮游菌數(shù)201月2月3月4月5月6月7月8月9月10月 11月 12月681016141213#使用次數(shù)13#浮游菌數(shù)16#使用次數(shù)Luzhou Institutes for Food and Drug Control近近8 8年無菌室年無菌室C C級浮游菌高限圖級浮游菌高限圖9090808070706060505040403030202010100 020072007200820082009200920102010201120112012201220132013201420147 7月月8 8月月9 9月月硬件差異軟件差異Luzhou Institutes for Food and

17、Drug Control潔凈區(qū)微生物監(jiān)測水平USP35USP3515 cfu 15 cfu 信息性，信息性， 非標準性非標準性Luzhou Institutes for Food and Drug Control監(jiān)控基于風(fēng)險評估監(jiān)控基于風(fēng)險評估120100806040200法規(guī)標準 OOT行動限 OOE警戒限 常規(guī)波動WHO good practices for pharmaceutical microbiology laboratoriesAppendix 4Examples of equipment qualification and monitoringLuzhou Institutes

18、 for Food and Drug Control環(huán)境微生物歸屬環(huán)境微生物歸屬Luzhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control欣弗事件欣弗事件欣弗培養(yǎng)物潔凈環(huán)境常見菌： 頭狀葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 緩癥鏈球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黃微球菌（Micrococcus luteus） 山羊

19、葡萄球菌（Staphylococcus caprae）肺炎克雷伯巨大芽孢桿菌粘質(zhì)沙雷菌奪命的欣弗編號鑒定結(jié)果0206L1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）298L；298G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）303L；303G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、陰溝腸桿菌（Enter. cloacae）305L；305G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷

20、菌（S.marcescens）306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）307G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）308L糞產(chǎn)堿桿菌（Al.faecalis）309L糞產(chǎn)堿桿菌（Al.faecalis）304G嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（S.maltophilia）不同生物安全水平對設(shè)施的要求不同生物安全水平對設(shè)施的要求Luzhou Institutes for Food and Drug Control不同保護類型及生物安全柜的選擇不同保護類型及生物安全柜的選擇Luzhou Institutes for Food and Drug ControlI級安全柜適用于一級，二級和三級安全實

21、驗室， II級和III級安全柜則適用于所有級別安全實驗室。保護類型生物安全柜的選擇個體防護，針對生物危險等級13級微生物級、級生物安全柜個體防護，針對生物危險等級4級微生物， 手套箱型實驗室級生物安全柜個體防護，針對生物危險等級4級微生物， 防護服型實驗室級、級生物安全柜實驗對象保護級生物安全柜，柜內(nèi)氣流是層流的級生物安全柜少量揮發(fā)性放射性核素化學(xué)品的防護級B1型生物安全柜，外排風(fēng)式 級A2型生物安全柜揮發(fā)性放射性核素化學(xué)品的防護級、級B2型、級生物安全柜Luzhou Institutes for Food and Drug ControlClass I 生物安全柜生物安全柜適用于樣品不需保護

22、的工作適用于樣品不需保護的工作1、從前窗口吸入的負壓氣流，用以保護人員的安全； 2、排出的氣流經(jīng)HEPA過濾器過 濾，用以保護環(huán)境，不受污染； 3、對受試樣本，不能提供切實 可靠的保護。無外接風(fēng)道有外接風(fēng)道Contaminated air under negative pressure Contaminated air under positive pressureHEPA-filtered airRoom airLuzhou Institutes for Food and Drug ControlII級級A2型生物安全柜型生物安全柜前窗進風(fēng)氣流平均流速0.50m/s 生物安全柜排風(fēng)管道接口

23、與建筑物排風(fēng)系統(tǒng)相連接 可以從事少量的的揮發(fā)性 有毒化學(xué)物質(zhì)或放射性的 工作。Luzhou Institutes for Food and Drug Control在生物安全柜上工作在生物安全柜上工作干凈的物品工作臺擺放被污染的區(qū)域廢棄物托盤垃圾袋Luzhou Institutes for Food and Drug Control無菌隔離系統(tǒng)與傳統(tǒng)潔凈技術(shù)的對比無菌隔離系統(tǒng)與傳統(tǒng)潔凈技術(shù)的對比Luzhou Institutes for Food and Drug Control項目項目消毒消毒/ /滅菌方滅菌方 法法潔凈環(huán)境的潔凈環(huán)境的 控制控制對操作人員對操作人員 的防護的防護物料傳送方物

