Bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)中文版說明書

1、bac-to-bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)試劑盒內(nèi)容物productcatalog iw.pusiblk vectorexpression controle-kprescdon system1035916pfajtbac1 1siipfilied: 20 pl at 0.5 lig/p.il inte. ph&.0il0ngtdtalsupplied: 20 pl at 0 2 inte( phs.o(4 ng tow)to bae? vectoi kit1c360-01 丄pfastbaclsupplied: 20 jil at 0.5 llg/pl inte pht.qilo ug to

2、talprdilbjll-cue,supplied； 20 pl at 0.2 ng/|il in te, ph 8.u (4 ng total)b.k-co-bac- htvectoi kit1c5s4-027pf 此pfastbactti b 茁遜詔垃匸sa甘plitiil: 20 pl tidtli lit 05 in re, ph &.0(10 ug tctjl of 己ckh vectaripfastbiu：mht-catsupplied: 1? pl at 1 up / ill lil tj, pt-ts.0 ；15 ng total)dualpf亦幅肌亠duals( qp

3、lied: 2u il at o s 口書丿ul in te, ph s.o lic pg totalpeistfiik? diial-gus/catsupplied 20 口1 rt u.2 ng/1 ln te, ph s.o (41 増tuul)introduction : overview : bac-to-bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)提供快速有效的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。此方法基于讓已經(jīng)轉(zhuǎn)入桿狀病的質(zhì)粒（桿粒）的位點(diǎn)特意轉(zhuǎn)座子的表達(dá)框的質(zhì)粒在ecoli 中擴(kuò)增。 bac-to-bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)主要包括：*pfastbac 捐獻(xiàn)質(zhì)粒的選擇，它要能夠產(chǎn)生包含目的位點(diǎn)的表達(dá)結(jié)構(gòu)，這個(gè)目的

4、基因的產(chǎn)生被桿狀病毒特意位點(diǎn)啟動(dòng)子控制。*一個(gè) ecoli 宿主， dhiobac , 包含桿狀病毒質(zhì)粒（桿粒）和輔助質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染pfastbac 表達(dá)結(jié)構(gòu)后可以產(chǎn)生重組桿粒。* 一個(gè)控制表達(dá)的質(zhì)粒，包括gus 和/或 cat 基因，以便在感染細(xì)胞后產(chǎn)生重組桿狀病毒，表達(dá)3 -葡萄糖酸酐酶和 /或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：使用這個(gè)系統(tǒng)產(chǎn)生重組桿狀病毒較傳統(tǒng)的同源重組有以下優(yōu)點(diǎn)：*與使用同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒所需的4-6 周相比，鑒別純化重組病毒少于兩周*減少了從斑點(diǎn)篩選重組病毒dna 所包含親緣和非重組病毒的幾率*可以快速同時(shí)進(jìn)行大量重組，適合表達(dá)功能性研究的蛋白

5、選擇 pfastbac 菌體（ vector ）: 大量的 pfastbac 菌體都適于進(jìn)行bac-to-bac 表達(dá)系統(tǒng)。選擇對于你的需要最合適的菌體。vector特點(diǎn)4 卄 參考l s tm, pfastbac 1高水平表達(dá)的強(qiáng)acmnpv 聚 乙烯（ ph）啟動(dòng)子用于簡單克隆的大量克隆位占八、an deron 1996l , l. tm 十pfastbac ht高水平表達(dá)的聚乙烯啟動(dòng)子；n-末端含有 6xhis ，可以用來純化重組蛋白，并可用tev蛋白酶切去；提供 3 個(gè)閱讀框polayes 1996tmpfastbac dual兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子（ ph 和 p10） 可以同時(shí)表達(dá)兩種蛋白；

6、兩個(gè)大的克隆位點(diǎn)harris 和 polaye 1997指南用途：指南提供了一個(gè)對于bac-to-bac 表達(dá)系統(tǒng)的概述，并對以下提供指導(dǎo)：1、 克隆目的基因到pfastbac?供體質(zhì)粒的選擇2、 轉(zhuǎn)化 pfastbac?結(jié)構(gòu)到最高效的dh10bactm產(chǎn)生重組質(zhì)粒3、 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒dna 到昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生重組桿狀病毒4、 擴(kuò)增滴定（ amplify and titer ）桿狀病毒株，使用病毒株感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)目的重組蛋白重要的： bac-to-bac 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是用來幫助你產(chǎn)生重組桿狀病毒，在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行高水平表達(dá)目的基因的系統(tǒng)。雖然他可以幫助你很容易的產(chǎn)生桿狀病毒表達(dá)你的重組蛋白，但

7、是使用這系統(tǒng)更傾向于有桿狀病毒生物學(xué)和昆蟲表達(dá)背景的使用者。我們高度推薦使用者具有病毒和組織培養(yǎng)的技術(shù)和知識。bac-to-bac表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)的成分：表達(dá)系統(tǒng)簡單高效的產(chǎn)生重組桿狀不能給黨?；趌uckow1993年的方法，此系統(tǒng)利用了位點(diǎn)特意的專座子tn7 區(qū)簡化和提高重組質(zhì)粒dna*系統(tǒng)的第一個(gè)成分是用來克隆目的基因的pfastbac?菌株?；趐fastbac?菌株的選擇，表達(dá)基因被acmnpv 的 ph或 p10 啟動(dòng)子控制，在昆蟲細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)表達(dá)框被tn7 的左右臂包圍，并且包含一個(gè)慶大霉素抗性點(diǎn)和sv40 多腺苷酸化信號，形成一個(gè)微型的tn7*第二個(gè)主要結(jié)構(gòu)是ecoli 的

