谷氨酸甲基化修飾基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜研究

1、谷氨酸甲基化修飾基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜研究摘要htss利用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行 時間質(zhì)譜(malditof/tof)高置信度地鑒定了枯草芽胞桿菌 中的蛋白酶抑制劑和桿菌肽f兩種蛋白及其翻譯后修飾，發(fā) 現(xiàn)在這兩種蛋白質(zhì)中共有5個肽段發(fā)生谷氨酸甲基化，其中 肽段 felvvydsehk 存在 fe (methylation) lvvydsehk 和 felvvydse ( methylatio n) hk 兩種形式。結(jié)果表明， maldit0f/t0f高能cid所提供的豐富斷裂信息和全質(zhì)量范圍 掃描對提高分析結(jié)果的確定性具有重要作用。此外，這5個 甲基化肽段都可以檢測到相對含

2、量更高的非甲基化肽段，這 為降低分析結(jié)果的假陽性提供了輔助判據(jù)。在低質(zhì)量區(qū)檢測 到甲基化賴氨酸的亞胺相關(guān)離子m/z 98和143,說明發(fā)生了 賴氨酸的甲基化；檢測到m/z 116則提示發(fā)生了谷氨酸甲基 化。1引言蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(posttranslational modifications, ptms)是一個高度動態(tài)和多樣化的過程， 與嚴(yán)格的基因表達(dá)調(diào)控方式相比，ptms更容易創(chuàng)造蛋白質(zhì)性 質(zhì)的動態(tài)組合庫，使得生物體能夠快速適應(yīng)各種環(huán)境刺激 1,因此，ptms是蛋白質(zhì)的功能調(diào)控、相互作用和動態(tài)反 應(yīng)的重要分子基礎(chǔ)2。ptms主要包括蛋白質(zhì)的磷酸化、糖 基化、泛素、乙?；图谆?，其中蛋白

3、質(zhì)磷酸化和糖基 化蛋白質(zhì)組學(xué)的研究開展較早，針對這兩種化學(xué)修飾蛋白建 立了多種特異性分離方法3-7 o目前，對蛋白質(zhì)的甲基化修飾研究相對較少。早期研究 發(fā)現(xiàn)，組蛋白賴氨酸與精氨酸殘基的甲基化基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相 關(guān)8。2008年，sprung等9在人肝癌細(xì)胞和啤酒酵母中 檢測到了天冬氨酸和谷氨酸的甲基化修飾；有研究表明，與 正常胰管細(xì)胞相比，在胰腺癌細(xì)胞的a烯醇酶中有更多的 天冬氨酸和谷氨酸發(fā)生甲基化，提示這些修飾可能參與了與 腫瘤相關(guān)的病理生理過程10,以上工作均是在靜電場軌道 離子阱質(zhì)譜(ltqorbitrap)上完成。目前，尚未見到利用 基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(matrixass

4、isted laser desorption ionization tandem timeof flight mass spectrometry, malditof/tof)分析谷氨酸甲基化的報道。 本研究以枯草芽胞桿菌為實驗材料，通過對一級質(zhì)譜離子峰 豐度的比較和二級串聯(lián)質(zhì)譜的分析，闡明利用malditof/tof 質(zhì)譜分析谷氨酸甲基化的特點和優(yōu)勢，提高含甲基化谷氨酸 多肽和蛋白的鑒定置信度，為在組學(xué)水平上研究谷氨酸甲基 化的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。2實驗部分2. 1儀器與試劑4800 maldi tof/toftm analyzer基質(zhì)輔助激光解吸電 離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（malditof/t

5、of ,美國applied biosystems/mdx sciex 公司），儀器控制軟件為 4700 series explorer software ；超純水處理系統(tǒng)（milliq,美國 millipore公司）；蛋白純化系統(tǒng)（akta fplc,美國ge公 司）；320s型ph計（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；胰 蛋白酶（質(zhì)譜分析級，promega公司）；a月青基4務(wù)基肉桂 酸（美國sigma公司，使用前重結(jié)晶）；乙睛和三氟乙酸等 其它試劑均為分析純或優(yōu)級純?？莶菅砍h桿菌從深圳紅樹林海泥中分離。2. 2膠內(nèi)胰酶水解條件切膠：將雙向電泳分離后的目標(biāo)條帶用移液槍槍頭切 下，小心地放入pcr