24、料傳送方 式式人員進出人員進出運行所需能運行所需能 耗耗誤操作導(dǎo)致誤操作導(dǎo)致 的無菌環(huán)境的無菌環(huán)境 污染的風(fēng)險污染的風(fēng)險傳統(tǒng) 潔凈 技術(shù)消毒劑擦拭/ 熏蒸/紫外線 照射等方法受 空間等諸多因 素影響效果難 以驗證易受人員、 物料等諸多 因素影響， 易受污染， 難以控制；取決于操作 人員自身技 術(shù)和熟練程 度；傳統(tǒng)的傳遞 窗，易導(dǎo)致 無菌室環(huán)境 破壞和物料 的污染；需復(fù)雜的換 鞋/工作服 更換等步驟 帶來額外工 作量；高，誤操作可能 性大，與操 作人員有較 大相關(guān)性無菌 隔離 器技 術(shù)自動氣體滅菌 省時省力， 氣體分布均勻 效果較好，容 易驗證；， 與外界完全 隔離，僅通， 過HEPA進行 空氣

25、交換并 可恒定艙內(nèi) 壓力以阻絕 外界污染；安全系數(shù)高雙門快速傳 遞系統(tǒng)保證 在無菌環(huán)境 中傳遞，無 菌保證程度 高；僅通穿戴手 套/半身工 作服即可；低可能性極小Na隔離器隔離器2x3-glove IsotestH2O2溶液被泵入蒸發(fā)器 液態(tài)H2O2 氣態(tài)H2O210 SAL表面殺滅效率-6tional Institutes for Food and Drug Control隔離器隔離器9209206 6 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗證指導(dǎo)原則1.操作驗證3.滅菌驗證4.滅菌循環(huán)驗證2.完整性驗證5.內(nèi)部潔凈度驗證6.儀器儀表驗證Luzhou Institutes for

26、 Food and Drug ControlLuzhou Institutes forFood and Drug Control三種主要設(shè)備比較三種主要設(shè)備比較生物安全柜生物安全柜層流柜層流柜無菌隔離器無菌隔離器人員保護環(huán)境要求樣品保護處理樣品靈活性操作難度運行維護難度微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查無菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and Drug ControlChPChP無菌檢查培養(yǎng)基與無菌檢查培養(yǎng)基與USPUSP、BPBP的比較

27、的比較Luzhou Institutes for Food and Drug Control硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（Fluid Thioglycollate Medium）藥典藥典USPUSPBPBP中國藥典中國藥典-2015-2015名稱名稱Fluid Thioglycollate Fluid Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基基Fluid Thioglycollate Fluid Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基基Fluid Thioglycollate Fluid

28、Thioglycollate Medium Medium 硫乙醇酸鹽流體培硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基養(yǎng)基目的目的培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微 生物生物（主要是厭氧菌）（主要是厭氧菌）培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微 生物生物（主要是厭氧菌）（主要是厭氧菌）培養(yǎng)需氧、厭氧微生物培養(yǎng)需氧、厭氧微生物培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件1414天于天于30-35 30-35 C C及及20-25 20-25 C C配方配方Pancreatic Digest of Casein(Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨).15.0 g Yeast ).15

29、.0 g Yeast Extract(Extract(酵母浸出粉酵母浸出粉) .5.0 g) .5.0 gDextrose(Dextrose(葡萄糖葡萄糖).5.5 g).5.5 gSodium Chloride(Sodium Chloride(氯化鈉氯化鈉).2.5 g).2.5 gL-Cystine( L-L-Cystine( L-胱氨酸胱氨酸) .0.5 g) .0.5 gSodium Thioglycollate (Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸鈉硫乙醇酸鈉).0.5 g Agar( ).0.5 g Agar( 瓊瓊脂脂).0.75 g).0.75 gResaz