8、 dh10bactm品系，用來作為pfastbac?菌株的宿主。 dh10bac tm細(xì)胞包含帶有微型 -atttn7 靶位點(diǎn)的病毒質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（詳細(xì)見下文）。一旦pfastbac?表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入dh10bac 細(xì)胞，轉(zhuǎn)化就會發(fā)生在pfastbac? 菌株的微型tn7 單位和微型 -atttn7 的靶位點(diǎn)之間產(chǎn)生重組質(zhì)粒。這個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)發(fā)生在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)化蛋白處。如果你已經(jīng)完成了轉(zhuǎn)化反應(yīng)，你需要分離這個(gè)高分子量的重組質(zhì)粒dna 并將質(zhì)粒 dna 轉(zhuǎn)染如昆蟲細(xì)胞趨產(chǎn)生重組桿狀病毒，用來進(jìn)行初步表達(dá)實(shí)驗(yàn)。在桿狀病毒株擴(kuò)增和滴定后，高效價(jià)的病毒株可以用來感染細(xì)胞，進(jìn)行大規(guī)模的重組蛋白的表達(dá)。桿狀病

9、毒菌株：病毒菌株（桿粒），bmon14272 （136kb ），在 dh10bac ecoli 中包括：* 一個(gè)低拷貝的微型 f 復(fù)制子*卡那霉素的抗性標(biāo)記*一個(gè)來自于puc 載體的編碼 lacza 肽的 dna 片段，用來接觸病毒轉(zhuǎn)座子，tn7 （微型 atttn7 ）已經(jīng)被插入。插入的微型 atttn7 不會中斷 lacza 肽的閱讀框。桿粒在具有卡那抗性的大的質(zhì)粒ecoli dh10bac中擴(kuò)增，在顯色物質(zhì)如bluo-gal 或 x-gal 和誘導(dǎo)劑 iptg 存在時(shí)，能補(bǔ)充染色體 lacz 的缺失形成藍(lán)斑（lacz+ ）輔助質(zhì)粒： dh10bac ecoli也包含輔助質(zhì)粒， pmon7

10、124 （13.2kb ），他編碼轉(zhuǎn)移酶和四環(huán)素抗性基因。這個(gè)輔助質(zhì)粒提供 tn7 轉(zhuǎn)化功能。圖示 bac-tobac 系統(tǒng)：下圖刻畫了重組病毒的產(chǎn)生和目的基因的表達(dá)pfas- tbar? doror ptamid培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞:一般指導(dǎo)：介紹：對于您的桿狀病毒轉(zhuǎn)移菌，我們推薦使用sf9 和 sf21 昆蟲細(xì)胞作為宿主。在開始你的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和表達(dá)之前，確定你有收獲的sf9 和 sf21 ，并將其凍存。使用無血清的介質(zhì)：昆蟲細(xì)胞可能在無血清的條件下收獲。我們推薦使用sf900 n sfm 。sf900 n sfm 對于維持 sf9和 sf21 以及對于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，都是無蛋白的最優(yōu)的介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)

11、輪廓:流程：下圖揭示了表達(dá)目的基因的一般步驟1、 pfastbac donor質(zhì)粒（步驟：目的基因的克隆） 得到2、 pfastbac 重組體（轉(zhuǎn)化至dniobac 細(xì)胞（含有桿粒和helper ）3、 含有重組桿粒的ecoli 細(xì)胞（重新劃線）得到4、驗(yàn)證過的含有重組桿粒的ecoli 細(xì)胞（過夜培養(yǎng)，分離重組桿粒5、 重組桿粒 dna （使用6、 p1 重組桿狀病毒株（7、 p2 重組桿狀病毒株（8、 蛋白的表達(dá)cellfectin 試劑感染細(xì)胞）得到106pfu/ml ）（感染昆蟲細(xì)胞擴(kuò)增病毒）107pfu/ml ）（滴定感染昆蟲細(xì)胞）得到dna ）得到得到得到ir-eotmbrintde

12、nar patmidone al imaesl怙rtraliai competent dhllobac? em019 trarvsp 網(wǎng)111苗ariwiote h =i*l lari cq ma rung recombvnam bacrnd recornbiridnl gene eposwri crvrdlajmplfncaiion 廠mg憤p審 sutei? ddrwe w 3 mutated (o att 13951 ttttactgtt ttcgtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ba/w hi 臉ii r 卻ii4001 &gatt

13、attca taccgtccca 匚匚atcgggcg cggatcccgg tccgaagcgc sv4fl polyadenylation sigcd4151 gtactagagg atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg克隆進(jìn)入pfastbacht a , b, c 介紹： pfastbac?ht載體由三個(gè)讀碼框（a , b, c ）提供的多克隆位點(diǎn)從而實(shí)現(xiàn)克隆目的基因，并且在 n 端帶有 6xhis?？寺。?pfastbac?ht菌株是融合菌株。為了保證表達(dá)重組蛋白，你必須：*克隆你的基因要帶有atg，位于 4050-4052 堿基對間。這

14、個(gè)將會產(chǎn)生融合表達(dá)，帶有6xhis 標(biāo)簽，可以用tev 切除*你的插入要含有終止密碼注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始atg。一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的ph 引導(dǎo)序列，可以提高表達(dá)的產(chǎn)量。蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點(diǎn)上游突變的atg （att），盡管如此，從這個(gè)位點(diǎn)起始的效率是低的，而且一般不干涉表達(dá)和重組蛋白的檢測pfastbactm ht a 的多克隆位點(diǎn)：下圖是pfastbac?ht a的多克隆位點(diǎn)。其實(shí)atg 用黑體標(biāo)出。限制性位點(diǎn)標(biāo)出來以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)。sfert of transcript icri 4c51&礙iiqcggaattca 甌i sa/1s

15、s/1 spti iaaggcctacg tcgac&aqct cactagtcgc gqccgctttc 4101畑iigaatctqagpst i i i i icctgcagtct cgaggcmgc心ni hfrfd iii i iggtaccaagc ttgtcgagaa start oltranwriplioni polyhedrin promoter i - a3901 tag at cat gg agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta wild-lype at g muta led to att- 1=13951 tttt

16、actgtt ttcgtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattccpfastbac? ht b 的多克隆位點(diǎn)：下圖是 pfastbac?ht a的多克隆位點(diǎn)。其實(shí)atg 用黑體標(biāo)出。限制性位點(diǎn)標(biāo)出來以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)。框住的核苷酸顯示出的是易變區(qū)域。4001 0504092 413 4417 6 4213atgicgtac tftcrcatcaccatcac catcac1gattaggatatcmetsertyrtyrr込hi shishishishisasptyrasplietev recognitb n siteehe 1 wco 1 bam h 1c

