抗菌藥物篩選的實驗方法與技術(shù)教案

1、綜合化學實驗綜合化學實驗-化學生物學專題實驗化學生物學專題實驗 指指導教師導教師：馬馬林，蔡小玲林，蔡小玲 化化學與學與化化學學工程工程學學院院抗菌藥物篩選抗菌藥物篩選的實驗方法與的實驗方法與技術(shù)技術(shù) v 一個新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需一個新的化合物或分離提取有效成分是否有抗菌作用，需要藥理實驗來證實，首先采用體外實驗方法，觀察試驗物要藥理實驗來證實，首先采用體外實驗方法，觀察試驗物對細菌有無殺滅作用或抑制作用，體外實驗的重要性在于對細菌有無殺滅作用或抑制作用，體外實驗的重要性在于方法簡便，用藥量少，短時間內(nèi)能判斷藥物抗菌的廣度和方法簡便，用藥量少，短時間內(nèi)能判斷藥物抗菌的

2、廣度和強度，為深入體外實驗和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。強度，為深入體外實驗和體內(nèi)藥效研究提供數(shù)據(jù)。v 體外實驗是篩選抗菌藥物或測試新藥抗菌性能的重要環(huán)節(jié)。體外實驗是篩選抗菌藥物或測試新藥抗菌性能的重要環(huán)節(jié)。藥物對細菌代謝的影響、可以使細胞呼吸量減低，或酶系藥物對細菌代謝的影響、可以使細胞呼吸量減低，或酶系統(tǒng)受到抑制等，因而出現(xiàn)細菌不生長或部分抑制，可借以統(tǒng)受到抑制等，因而出現(xiàn)細菌不生長或部分抑制，可借以判斷藥物對細菌有無抗菌作用，或抗菌范圍。體外實驗是判斷藥物對細菌有無抗菌作用，或抗菌范圍。體外實驗是細菌與藥物直接接觸，沒有機體諸因素參與，故體外和體細菌與藥物直接接觸，沒有機體諸因素參與，故體外和

3、體內(nèi)實驗的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜合分析進行評內(nèi)實驗的結(jié)果不一定完全一致，需兩方面綜合分析進行評價。價。一、實驗目的一、實驗目的1，掌握培養(yǎng)基的制備、，掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌、菌種培高壓蒸氣滅菌、菌種培養(yǎng)、接種等微生物培養(yǎng)養(yǎng)、接種等微生物培養(yǎng)技術(shù)；技術(shù)；2，掌握化合物抗菌、抑，掌握化合物抗菌、抑菌活性篩選技術(shù)；菌活性篩選技術(shù)；3，掌握微孔板法、抑菌，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小濃度測試圈法抗菌最小濃度測試等基本操作技術(shù)。等基本操作技術(shù)。4，學會使用各種儀器設，學會使用各種儀器設備備 。實驗中使用的儀器設備：實驗中使用的儀器設備：1，手提式高壓蒸汽滅菌鍋；，手提式高壓蒸汽滅菌鍋；

4、2，超凈工作臺；，超凈工作臺；3，各種移液器；，各種移液器；4，細菌恒溫培養(yǎng)箱；，細菌恒溫培養(yǎng)箱；5，微生物培養(yǎng)搖床；，微生物培養(yǎng)搖床；6，酶標儀；，酶標儀；二、微生物培養(yǎng)基的配制、滅菌與培養(yǎng)二、微生物培養(yǎng)基的配制、滅菌與培養(yǎng)培養(yǎng)基是指利用人工方法將適培養(yǎng)基是指利用人工方法將適合微生物生長繁殖成積累代謝合微生物生長繁殖成積累代謝產(chǎn)物的各種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制產(chǎn)物的各種營養(yǎng)物質(zhì)混合配制而成的營養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微而成的營養(yǎng)基質(zhì)。主要用于微生物的分離、培養(yǎng)、鑒定以及生物的分離、培養(yǎng)、鑒定以及菌種保藏等方面。菌種保藏等方面。培養(yǎng)基一般應含有微生物生長培養(yǎng)基一般應含有微生物生長繁殖所需要的碳源、氮源、能繁殖

5、所需要的碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水等源、無機鹽、生長因子和水等營養(yǎng)成分。營養(yǎng)成分。此外，為了滿有微生物生長繁此外，為了滿有微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的要求，還殖或積累代謝產(chǎn)物的要求，還必須控制培養(yǎng)基的必須控制培養(yǎng)基的phph。培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培培養(yǎng)基可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和分為固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基是指在液體培養(yǎng)基中加固體培養(yǎng)基是指在液體培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑入一定量的凝固劑( (常加常加1.5%-

6、2%1.5%-2%的的瓊脂瓊脂) )經(jīng)融化冷凝而成。經(jīng)融化冷凝而成。半固體培養(yǎng)這是指在液體培養(yǎng)基中半固體培養(yǎng)這是指在液體培養(yǎng)基中加入加入0.80.8-1-1左右的瓊脂，經(jīng)融左右的瓊脂，經(jīng)融化冷凝而成?；淠?。液體培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中不加凝固液體培養(yǎng)基是指培養(yǎng)基中不加凝固劑瓊脂，培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)。劑瓊脂，培養(yǎng)基呈液體狀態(tài)。 （一）基本原理（一）基本原理v正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學實驗正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學實驗工作的重要基礎。由于微生物種類及代謝類型的工作的重要基礎。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的種類也很多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物培養(yǎng)基的