30、urin( Resazurin( 刃天青刃天青) .1.0 mg) .1.0 mgChPChP無菌檢查培養(yǎng)基與無菌檢查培養(yǎng)基與USPUSP、BPBP的比較的比較Luzhou Institutes for Food and Drug Control大豆胰酪胨培養(yǎng)基(TSB) & 改良馬丁培養(yǎng)基藥典藥典USP36BP-2013中國藥典中國藥典2010版版中國藥典中國藥典2015版版名稱名稱Tryptic Soy Broth (Soybean casein Soybean casein digest medium)digest medium)大豆胰酪大豆胰酪 胨培養(yǎng)胨培養(yǎng)基基改良馬丁培養(yǎng)基改

31、良馬丁培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配方配方胰酪蛋白胨胰酪蛋白胨.7.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物大豆木瓜蛋白酶消化物.3.0g氯化鈉氯化鈉.5.0g 磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀.2.5g 一水葡萄糖一水葡萄糖.2.5g蛋白胨蛋白胨.5.0g 酵酵母浸出粉母浸出粉.2.0g葡萄糖葡萄糖.20.0g 磷磷酸氫二鉀酸氫二鉀.1.0g硫酸鎂硫酸鎂(MgSO4.7H2O).0.5g胰酪胨胰酪胨 17.0g 17.0g 大豆木大豆木瓜蛋白酶水解物瓜蛋白酶水解物3.0g3.0g氯化鈉氯化鈉 5.0g5.0g磷酸氫二鉀磷酸氫二鉀2.5g2.5g葡萄糖葡萄糖/ /無水葡萄糖無水葡萄糖2.5g /2.3

32、g2.5g /2.3g目的目的支持廣泛微生物的生長支持廣泛微生物的生長, ,包括需氧菌包括需氧菌 專性和兼性厭氧菌、專性和兼性厭氧菌、真菌（主要是真菌（主要是 需氧菌）需氧菌）、用于培養(yǎng)、用于培養(yǎng)真菌真菌支持廣泛微生物的生長支持廣泛微生物的生長, ,包包 括需氧菌、專性和兼性厭氧括需氧菌、專性和兼性厭氧 菌、菌、真菌（主要是需氧菌）真菌（主要是需氧菌）培養(yǎng)培養(yǎng) 條件條件14天于天于30-35 C及及20-25 C14天于天于20-25 C14天于天于30-35 C及及20-25C微生物實驗室常用菌株微生物實驗室常用菌株 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B

33、B) 10104 大腸埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B B) 44102 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMCC(B B) 26003 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B B) 64941 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)G+芽孢桿菌 CMCC(B B) 63501G-桿菌G+球菌酵母菌霉菌兼性需氧菌專性厭氧菌專性需氧菌 白色念珠菌 (Candida albicans)CMCC(F F) 98001 黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC(F F) 98003Luz

34、hou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control在硫乙中生長差異在硫乙中生長差異僅僅 在在 厭厭 氧氧 層層 生生 長長需需 氧氧 層層 厭厭 氧氧 層層 均均 生生 長長銅綠假銅綠假單胞菌單胞菌( (PseudomPseudomonas onas aeruginoaeruginosasa) )僅僅 在在 需需 氧氧 層層 生生 長長CMCC(B) 10104CMCC(B) 10104大腸埃希菌（大腸埃希菌（Escherichia coliEscherichia coli） C

35、MCC(B) 44102CMCC(B) 44102金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 ( (Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus) ) CMCC(B) 26003CMCC(B) 26003生孢梭菌生孢梭菌( (Clostridium sporogenesClostridium sporogenes) ) CMCC(B) 64941CMCC(B) 64941枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 ( (Bacillus subtilisBacillus subtilis) ) CMCC(B) 63501CMCC(B) 63501方法適用性內(nèi)容修訂方法適用性內(nèi)容修訂Lu

36、zhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control微生物計數(shù)定義變化修訂前修訂后內(nèi)容細菌數(shù)營養(yǎng)瓊脂霉菌和酵母菌數(shù)玫瑰紅鈉瓊脂（1）需氧菌總數(shù)（TAMC）。（2）霉菌和酵母菌總數(shù)（TYMC）。（3）需氧菌總數(shù)：生長在胰酪大豆胨瓊脂（TSA）上所 有菌落(包括霉菌和酵母菌)。（4）霉菌和酵母菌總數(shù)：一般指生長在沙氏葡萄糖瓊 脂（SDA）上的所有菌落(包括細菌)。如果由于細菌 的生長而使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物 限度要求，可使用含有抗生素的SDA重新計數(shù)。對照培養(yǎng)基培養(yǎng)基質(zhì)