17、caacg acc廠gaaaacctgtattttcagggc11 1gccatg1gatccgfrothrthrg1uasnlentyrphegin.lglyalametaspproecdrisft/is尿ii g 日11 iigaattcaaaggc ctacgtcga cga gctcaactagtgcgg ccggluph alysglyl&iararg arg a lagluleuvalargproo viipst 1 xho 11kpm hindwii iicttt cgaatctagag cctgca gtc tcgaggcatgcggta ccaleuserasr-lm

18、gluproala vai serarghisalvaiproagcttgtcgagaastactagagga tca taa tca gccataccacserl已use工serthrargglyser *ggattattca taccgtccca ccatcgggcg cggatctcgg tccgaaacc6xhi& la tev cicavaqc sitesv40 polyadenylauon skiniili polyhednn promoter ?3901 tagatcatgg agataaitaa aatgataacc atctcgcaaa iaaataagta wild

19、-ly|jearg nfiutaied to att - - 3951 ttttactgtt itcgtaacag itttgtama aaaaaaccta iaaatattcc4001 ggattattca laccgtccca ccatcgggcg cggatcicgg tccgaaacc6xhis 創(chuàng)4050atg mettcg tac tacrcathiscac cat cachis hist v recugnilion siiejcatcac gat tac gathis asp tyr aspeh&1 n 曲 1 ban j h 1atc ilesertyrtyr4092一

20、啟acg accgaaaacctgtattttcagni iggc gccatg 3aiccprothrthrg1uasnlei;tyrphegintgly alahetgly5 ertevclcavdgc sitefcor iiiml1島丨1ssf 1 spe 1i nnot iii4134ggaattcaaaggcctacgtcg acgagc tcactagtc gcg gccglyi legluargpugthrw匚thrsersecleuvaialaalawspvmaipsflrk?i1gph1kpn 1|4176gctttcgaatctagagcctgcat；*t1ctcc；agg

21、ctgc ggtaccalaphegluserarg二丄ecysserleuglualacys glythr捕耐川1sv 40 polya1? riyladorizijili4218aagcttgtc gagaagtagtaga&gatcataatc agccatacca ? *lysleuvaig1ulgtyr* * 七pfastbactmht c 的多克隆位點(diǎn)：下圖是pfastbac?ht a的多克隆位點(diǎn)。其實(shí)atg 用黑體標(biāo)出。限制性位點(diǎn)標(biāo)出來以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)?？蜃〉暮塑账犸@示出的是易變區(qū)域。注意pfastbactmht c 在 xba i位點(diǎn)內(nèi)有一個(gè)終止密碼子, 他在 n

22、端標(biāo)簽框內(nèi)。確定你的基因的5端是在 xba i位點(diǎn)上游開始。start oj trjriscrip banma n crtranscripiitorii polyh 行寸iripprot | - a3 901 iatcatgg aiaaita jutgataacc tctcgcaaa taaataagia wlld-lypeatg mutated loatt113951 ttttactgtt ttggtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc4001 ggattattca taccgtccca ccatcgggcg cggatctcgg tccgaaacc

23、gxhis lag4050atgtcg tactag；rcatcaccat caccatcac1gattai?gat atcmetsertyrtyrhishishishi?hishisasptyraspfietev recognilion site1 wco1bamh 14092ccaacgacc廠gaaaacctgtat ttt匚加ggc1 1gccatgig3gatcprothxthrgluasnleutyrphegidjtgly alametglvlielevccav-aqc 自陸ec or 11磯丨111sg11wew 114134icgg aat tcaiaag gcc tacigt

24、c gac gag1ctc1actiagt cgc ggcarg asn s&rlys ala tyrva.1 asp gillleuthrser arg glynspmi陽1 畑1i lsph11 eprf i ii11 14176cgc ttt cgaatc tag agcctgcagt ctcgaggcat gcggtaccaaarg phe arghe *sv40 polyaderiylbtian signal4221 gcttgtcgag aagtactaga ggatcataat cagccntacc ?.克隆進(jìn)入pfastbac? dual介紹： pfastbac?dua

25、l包含兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)異源基因，一個(gè)通過ph 啟動(dòng)子控制，另一個(gè)通過p10啟動(dòng)子控制。參見下列建議以便有助于你的基因克隆克隆事項(xiàng)： pfastbactmdual 是一個(gè)非融合載體。為了保證重組蛋白的表達(dá)，你的插入必須含有以下兩點(diǎn)* 一個(gè) atg 起始密碼子*如果你不使用多克隆位點(diǎn)中的終止密碼子，就必須要有一個(gè)終止密碼子注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始atg。一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的ph 引導(dǎo)序列，可以提高表達(dá)的產(chǎn)量。對于插入克隆上游的聚乙烯啟動(dòng)子，注意到蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點(diǎn)上游突變的atg（ att ），盡管如此，從這個(gè)位點(diǎn)起始的效率是低的，而且一般

26、不干涉表達(dá)和重組蛋白的檢測。ph啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)：下圖是 pfastbactmdual 中 ph 啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)的圖示。限制性位點(diǎn)標(biāo)記出來顯示了實(shí)際的切刻位點(diǎn)。潛在的終止密碼子有下劃線標(biāo)出。pol/hedrm prorrioteratggagataa ttaaaat&at aaccatctcg caaataaata agtat tttac wiw -type atg iwiated to aitps( i xhol wnd iiihsv tit pdya 灰nylation signal轉(zhuǎn)化和分析介紹：如果你已經(jīng)完成了你的連接反應(yīng)，你就要準(zhǔn)備把你的pfastbac?結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)