6、管；脫色：用100 ul高純水振蕩洗滌 10 min,重復(fù) 3 次；100 m l 25 mmol/l nh4iic03 室溫振蕩 平衡 20 min； 100 nl 25 mmol/l nh4hc03/50%乙惰室溫振 蕩 30 min；干燥膠粒：100 » l 25 mmol/l nh4hc03 室溫振 蕩平衡20 min；加100 ul 100%乙睛于膠粒中靜置10 min, 重復(fù)1次；酶解：加入5 pl 20 mg/l質(zhì)譜用測序級胰蛋白 酶，4 °c放置30 min,使酶液完全浸透膠粒，吸掉多余的酶 液；加入 5 pl40 mmol/l nh4hc03/10% ca

7、n 混合液，37 °c 水浴8 ho2. 3質(zhì)譜分析條件基質(zhì)制備：將6 g/l a睛基4務(wù)基肉桂酸和2 g/l檸 檬酸氫二胺溶于10 ml 50%乙月青(含0.1%三氟乙酸)，基質(zhì) 溶液與蛋白酶解液1 ： 1混合后點于不銹鋼靶版，自然干燥 結(jié)晶后待測。采用正離子反射模式，一級質(zhì)譜每張譜圖累加 800次，二級質(zhì)譜累加1200次，碰撞誘導(dǎo)解離條件為：碰 撞能加空氣碰撞1 kv (gas on),源內(nèi)電壓8 kv,碰撞池電 壓7 kv,二級源加速電壓15 kvo2. 4數(shù)據(jù)分析方法數(shù)據(jù)庫搜索條件：串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)信噪比設(shè)為5, 一級和 二級質(zhì)譜質(zhì)量誤差均設(shè)為土0. 3 da, mascot軟件

8、分析，搜 索數(shù)據(jù)庫ncbi 2012年8月發(fā)布，甲硫氨酸氧化和谷氨酸甲 基化作為可變修飾。當(dāng)mascot分?jǐn)?shù)接近或小于可信閾值時, 利用data explorer提供的離子碎片計算器(ion fragmentation calculator ) 和 proteinprospector msproduct program輔助進(jìn)行人工解析。3結(jié)果與討論3. 1枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑bsupi中谷氨酸的甲 基化因為谷氨酸的甲基化屬于不常見的翻譯后修飾，所以最 初搜庫時未被列入可變修飾中。將搜庫文件提交到mascot 引擎檢索后，一個目的蛋白被鑒定為枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶 抑制劑bsupi,同時發(fā)現(xiàn)

9、存在3組分子量相差14 da的m+h + 峰,如圖1所示，它們的質(zhì)荷比分別為1303.80, 1317.81；1365. 77, 1379.82；2313. 34, 2327. 36,加 14 da 的m+h +峰的豐度很低且未被數(shù)據(jù)庫匹配，這提示可能存在蛋白的甲 基化修飾現(xiàn)象。由于甲基化不引起電荷變化，可以認(rèn)為同一組內(nèi)肽段電離效率相近，離子豐度的高低可以反映 其含量的相對大小，所以這也提示對某種特定蛋白質(zhì)而言， 只有極少部分發(fā)生了甲基化修飾。由于甲基化可能發(fā)生在賴 氨酸、精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸、天冬氨酸和谷 氨酸7種氨基酸殘基上9,并且蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性也有 可能造成質(zhì)荷比的巧合，

10、所以需進(jìn)一步確認(rèn)。由于數(shù)據(jù)量較 小并且串聯(lián)質(zhì)譜的譜圖質(zhì)量較高，先進(jìn)行人工解析。圖2a 和圖2b分別為m/z 1365和1379的串聯(lián)質(zhì)譜圖，m/z 1365 的鑒定結(jié)果為肽段felvvydsehko除離子強度外，二者譜圖 輪廓非常相似，說明它們結(jié)構(gòu)相近，的確發(fā)生了該肽段上氨 基酸的甲基化修飾。檢測到了肽段felvvydsehk的全部互補 的b和y系列離子，例如b2, b3離子分別為m/z 277. 12, 390. 19 (理論值277. 12, 390. 20),而在圖3上清楚可見m/z 291和404,對應(yīng)肽段氨基端第二位的谷氨酸(e)上發(fā)生甲 基化，檢測到完整的yl至y9離子、blo (