37、量控制：培養(yǎng)基質(zhì)量控制： USP之前驗證過的 中國藥典對照培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基單劑量免稱量獨立包裝 專利號： ZL200920108836.8回收率 待測培養(yǎng)基平均菌落數(shù)（cfu ）*100%對照培養(yǎng)基平均菌落數(shù)（cfu）Luzhou Institutes for Food and Drug Control50%200%Luzhou Institutes for Food and Drug Control培養(yǎng)基適用性檢查范圍液體、固體培養(yǎng)基加菌量不大于100cfu培養(yǎng)溫度胰酪大豆胨瓊脂：3035 培養(yǎng)； 胰酪大豆胨肉湯：3035 培養(yǎng)； 沙氏葡萄糖瓊脂：2025 培養(yǎng)。培養(yǎng)時間細菌不大于72h，真

38、菌不大于5天?？山邮軜藴使腆w培養(yǎng)基：50200（0.52）液體培養(yǎng)基：生長良好。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱胰酪大豆胨肉湯（TSB）無菌性檢查取已滅菌的TSB，于30-35培養(yǎng)不少于3天，培養(yǎng)基應(yīng)澄清。試驗用菌株枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌接種方法分別接種各試驗用菌懸液于該培養(yǎng)基中，接種量不大于100cfu， 搖勻，培養(yǎng)。適用性檢查接種試驗用菌株后，30-35培養(yǎng)不超過72小時，與對照培養(yǎng)基比 較，試驗菌應(yīng)生長良好。（建議：培養(yǎng)基呈混濁的液體，或劃線 于相應(yīng)的分離平板上，培養(yǎng)后呈現(xiàn)典型菌落）備注：

39、該培養(yǎng)基同時用于稀釋液的制備和控制菌檢查時，需要考慮同時滿足計數(shù)和 控制菌檢查培養(yǎng)基適用性檢查控制要求。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱胰酪大豆胨瓊脂（TSA）無菌性檢查取已滅菌TSA注皿，于30-35培養(yǎng)35天，應(yīng)無菌落生長。試驗用菌種枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉接種方法涂布法：表面接種不大于100cfu試驗用菌懸液于TSA平板表面； 傾注法：接種不大于100cfu試驗用菌懸液于無菌平皿，傾注該培 養(yǎng)基，輕輕搖勻。適用性檢查枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌于30-35培

40、養(yǎng)不 超過3天；白色念珠菌、黑曲霉于30-35培養(yǎng)不超過5天。與對照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50200之間。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）無菌性檢查取已滅菌的SDA注皿，于20-25培養(yǎng)57天，應(yīng)無菌落生長。試驗用菌種白色念珠菌、黑曲霉接種方法涂布法：表面接種不大于100cfu試驗用菌懸液于SDA平板表面。 傾注法：接種不大于100cfu試驗用菌懸液于無菌平皿中,傾注該培 養(yǎng)基，輕輕搖勻。適用性檢查 白色念珠菌、黑曲霉于20-25培養(yǎng)不大于5天。與對照培養(yǎng)基比較，恢復(fù)率在50200之間。備注：

41、如該培養(yǎng)基用于控制菌白色念珠菌的檢查時，同時需要滿足控制菌項下培養(yǎng)基適用性檢查要求。Luzhou Institutes for Food and Drug Control培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱沙氏葡萄糖瓊脂+抗生素（當(dāng)細菌超標引起霉菌和酵母菌總數(shù)超標用）無菌性檢查取已滅菌的SDA注皿，于20-25培養(yǎng)57天，應(yīng)無菌落生長。試驗用菌種抑菌性檢查：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌促生長能力：白色念珠菌、黑曲霉常用抗生素1、慶大霉素：廣譜。對G-，G+菌有較好的抗菌作用。2、氯霉素：廣譜。對G-菌作用強；對G+菌作用不及青霉素與四環(huán)素。接種方法抑菌性：接種不少于100cfu試驗用菌。