27、化進(jìn)ecoli 了。很多 ecoli 宿主菌和轉(zhuǎn)化程序都是可以使用的。一般推薦轉(zhuǎn)化ecoli 和分析轉(zhuǎn)化在下面列出ecoli宿主：一旦你把你的插入序列克隆進(jìn)入了pfastbactm，你需要轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)到ecoli ，并選擇優(yōu) amp 抗性的轉(zhuǎn)化株。你可以使用任何reca , end a ecoli 菌。包括 topio, dh10b或者 dh5 a 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。不要轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)進(jìn)入dhiobac 細(xì)胞。注意 top10 和 dh10b 感受態(tài)細(xì)胞可以從invitrogen 得到轉(zhuǎn)化方法：你可以選擇使用任何方法對ecoli 進(jìn)行轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化是最便利的方法，而電轉(zhuǎn)對大質(zhì)粒是最有效的方法。選擇好轉(zhuǎn)化

28、株，使用含有100ug/ml amp的 lb 平板。轉(zhuǎn)化株分析：一旦你得到 amp 抗性轉(zhuǎn)化株，我們有以下推薦：1、 選出 10 個(gè)轉(zhuǎn)化株，在含有100ug/ml 的 amp 的 lb 或 s.o.b 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)scan oftr an &cri 4531tgttrtcgta acagttttgt aataaaaaaa cctataaata ttccggatta rsrll0ssh ii fcor i 4561 ttcataccgt cccaccatcgggcgcggatcccggtccgaagcgcgcggaaskjl sam4?31ttcaaaggcc tacgtcgacgag

29、ctcactagtcgcggccgctttcgaarct 44814731agagcctgca gtctcgacaa gcttgtcgag aagtactaga gqatcataat 匚agc 匚at acc acatttgtag aggtttt 耳ct tgctttaaaa jacctcccac p10啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)：下圖是 pfastbactmdual 的 acmnpv p10啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)。限制性位點(diǎn)標(biāo)記出來以便顯示實(shí)際切刻位點(diǎn)。潛在的終止密碼子標(biāo)記下劃線。4460start oftranscripliontatacggac 匚tttaattcaa c cca ac ac

30、 a a tatattatag ttaaataagsa plo proinotfer4jl0at tattatca aatcatttgt atattaatta aaatactata ctc；taaatta xhoigacgaagact tgatcacccg ggatctcgag 忖co 1 nhe1pvuiinst 1sp4310ccatggtgcragcagctgatgcatagcatc42 60ggctaactga aacactgaag gagacaatac cgqaaggaac ccgcgctatg4360cattitatttacaatcactccgc；ta匚cggg agatggc ；

31、gc；ai2、 使用你選的方法分離質(zhì)粒dna 。我們推薦使用公司的試劑盒3、 使用限制性方法分析質(zhì)粒，證明是重組質(zhì)粒并證明插入起始的正確。使用限制性酶或者酶化合物對vector 和插入端各進(jìn)行一次酶切。使用 pcr對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析：你也可以使用pcr 方法對陽性轉(zhuǎn)化株進(jìn)行分析。使用合適的pcr 引物和 amp 條件。如果你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行試驗(yàn)。使用錯(cuò)誤的引物或污染的平板可能會得到假象。以下方法可以給你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真pcrsupermix ，合時(shí)的 pcr 前后引物過程： 1、對于每個(gè)樣品，在0.5ml 的小離心管加入48ul 的高

32、保真 pcr supermix和各 1ul 的前后引物。2、 選出 10 個(gè)克隆，在上述離心管中進(jìn)行重懸（記得做一個(gè)patch 板保護(hù)克隆以便進(jìn)行更深的分析）3、 94 度 10 分鐘溶解細(xì)胞滅活核酸酶4、 20-30 個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增5、 延伸使用 72 度 10 分鐘。 4 度儲存6、 瓊脂糖凝膠電泳檢測測序：對于你的結(jié)構(gòu)需要進(jìn)行測序證明目的基因是正確的起始以便表達(dá)。如果你是將基因克隆進(jìn)入了pfastbactmht , 證明的基因進(jìn)入了n 末端標(biāo)簽的讀框中。長期保存：一旦你證明了測序的正確，確定克隆的純度并制作甘油菌長期保存。推薦儲存質(zhì)粒dna 在-20 度1、 在含有 100ug/ml 的

33、 lb 平板上對原始的克隆進(jìn)行劃線培養(yǎng)2、 挑單克隆在 1-2ml 含有 amp 的 lb 撫育3、 培養(yǎng)至穩(wěn)定期4、 在 0.85ml 的培養(yǎng)物中混合0.15ml 的過濾甘油，轉(zhuǎn)到冷凍小管5、 -80 度儲存重組質(zhì)粒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化到 dhiobac ecoli 介紹：一旦你有了你的pfastbactm結(jié)構(gòu)，你就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化純化的質(zhì)粒dna 進(jìn)入 dh10bactm ecoli ，轉(zhuǎn)變成為桿粒。你可以使用藍(lán)/白斑選出含有重組桿粒的克隆。bac-tobac 表達(dá)系統(tǒng)提供高效dh10bactm感受態(tài)細(xì)胞。陽性對照：每個(gè)pfastbac?質(zhì)粒都提供相應(yīng)的陽性對照用來作為陽性轉(zhuǎn)染和表達(dá)對照（下表）。根據(jù)p

34、fastbactmvecctor的使用，我們推薦在你的dh10bac 轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中作相應(yīng)的對照。pfastbac? vectorcontrol 卩l(xiāng)asmidpfatbac?!pfastbacml-gu5pfastbacht-catpfastbac? dualpfastbaf ehiai-gu;/ cat所需材料：開始之前你需要有以下材料*純化的pfastbactm結(jié)構(gòu)（ 200pg/ul 儲存于ph8.0 的 te）*陽性表達(dá)對照*高效 dh10bactm感受態(tài)細(xì)胞（表達(dá)系統(tǒng)提供，每個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)使用1 管細(xì)胞）*puc19 （與 dh10bac 一起提供，用來做對照）*lb 平板，包含 kan，