11、m/z 1233)和 bl0+h20 (m/z 1251)離子也證明該判斷正確。肽段的m+h + 離子在碰撞誘導(dǎo)解離過程中會產(chǎn)生b+h20離子的現(xiàn)象最早報 道于1990年，隨后，she等基于串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜對 該現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步研究，提出對于由n個氨基酸殘基組成 的肽段，如果序列中存在非c端堿性氨基酸（賴氨酸、精氨 酸和組氨酸），則在質(zhì)子化側(cè)鏈和第m個炭基氧之間可能形 成氫鍵，丟失c末端氨基酸和形成新的c末端11,從而形 成bnl+h20離子。因為肽段felvvydsehk含有組氨酸且由11 個氨基酸組成，所以圖2和圖3中檢測到的blo+h20峰可以 用上述機制解釋。值得注意的是，在圖3

12、的低質(zhì)量區(qū)同樣檢 測到了 m/z 277和390離子，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，還存在竣基 端第三位谷氨酸甲基化的y3y7離子（用*表示）。因此，串 聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果表明肽段felvvydsehk的兩個谷氨酸殘基上分別 發(fā)生了甲基化。3. 2枯草芽胞桿菌兩種甲基化蛋白的數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果本實驗的樣品來源是芽砲桿菌蛋白提取液經(jīng)離子交換 和分子篩層析分離篩選出的具有生物活性的蛋白，經(jīng)雙向電 泳上共獲得6個蛋白點，將谷氨酸甲基化修飾添加為可變修 后搜庫檢索，共檢測到兩種蛋白發(fā)生甲基化修飾（表1）。在 枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑bsupi中，肽段qvqavqqfevk 和menqevvlsidaiqepeqik也存在甲基

13、化現(xiàn)象，匹配分?jǐn)?shù)很 高，人工比對結(jié)果與搜庫結(jié)果一致。但數(shù)據(jù)庫檢索只給出了 肽段felvvydsehker的n端第2位谷氨酸發(fā)生甲基化的結(jié)果, 這可能是因為該肽段的離子序列更完整和豐度更高，目前 mascot搜索引擎對于同一肽段的混合修飾較還難給出精確 結(jié)果。此外，在桿菌肽f （bacillopeptida.se f）也觀察到了谷氨酸甲基化修飾現(xiàn)象,與細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑的分析類似，甲基化肽段 atdgvewnvdqidapk 和afsedggtdadileagewvlapk的m+h +峰在一級譜中信號很弱(相對強度譚永聰,王啟軍，趙國屏，姚玉峰.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2011,38 (3)：1

14、97-2033zhou h j, ye ml, dong j, hang h, jingx n,wu r n, zou h f. j.proteome res.，2008,7(9)：3957-39674jia w, luo z,fu y, wang h p,wang l h,chih, yuan z f. mol. cel1. proteomics,2009,8(5)：913-9235jiang jing, han huanhuan, ma cheng, wang ji feng, ying wantao, qian xiaohong. chinese j. anal. chem., 2012

15、,40 (7)：1019-1024江靜，韓歡歡，馬成，王繼峰，應(yīng)萬濤，錢小 紅.分析化學(xué)，2012,40 (7)：1019-10246cheng g, zhang j l, liu y l, sun d h, ni j z.chem. commun. ,2011,47：5732-57347xu y w, wu z x, zhang l j, lu h j, yang p y, webley p a, zhao d y. anal. chem. ,2009,81 ：505-5088strahl bd, alliscd. nature, 2000, 403： 41-459sprung r, che

16、n y, zhang k, cheng d m, zhangt, peng j m, zhao y m. j. proteome res. ,2008,7(3)：1001-1006lozhou w d, capello m, fredolini c, piemonti l, liotta l a, novelli f, petricoin e f j. proteome. res. ,2010,9 (6)：2929-2936llshe y, krokhino, spicer v, loboda a, garland g, ens w, standing k g. j. am. soc mass spectrom.， 2007,18 (6)：1024-103712medzihradszky k f, campbell j m, baldwin m a, falick a m, juhasz p, vestai m l, burlingame a l. anal. chem. ,2000,72：552-55813vestai m l, campbell j m. methods in enzymology, 2005,402：79-10714khatun j, ramkissoon k