42、促生長能力：接種不大于100cfu試驗用菌。適用性檢查白色念珠菌、黑曲霉于20-25培養(yǎng)不大于5天。與對照培養(yǎng)基比 較，恢復(fù)率在50200之間。枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌應(yīng)不得生長。Luzhou Institutes for Food and Drug Control樣品：烏雞白鳳丸烏雞白鳳丸烏雞白鳳丸胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基疑似菌落做革蘭染色 革蘭陽性桿菌 不屬于霉菌或酵母菌。將無菌硫酸慶大霉素將無菌硫酸慶大霉素（相當(dāng)于相當(dāng)于20mg20mg慶大霉素慶大霉素）胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。Luzhou Inst

43、itutes for Food and Drug Control選擇性培養(yǎng)基適用性選擇性培養(yǎng)基適用性控制菌檢查控制菌檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)基特性特性試驗菌株試驗菌株大腸菌大腸菌群群乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基促生長能力促生長能力E.coliE.coli乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生長能促生長能力力+指示能力指示能力E.coliE.coliEMB或麥康凱瓊脂或麥康凱瓊脂促生長能力促生長能力+指示能力指示能力E.coliE.coli大腸埃希菌大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力促生長能力E.coliE.coliMUG、EMB或麥康凱瓊脂

44、或麥康凱瓊脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生長能力促生長能力+指示能力指示能力E.coliE.coli沙門菌沙門菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基促生長能力促生長能力S S paratyphparatyphi i B B四硫磺酸鹽亮綠培養(yǎng)基四硫磺酸鹽亮綠培養(yǎng)基促生長能力促生長能力S S paratyphparatyphi i B BDHL或或SS瓊脂、瓊脂、EMB或麥康凱瓊脂或麥康凱瓊脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生長能力促生長能力+指示能力指示能力S S paratyphparatyphi i B B三糖鐵瓊脂三糖鐵瓊脂指示能力指示能力S S parat

45、yphparatyphi i B BLuzhou Institutes for Food and Drug Control選擇性培養(yǎng)基適用性選擇性培養(yǎng)基適用性控制菌檢查控制菌檢查培養(yǎng)基培養(yǎng)基特性特性試驗菌株試驗菌株銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力促生長能力P.aeruginosaP.aeruginosa溴化十六烷基三甲銨瓊脂溴化十六烷基三甲銨瓊脂抑制能力抑制能力S.aureusS.aureus促生長能力促生長能力P.aeruginosaP.aeruginosa綠膿菌素測定用培養(yǎng)基綠膿菌素測定用培養(yǎng)基抑制能力抑制能力E.coliE.coli促生長能力促生長能力+指示

46、能力指示能力P.aeruginosaP.aeruginosa金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基亞碲酸鹽肉湯培養(yǎng)基促生長能力促生長能力S.aureusS.aureus甘露醇高鹽瓊脂或卵黃氯化甘露醇高鹽瓊脂或卵黃氯化鈉鈉瓊脂瓊脂抑制能力抑制能力E.coliE.coli促生長能力促生長能力+指示能力指示能力S.aureusS.aureus抑制能力抑制能力E.coliE.coli梭菌梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力促生長能力ClCl. . sporogenessporogenes哥倫比亞瓊脂哥倫比亞瓊脂促生長能力促生長能力ClCl. . sporogenessporogenes白

47、色念珠菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯沙氏葡萄糖肉湯促生長能力促生長能力C.albicansC.albicans沙氏葡萄糖瓊脂沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力促生長能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans念珠菌顯色培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力促生長能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans1%聚山梨酯聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基玉米瓊脂培養(yǎng)基抑制能力抑制能力E.coliE.coli促生長能力促生長能力+指示能力指示能力C.albicansC.albicans微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證方法驗證S

48、OP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control檢測方法驗證標準（藥典）檢測方法標準（藥典）檢測方法實驗室在進行常規(guī)檢測前應(yīng)證明該實驗室可以滿足標準檢測方法 中的某些性能指標（即方法確認），并證明某一方法適用于某產(chǎn) 品的檢測（方法適用性包括陽性對照和陰性對照）。新建方法方法驗證與方法適用性藥典方法（其他成熟方法）方法轉(zhuǎn)移與方法確認（部分菌株的驗證）有案可查、溯源性 ； 建立實驗室自身的方法依據(jù)體系其他其他準確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、粗放性Luzhou Institutes for Food an