35、gen （慶大）， tetracycline （四環(huán)素）， bluo-gal （鹵代吲哚基 -beta-d- 半乳糖苷）和iptg。（每個(gè)轉(zhuǎn)化 3 個(gè)板，使用新鮮平板，推薦見下文）*lb 板含有 100ug/mlamp （用于 puc19 轉(zhuǎn)化對照）*s.o.c 介質(zhì)*15ml 圓底塑料管*42 度水域和 37 度搖床及 37 度培養(yǎng)箱。你需要準(zhǔn)備lb 瓊脂糖平板 , 包含 50ug/ml kan ,7ug/ml gentamicin , 10ug/ml tetracycline , 100ug/ml biuo-gal ,40ug/ml iptg , 用來進(jìn)行 dh10bactm轉(zhuǎn)化株的篩選。

36、可以從我公司預(yù)訂抗生素，bbluo-gal ，iptg，在后面有制備平板的指導(dǎo)。如果你正準(zhǔn)備的 lb 平板使用的是事先混合好的，我們推薦使用luria broth base代替 lb。使用 lb 板將會降低顏色敏感度，并可能降低克隆的數(shù)量。注意：在藍(lán) /白斑篩選中使用bluo-gal 代替 x-gal。 bluo-gal 產(chǎn)生的藍(lán)斑顏色要比x-gal 深。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化：對于每個(gè)轉(zhuǎn)化，你都需要一小瓶感受態(tài)細(xì)胞和三個(gè)平板。*42 度水域平衡*37 度烘板 30 分鐘*室溫放置 soc 介質(zhì)*對于每個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)預(yù)冷一個(gè)15ml 管子轉(zhuǎn)化過程：按照以下過程用高效dh10bactm感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化pfastba

37、c?結(jié)構(gòu)。我們推薦做陽性對照的轉(zhuǎn)化來幫助你證明你的結(jié)果。1、 整管高效 dh10bactm感受態(tài)細(xì)胞冰上解凍。2、 每個(gè)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，輕輕地混合，將100ul 高效 dh10bactm感受態(tài)細(xì)胞倒入預(yù)冷的15ml 管子3、 向細(xì)胞中加入適量的質(zhì)粒dna ，輕輕混合。千萬不要上下吹吸混合*pfastbactm結(jié)構(gòu)： 1ng（5ul）*pfastbactm對照質(zhì)粒： 1ng *puc19 對照： 50pg（ 5ul）4、 冰上撫育 30 分鐘5、 42 度熱激 45 秒6、 立即冰上 2 分鐘7、 加入 900ul 室溫的 soc 培養(yǎng)基8 pfastbac?轉(zhuǎn)化： 37 度 225 轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng) 4

38、小時(shí)。 puc19轉(zhuǎn)化： 37 度 225 轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng) 1 小時(shí)9、 對于每個(gè) pfastbactm的轉(zhuǎn)化：準(zhǔn)備10 折連續(xù)（不知道什么意思）用soc 稀釋的細(xì)胞（ 10-1，10-2，10-3）， 每個(gè)稀釋用 100ul 鋪一個(gè)lb 平板，平板包含50ug/ml kan ， 7ug/ml gentamicin， 10ug/ml tetracycline， 100ug/ml biuo-gal ，40ug/ml iptg 。對于puc19 轉(zhuǎn)化：用soc 培養(yǎng)基1: 100 稀釋細(xì)胞，鋪100ul 稀釋 物在含有100ug/mlamp的 lb 平板。10、 37 度撫育 48 小時(shí)。分析篩選的克

39、隆（參見推薦）。注意：我們不推薦早于48 小時(shí)挑單克隆，因?yàn)檫@樣可能會難于區(qū)分藍(lán)白斑。重要的：微型tn7 插入到微型 atttn7 附屬位點(diǎn)會干擾lacza 肽的表達(dá)，所以包含重組質(zhì)粒的克隆在藍(lán)色背景下是白色的，可能隱藏在未改變的質(zhì)粒中。選擇白斑分析。真正的白斑克隆比較大；因此為了避免選擇成假陽性，選擇最大的，最獨(dú)立的白斑。避免挑出現(xiàn)灰色的或者在中間的菌落，因?yàn)樗麄兛赡苁前召|(zhì)粒的細(xì)胞核重組細(xì)胞的混合。驗(yàn)證顯性 : 1、挑 10 個(gè)白色的克隆，重新劃線在新鮮lb 平板（ 50ug/ml kan ，7ug/ml gentamicin， 10ug/ml tetracycline，100ug/ml

40、 biuo-gal ， 40ug/ml iptg ）。37 度過夜培養(yǎng)。2、 在包含 bluo-gal 和 iptg 的重新劃線的平板上選出單克隆證明是白色的顯性，嫁接至有50ug/ml kan ，7ug/ml gentamicin， 10ug/ml tetracycline 的液體中3、 使用我公司的試劑盒抽提重組質(zhì)粒dna 。選擇性的，你可以使用附錄提供的操作步驟。這個(gè)過程源于抽提大的質(zhì)粒dna （ 100kb ），適用于分離質(zhì)粒dna 。4、 分析重組質(zhì)粒dna 證明成功轉(zhuǎn)化到了桿粒中。我們推薦使用pcr 分析桿粒 dna 。注意：適用瓊脂糖凝膠電泳可以證明轉(zhuǎn)化的成功與否，他可以分出高分

41、子量的dna。這個(gè)方法要比pcr分析可信度低，因?yàn)楦叻肿恿縟na 是很難見到的。使用 pcr 分析重組質(zhì)粒介紹：重組桿粒dna 要大于 135kb 。既然限制性分析很難完成這么大的dna 分析，我們推薦使用pcr 分析鑒定重組桿粒中的目的基因。桿粒包含m13 正負(fù)引物位點(diǎn)，位于lacza 互不區(qū)域的微型atttn7 位點(diǎn)兩側(cè)，可以完成pcr 檢驗(yàn)。本節(jié)提供使用m13引物的 pcr 檢驗(yàn)指導(dǎo)。m13(-40lf oward使用 m13引物進(jìn)行 pcr 分析：使用 pcr 法證明你的目的基因在重組桿粒中，你可能會: *使用 m13forward ( -40)和 m13 reverse 引物*使用