49、d Drug Control驗證的一般程序與環(huán)節(jié)驗證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理需前處理不需前處理不需前處理無抑菌作用無抑菌作用樣品樣品檢查檢查驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。驗證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。驗證抑菌活性去除的有驗證抑菌活性去除的有 效性，以及去除方法對污效性，以及去除方法對污 染菌生長、檢出的影響。染菌生長、檢出的影響?？梢酝ㄟ^驗可以通過驗 證實驗判斷證實驗判斷藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié)藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié)利用供試品與微生物的差異，降低或消除供試品的影響 通過模擬實驗對降低或消除效果加以檢驗。Luzhou Institutes for

50、 Food and Drug Control有抑菌作用有抑菌作用去除抑菌作用去除抑菌作用吐溫吐溫8080結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)乳化劑降低了混合體系中各組分的界乳化劑降低了混合體系中各組分的界 面張力，并在微滴表面形成較堅固的面張力，并在微滴表面形成較堅固的 薄膜薄膜由于乳化劑給出的電荷而在微滴表面由于乳化劑給出的電荷而在微滴表面 形成雙電層，阻止微滴彼此聚集，而形成雙電層，阻止微滴彼此聚集，而 保持均勻的乳狀液。保持均勻的乳狀液。Luzhou Institutes for Food and Drug Control分裝5份 9.9ml供試液+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.

51、1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液+ 0.1ml枯草芽孢桿菌液+ 0.1ml白色念珠菌液+ 0+.01m.1lm黑l黑曲曲霉霉菌菌液液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液+ 0.1ml枯草芽孢桿菌液+ 0.1ml金黃色葡萄球菌液+ 0.1ml銅綠假單胞菌液+ +00.1.1mml白l白色色念念珠珠菌菌液液+ 00.11mmll枯枯草草芽芽孢孢桿桿菌菌液液+00.1.m1mll金金黃黃色色葡葡萄萄球球菌菌液液+ 00.11mmll銅銅綠綠假假單單胞胞菌菌液液根據(jù)供試品的理化 特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備合適的供試液。稀釋度

52、依據(jù)樣品特稀釋度依據(jù)樣品特 性，質(zhì)量標準制定性，質(zhì)量標準制定計數(shù)方法適用性試驗保證平皿中的菌數(shù)不大于100cfuLuzhou Institutes for Food and Drug Control微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物限度案例某板藍根沖劑，標準為細菌數(shù)不得過1000cfu/g，某藥檢所細菌數(shù) 結(jié)論1200cfu/g，送中檢院仲裁。(1)方法適用性合格合格Luzhou Ins

53、titutes for Food and Drug Control不合格不合格Luzhou InstituteDrug Control菌種傳代保藏流程菌種傳代保藏流程1 BioBall3 推薦方式2 自動稀釋s for Food andLuzhou Institutes for Food and Drug Control試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超 過5代（從菌種保存中心獲得的冷 凍干燥菌種為第0 代）。代的定義：每接種一次即為一 代（有在新鮮的培養(yǎng)基上生長過程) 傳代示意圖：干燥菌種（0代）QCCV1CV2CV3液體培養(yǎng)基復(fù)蘇（1代）工作菌株傳代保藏規(guī)程菌種傳代流程S1S2 S3QCS1S2S

54、3 第二代工作菌懸液冷藏（零下20）cv1 CVcv2 cv3cv4QCCycle 1第一代儲備管 凍存（零下30或70 ）凍干菌種第二代工作菌斜面冷藏（28） 鑒別cv11cv2cv3cv36Cycle 2第二代儲備管凍存（零下30或70 ）QCTSBQC工作菌株傳代保藏流程示意圖Luzhou Institutes for Food and Drug Control。微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Contr