42、m13forward ( -40 ) 或 m13 reverse引物于你的插入片段雜交成聯(lián)合物primerseqiientecatidogiio.m13 forward (40)dgttttcccagtc acg ac3rn540-02ml 3 rjeveise51 dcaggaaacagctatgac 3-n530-02dna 聚合酶：你可能會使用任何dna 聚合酶在你的pcr 試驗(yàn)中，包括platinum taq酶。如果希望pcr 產(chǎn)物 4kb, 我們推薦使用聚合酶混合物。例如高保真的plat in um taq酶得到 pcr產(chǎn)物：使用下面過程擴(kuò)增重組桿粒dna , 適用 m13 正反引物

43、和 platinum taq酶。如果你使用m13f 或 m13 r與一個(gè)你的基因特意引物混合，你需要自己決定擴(kuò)增的條件。如果你使用其它的聚合酶，依照供應(yīng)商提供的建議。注意：如果你的插入片段 4kb 擴(kuò)增條件需要被優(yōu)化.1、每個(gè)樣品，在0.5ml 微型管子中裝入50ul 的量進(jìn)行 pcr 反映重組桿粒dna ( 100ng ) 1ul10xpcr buffer5ul10mm dntp mix5ul50mm mgcl 21.5ulpcr 引物 (1.25ul/10um ) 2.5ul蒸餾水38.5總體積50ul2、一滴礦物油覆蓋3、一下參量進(jìn)仃擴(kuò)增steptimetemperaturecycles

44、iiiitial dena titration3 miituteh93 cindenaturdtion45 setoncb94 c25-35xannealing45 seconds55 cextension5 mmutes72 cfinal extension7 minutes72 cix4、從反應(yīng)產(chǎn)物吸取5-10ul 進(jìn)行瓊脂糖電泳分析samplesize of pcr productbacmid 昆蟲細(xì)胞系：推薦使用sf9 和 sf21 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。high five? and mimic ? sf9不推薦因?yàn)樗麄冝D(zhuǎn)染效率低下。不過，如果你有了你的桿狀病毒株，你可以進(jìn)行high five ?

45、 and mimic ? sf9表達(dá)試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染介質(zhì)：為了高效的轉(zhuǎn)染，我們推薦在無grace 的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染。注意grace 的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)該不含有 fbs （血糖），因?yàn)榈鞍自谘呛推溲a(bǔ)充物中會與cellfectin 試劑互作，影響轉(zhuǎn)染。注意：如果你在sf-900 n sfm 中收獲了sf9 或 sf21 ，你可以在不含有g(shù)race 的培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后可以容易的將 sf-900 n sfm 轉(zhuǎn)變回去陽性對照：如果你有了從pfastbac 對照質(zhì)粒中得到的重組桿粒，我們推薦，包括這個(gè)陽性對照在你的試驗(yàn)中和轉(zhuǎn)化中能夠評估你的結(jié)果。在這些桿粒中，包括3 -葡糖甘酶（ gus

46、）和 /或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（cat ）將會在 ph 或者 p10 啟動(dòng)子控制下表達(dá)。在轉(zhuǎn)染過后，表達(dá)的gus 和 cat 可以適當(dāng)進(jìn)行驗(yàn)證。所需材料：開始之前需要有下列材料：*從 pfastbac?結(jié)構(gòu)（ 500ng/ul te 溶解， ph8.0 ）中純化的重組桿粒dna *從合適的 pfastbac?對照結(jié)構(gòu)中純化的重組桿粒dna*合適培養(yǎng)基收獲的sf9 或者 sf21*cellfectin 試劑（ 4 度保存）*graces 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，未被補(bǔ)充的（培養(yǎng)基不含有補(bǔ)充劑，fbs 或者抗生素）*6 孔培養(yǎng)板或者其它組織培養(yǎng)用具*12x75mm 滅菌管*培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的完全培養(yǎng)基計(jì)算出你的轉(zhuǎn)

47、染試驗(yàn)所需的sf9 細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行擴(kuò)增。轉(zhuǎn)染前確定細(xì)胞健康且繁殖能力97%。轉(zhuǎn)染條件：我們通常使用下列條件在sf9 中擴(kuò)增桿狀病毒株。對于你的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)這些條件應(yīng)該作為一個(gè)起始點(diǎn)，你可以通過改變 dna 和 cellfectin 試劑的濃度以及細(xì)胞密度對條件進(jìn)行優(yōu)化。conditionamounttitie ciiltuit? plate stzeb-wll (33 niiyl) plate (one well per bacmid)ntimbei ct sf9 cells to trsfect9 x 105 cellsamount o bcmid dna1 ug (can vaiy from

48、1 to 2 jig)amoiuit of cellfectm1 reagent6 訕(can vary from 1,5 to 9 山)轉(zhuǎn)染步驟：適用下列步驟在6 孔板進(jìn)行 sf9 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。如果你想在其它細(xì)胞培養(yǎng)用具中轉(zhuǎn)染細(xì)胞，你需要對你的條件進(jìn)行優(yōu)化。記得使用無補(bǔ)充的graces 培養(yǎng)基，他不含有fbs 或抗生素1、 在 6 孔板或 35mm 組織培養(yǎng)板，與每個(gè)孔2ml 含有抗生素的培養(yǎng)基中（例如：2ml 的 sf900h sfm 包含 50 單位/ml 青霉素和 50ug/ml 鏈霉素）接種9x105sf9 細(xì)胞。2、 27 度細(xì)胞最少接觸1 小時(shí)3、 對于每個(gè)轉(zhuǎn)染的樣品，準(zhǔn)備桿粒d

49、na : cellfectin 試劑混合在 12x75mm 的滅菌管中1） 將 1ug 純化的桿粒dna 稀釋進(jìn)入 100ul 未補(bǔ)充 grace 培養(yǎng)基2） 完全混勻 cellfectin 試劑，翻轉(zhuǎn)混合5-10 次。吸出 6ulcellfectin 試劑稀釋進(jìn) 100ul 未補(bǔ)充 grace 培養(yǎng)基。3） 使用稀釋的cellfectin 試劑連接稀釋的桿粒dna （總體積約 210ul ）。輕混合，室溫?fù)嵊?5-45 分鐘。4、 在 dna/ 脂肪混合體撫育過程中，從細(xì)胞中除去培養(yǎng)基并用2ml 未補(bǔ)充 grace 培養(yǎng)基清洗。棄去清洗培養(yǎng)基。5、 向每個(gè)含有混合體的管子中加入0.8ml 未

50、補(bǔ)充 grace 培養(yǎng)基，清混勻，將混合體加入到含有細(xì)胞的孔中。6、 27 度培養(yǎng) 5 小時(shí)7、 棄去 dna/ 脂肪混合體，向細(xì)胞中加入2ml 全培養(yǎng)基（例如sf900sfm 含有抗生素）& 27 度潮濕條件撫育72 小時(shí)或者指導(dǎo)你開始能夠看到病毒感染的現(xiàn)象。提取 p1病毒株。分離 p1 病毒株介紹：帶有芽孢的病毒應(yīng)該在轉(zhuǎn)染以后釋放入培養(yǎng)基72 小時(shí)。但是，如果你的轉(zhuǎn)染效率不好，細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)染后的4-5天也沒有被病毒感染的跡象。轉(zhuǎn)染過后的72 小時(shí)，你需要親自檢查細(xì)胞是否有感染信號（下表）一旦細(xì)胞出現(xiàn)感染，使用下列步驟從培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞。感染細(xì)胞的特性：使用倒差顯微鏡在250-400

51、x 觀察感染細(xì)胞時(shí)，可以看到病毒感染的細(xì)胞具有以下特點(diǎn)：感染記號顯性描述早期（第一個(gè)24 小時(shí)）細(xì)胞直徑增加可以看到直徑增大了25-50%細(xì)胞核增大細(xì)胞核可能充滿細(xì)胞晚期（ 24-72 小時(shí)）細(xì)胞停止增長與單個(gè)細(xì)胞相比，細(xì)胞不再增大出現(xiàn)顆粒體病毒芽孢信號，出現(xiàn)小泡分離細(xì)胞從平板或曲頸瓶脫離很晚期（大于72 小時(shí)）細(xì)胞消亡細(xì)胞出現(xiàn)消亡，單層細(xì)胞開始出現(xiàn)消亡制備 p1病毒株： 1、一旦從第 8 步得到轉(zhuǎn)染細(xì)胞，上述的晚期轉(zhuǎn)染現(xiàn)象出現(xiàn)，就可以從每個(gè)孔中收集含有病毒的細(xì)胞, 并轉(zhuǎn)入滅過菌的15ml 帶蓋管子。 500xg 離心 5 分鐘除去細(xì)胞和大的碎片2、將上清轉(zhuǎn)到新的15ml 離心管。這就是p1

52、病毒株。 4 度避光儲存。儲存信息見下頁注意：如果你希望濃縮的病毒株，你可以在離心后，使用0.2um 低蛋白吸附的濾器完成。病毒株的儲存：按下列條件儲存：1、 避光， 4 度2、 如果培養(yǎng)基不含血清，加入fbs 至終濃度為 2%，血清可以作為蛋白酶底物。3、 對于長期保存，重新擴(kuò)增后保存整株病毒于-80 度4、 不要在 4 度時(shí)儲存經(jīng)常使用的病毒。重復(fù)凍融會降低病毒的滴度。下一步：得到你的純化p1 桿狀病毒株之后，你可以：1、 擴(kuò)增毒株（下節(jié)詳細(xì)介紹）這個(gè)過程推薦得到最高滴度的毒株，而且在你的試驗(yàn)中優(yōu)化結(jié)果2、 決定你的毒株的滴定度（見病毒斑點(diǎn)試驗(yàn)）3、 如果你希望，純化你的病毒結(jié)構(gòu)4、 使用

53、 p1 病毒株感染sf9 進(jìn)行表達(dá)預(yù)試驗(yàn)。注意：如果你想做一個(gè)小規(guī)模的或者是預(yù)試驗(yàn)，你可以直接使用p1 毒株感染 sf9 進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)。由于毒株數(shù)量小，表達(dá)條件可能不能再生（如果滴度未知，moi 是不可知的）擴(kuò)增你的病毒株介紹： p1 毒株是小規(guī)模，低滴度的毒株，你需要使用這株去感染細(xì)胞，從而產(chǎn)生高滴度的p2 株。轉(zhuǎn)染 sf9 細(xì)胞得到的首株的滴度一般為1x106到 1x107pfu/ml 。用以下步驟擴(kuò)增得到的p2 株滴度為 1x107到 1x108pfu/ml 。本章提供p2 株的制備和指導(dǎo)所需材料： sf9 或 sf21 ； p1 病毒株；合適的培養(yǎng)用具；組織培養(yǎng)試劑；27 度潮濕培養(yǎng)箱

54、重要的：擴(kuò)增p1 病毒株，需要感染sf9 或者 sf21，使用懸浮或單層培養(yǎng)。根據(jù)你的需要，你可以任何規(guī)模的擴(kuò)增，但是你因你使用的p1 菌株的量受到限制。一般擴(kuò)增p1 在 10ml 懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng)2x10 6細(xì)胞/ml 或在 6 孔板培養(yǎng) 2x106 細(xì)胞 /ml。計(jì)算感染所需的sf9 細(xì)胞，隨后 expand 細(xì)胞。使用前確定你的細(xì)胞健康并且繁殖力大于97%多樣性感染（ moi ）：為了擴(kuò)增毒株，在多樣性感染細(xì)胞的范圍是0.05-0.1 。moi 就像每個(gè)細(xì)胞的病毒數(shù)量一樣需要定義。使用下列公式計(jì)算獲得特定的moi 需要多少病毒株：丫_ 1 moi （ptu / cell） x numbe