55、ol實驗操作實驗操作 物料進場物料進場消毒液搽拭消毒液搽拭 物品外表面物品外表面潔凈傳遞潔凈傳遞（風(fēng)淋、紫外照射）（風(fēng)淋、紫外照射）核心區(qū)外圍消毒劑清潔外表面外圍消毒劑清潔外表面Luzhou Institutes for Food and Drug Control雙層無菌包裝雙層無菌包裝外圍實驗操作實驗操作 人員進場人員進場一更Luzhou Institutes for Food and Drug Control二更Luzhou Institutes forFood and Drug Control硫乙 陰性 090423馬丁 陰性 090423馬丁樣品 090423硫乙樣品 090423馬丁

56、陽性 090423硫乙陽性 090423監(jiān)控平板樣品沉降菌 手指無菌檢驗框架示意圖無菌檢驗框架示意圖Luzhou Institutes for無菌三針單聯(lián)管無菌三針單聯(lián)管Food and Drug Control實驗過程監(jiān)控實驗過程監(jiān)控表面監(jiān)控手部監(jiān)控環(huán)境菌監(jiān)控Luzhou Institutes for Food and Drug Control無菌程序保障無菌程序保障無菌檢查樣品前處理無菌檢查樣品前處理分批消毒、實驗（混合） 統(tǒng)一消毒，統(tǒng)一實驗嚴格遵守外表面消毒程序嚴格遵守外表面消毒程序一般環(huán)境酚類 （phenylphenol/ tertiary amylphenol ） 潔凈環(huán)境過氧乙酸+

57、75%乙醇（無菌級）（苯式苯酚/三級戊基苯酚）增加過程監(jiān)控力度增加過程監(jiān)控力度 表面菌采樣、手部采樣（每批）、動態(tài)浮游菌采樣（下風(fēng)口）Luzhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes forFood and Drug Control明確標識Paper labels are preferredover marker pens.原始記錄原始記錄樣品信息&方法信息儀器信息&狀態(tài)檢驗結(jié)論前置 方便核驗校對&復(fù)核信息前置Luzhou Institutes for Food and Drug Control原始

58、記錄原始記錄樣品信息一致材料信息&試劑信息Luzhou Institutes for Food and Drug Control檢驗方法描述檢驗結(jié)果記錄原始記錄原始記錄樣品信息一致過程監(jiān)控信息包括監(jiān)控方案培養(yǎng)條件 培養(yǎng)結(jié)果 及培養(yǎng)基信息是否啟動偏差調(diào)查記錄Luzhou Institutes for Food and Drug Control原始記錄原始記錄樣品信息 環(huán)境保障調(diào)查儀器運轉(zhuǎn) 環(huán)境監(jiān)控檢驗操作調(diào)查 培養(yǎng)基、檢驗用具 陰性、陽性對照 操作細節(jié)結(jié)果判斷調(diào)查Luzhou Institutes for Food and Drug Control微生物檢驗的過程控制微生物檢驗的過程控制

59、環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷結(jié)果判斷過程控制Luzhou Institutes for Food and Drug Control結(jié)果判斷結(jié)果判斷Luzhou Institutes for Food and Drug Control 陽性（+）陰性（-） 供試品管渾濁，即判不合格 除非能充分證明試驗結(jié)果無效，即生長的微生物非 供試品所含 設(shè)備，環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果超標 回顧實驗過程，發(fā)現(xiàn)污染因素 鑒定微生物，確認是操作引入的無菌試驗經(jīng)確認無效，可重試藥品無菌檢驗的溯源性分析藥品無菌檢驗的溯源性分析藥品微生物實驗室環(huán)境/過程微生物

60、的監(jiān)測藥品的微生物檢測環(huán)境/過程細菌與藥品 細菌的比較結(jié)論產(chǎn)品污染實驗污染污染源排除重試溯源分析整改Luzhou Institutes for Food and Drug Control藥品微生物實驗環(huán)境微生物 的監(jiān)測藥品的微生 物檢測環(huán)境微生物與陽性結(jié)果的比較結(jié)論保證藥品微生物檢驗結(jié)果可靠的有效途徑過程微生物信息的全面性微生物鑒定結(jié)果的準確性Luzhou Institutes for Food and Drug ControlLuzhou Institutes for Food and Drug Control各類常見微生物的菌落特征各類常見微生物的菌落特征微生物類別菌落特征單細胞微生物菌絲狀微生物細菌酵母菌放線菌霉菌主 要