55、r ot cells inoculum required （ml ）=（一匚 # 人）titer ol mal stock pfu/ml）注意：如果你沒有滴定你的p1 毒株，你需要假定滴度范圍是1x106至 107pfu/ml例如：需要感染10ml 細(xì)胞， 2x106細(xì)胞 /ml，使用 m0i =0.1 我們假定 p1 毒株的滴度是5x106pfu/ml 。iiioctiltim iequii_ed (ml) = 0.4 nil擴(kuò)增步驟：依照下列步驟在6 孔板擴(kuò)增 p1 毒株1、 感染當(dāng)天，準(zhǔn)備sf9 和 sf21 細(xì)胞上清和細(xì)胞板，2x106細(xì)胞 /孔。接觸培養(yǎng)細(xì)胞室溫1 小時(shí)2、 1 小時(shí)

56、后倒差顯微鏡檢查細(xì)胞的吸附情況3、 每孔加入合適數(shù)量的p1 毒株4、 27 度潮濕培養(yǎng)箱撫育細(xì)胞48 小時(shí)5、 感染后 48 小時(shí)，從每個(gè)孔收集2ml 含有病毒的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)到15ml 的管子。 500xg 離心 5 分鐘棄去細(xì)胞和碎片。注意：可以在感染晚期收獲病毒（72 小時(shí)）。每個(gè)桿狀病毒的結(jié)構(gòu)決定了優(yōu)化收獲時(shí)間。過度培inoculum required (ml)-(up陽skio6 pfu/nil 養(yǎng)將會由于細(xì)胞的調(diào)亡使生殖能力衰減6、 將上清轉(zhuǎn)到 15ml 管子。這是 p2 毒株。 4 度避光保存。長期保存需要整株在-80 度7、 檢測你的p2 毒株的滴度梯度擴(kuò)增步驟：一旦你有了高滴度的

57、p2 桿狀病毒毒株，你可以梯度增加擴(kuò)增病毒至任何體積。為了產(chǎn)生高滴度的p3，梯度擴(kuò)增的細(xì)胞量和病毒體積要適當(dāng)，遵照本章指導(dǎo)從冰凍的主毒株獲得高滴度毒株：如果你儲存你的毒株在-80 度，我們推薦使用此株產(chǎn)生另外的高滴度毒株進(jìn)行表達(dá)試驗(yàn)。當(dāng)病毒在 -80 度保存時(shí)，滴度會降低。下面為指導(dǎo)和擴(kuò)增過程病毒斑點(diǎn)試驗(yàn) ( performing a viral plaque assy) : 介紹：我們推薦使用斑點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行：決定你毒株的滴度；斑點(diǎn)純化病毒（可選）試驗(yàn)框架：決定病毒的滴度，你需要1、 在 6 孔板的sf9 細(xì)胞2、 準(zhǔn)備 10-flod 連續(xù)稀釋的病毒株3、 將不同稀釋的桿狀病毒加入到sf9 和

58、感染細(xì)胞中1 小時(shí)4、 棄去病毒覆蓋細(xì)胞層使用plaquing 培 養(yǎng)基5、 撫育 7-10 天計(jì)算每個(gè)稀釋物中的斑點(diǎn)病毒滴度影響因素：影響滴度的因素很多：1 、 目的基因的大小。滴度一般會隨著目的基因的增大而減小2、 轉(zhuǎn)染效率。為了高的轉(zhuǎn)染效率，我們推薦使用cellfectin 試劑轉(zhuǎn)染 sf9。準(zhǔn)備 dna/ 脂質(zhì)體混合物在非補(bǔ)充grace 昆蟲培養(yǎng)基3、 桿狀病毒株的年齡。長期保存在4 度或者-80 度病毒的滴度都會減弱。如果你的病毒株已經(jīng)保存了6 個(gè)月 -1 年我們推薦在使用前滴度或者重新滴度病毒4、 凍融次數(shù)。如果你儲存在-80 度，每次凍融都會降低病毒10%的滴度5、 錯(cuò)誤的儲存方

59、式。為了經(jīng)常使用，病毒株應(yīng)該整株的保存在4 度避光條件所需材料：實(shí)驗(yàn)前所需材料：1 、 你的澄清的桿狀病毒株（使用前存在4 度）2、 適當(dāng)培養(yǎng)基中的sf9 或 sf21 （每個(gè)被滴度的桿狀病毒株為30ml 對數(shù)期細(xì)胞， 5x105細(xì)胞 /ml）3、 sf900h sfm 或其它合適的完全生長培養(yǎng)基4、 sf900 培 養(yǎng)基 （1.3x ） （100ml ; 或其它何時(shí)的培養(yǎng)基）5、 4%瓊脂糖凝膠6、 滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)級別的蒸餾水7、 100ml 滅菌的玻璃瓶8、 6 孔子之培養(yǎng)板（每個(gè)毒株2 個(gè)板用來滴定）9、 無菌臺10、 40 度和 70 度水域11、微波爐（可選）12、 27 度潮濕培養(yǎng)

60、箱注意 ：如果你在血清補(bǔ)充培養(yǎng)基培養(yǎng)sf9 （完全tnm-fn ）。你需要有以下試劑1 、 grace 昆蟲培養(yǎng)基，補(bǔ)充過的2、 grace 昆蟲培養(yǎng)基（2x ）3、 胎牛血清（ fbs）, 高質(zhì)量的熱滅火的準(zhǔn)備斑點(diǎn)培養(yǎng)基（plaquing medium ）：斑點(diǎn)培養(yǎng)基由培養(yǎng)基和瓊脂糖混合組成，對于斑點(diǎn)試驗(yàn)用來固定昆蟲細(xì)胞。在開始下列步驟前立即準(zhǔn)備斑點(diǎn)培養(yǎng)基。如果你培養(yǎng)sf9 在 sf900n sfm 中，那準(zhǔn)備sf900 斑點(diǎn)培養(yǎng)基。如果你培養(yǎng)是在 tnm-fh ，準(zhǔn)備grace 斑點(diǎn)培養(yǎng)基。注意其它培養(yǎng)基也可以使用1、 在微波爐或者70 度水域20-30 分鐘溶化4%的瓊脂糖凝膠，溶化之后，下列物質(zhì)放入40 度水域* 空的，滅菌的100ml 瓶子*sf-900 培養(yǎng)基（ 1.3x