7、種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。多，它們的配方及配制方法雖各有差異。v但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同，例如器皿的準備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培的準備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等基本養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及接菌等基本環(huán)節(jié)大致相同。環(huán)節(jié)大致相同。 （二）實驗過程（二）實驗過程1 1，液體及固體培養(yǎng)基的配制過，液體及固體培養(yǎng)基的配制過程程 一般培養(yǎng)基的組成一般培養(yǎng)基的組成 牛肉膏牛肉膏 0.5g0.5g蛋白胨蛋白胨 1g1g naclnacl 0.5g 0.5g 瓊脂瓊脂 1.5-

8、2g1.5-2g水水 100ml100mlph 7.2 ph 7.2 液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。液體培養(yǎng)基不加瓊脂即可。(1)(1)稱量及溶化稱量及溶化 分別稱取蛋白胨、分別稱取蛋白胨、naclnacl、牛肉膏置于另一小燒杯中，進、牛肉膏置于另一小燒杯中，進行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒行稱量。然后加入少量蒸餾水于小燒杯中，加熱融化。杯中，加熱融化。(2)(2)調(diào)調(diào)ph ph 待溶液冷至室溫時，用待溶液冷至室溫時，用0.1mol/l 0.1mol/l naohnaoh溶液調(diào)溶液調(diào)phph至至7.27.2。(3)(3)定容定容 將溶液倒入量筒中，補充將溶液倒入量筒中，補充水量至所需體積。水量至所

9、需體積。(4)(4)固體培養(yǎng)基加入所需量的瓊脂，固體培養(yǎng)基加入所需量的瓊脂，加熱融化，補充失水。加熱融化，補充失水。(5)(5)分裝、加塞、包扎。分裝、加塞、包扎。(6)(6)高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌100 pa100 pa滅菌滅菌20 min20 min2 2，培養(yǎng)基的分裝，培養(yǎng)基的分裝液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng)液體培養(yǎng)基裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為而定，若所用試管大小為1515150 mm150 mm時，液體培養(yǎng)時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度基可分裝至試管高度1/41/4左右為宜（約左右為宜（約5ml5ml）；）；分裝團體培養(yǎng)基時，在瓊分裝團體

10、培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應趁熱分脂完全融化后，應趁熱分裝于試管中分裝量為管高裝于試管中分裝量為管高1/5(1/5(約約4-5ml)4-5ml)。3 3，棉塞的制作及試管、錐形瓶，棉塞的制作及試管、錐形瓶的包扎的包扎 （1 1）試管棉塞的制作）試管棉塞的制作 制棉塞時，應選用大小、制棉塞時，應選用大小、厚薄適中的普通棉花一快，鋪厚薄適中的普通棉花一快，鋪展于左手拇指和食指如成的圓展于左手拇指和食指如成的圓孔上，用右手食指將棉花從中孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團孔中制成棉塞，然后央壓入團孔中制成棉塞，然后直接壓入試管或錐形瓶口。直接壓入試管或錐形瓶口。 將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或蓋將裝好培養(yǎng)

11、基并塞好棉塞或蓋好管帽的試管捆成好管帽的試管捆成捆，外面捆，外面包上一層牛皮紙。用鉛筆注明包上一層牛皮紙。用鉛筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌培養(yǎng)基名稱及配制日期。滅菌待用。待用。4 4，培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基的滅菌 高壓蒸汽滅菌是微生物學實驗、發(fā)酵工業(yè)高壓蒸汽滅菌是微生物學實驗、發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的生產(chǎn)、以及外科手術(shù)器械等方面最常用的一種滅菌方法。一種滅菌方法。 （1 1）打開滅菌鍋蓋，加適量水；）打開滅菌鍋蓋，加適量水；（2 2）將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。（）將待滅菌物品放入滅菌桶內(nèi)。（3 3）將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，加蓋，將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi)，加蓋，上下

12、螺栓口對齊，均勻旋緊螺栓，使鍋密上下螺栓口對齊，均勻旋緊螺栓，使鍋密閉。閉。（4 4）打開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn)）打開放汽閥，加熱，自鍋內(nèi)開始產(chǎn)生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸上升生蒸汽后再關(guān)緊放汽閥，待壓力逐漸上升至所需溫度時，控制熱源，維持所需壓力至所需溫度時，控制熱源，維持所需壓力和溫度，并開始計時和溫度，并開始計時20 min20 min后停止加熱。后停止加熱。（5 5）待壓力降至接近）待壓力降至接近0 0時，慢慢打開放汽時，慢慢打開放汽閥閥( (排汽口排汽口) )，開蓋，立即取出滅菌物品。，開蓋，立即取出滅菌物品。5 5，斜面和平板的制作，斜面和平板的制作 將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基

13、將巳滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒上的試管，趁熱置于木棒上，使成適當斜度，凝固后，使成適當斜度，凝固后即成斜面即成斜面( (圖圖1-3)1-3)斜面長斜面長度不超過試管長度度不超過試管長度1/21/2為為宜。宜。平板的制作平板的制作 6 6，斜面培養(yǎng)基接種，斜面培養(yǎng)基接種 斜面培養(yǎng)基接種法斜面培養(yǎng)基接種法一般不用作分離培一般不用作分離培養(yǎng)，僅使細菌繁殖養(yǎng)，僅使細菌繁殖為菌種傳代或觀察為菌種傳代或觀察其某些生化特性之其某些生化特性之用。用。 (1)(1)接種滅菌接種滅菌 (2)(2)開開啟棉塞啟棉塞 (3)(3)管口滅管口滅菌菌 (4)(4)挑起菌苔挑起菌苔 (5)(5)接種接種 (6)

14、(6)塞好棉塞好棉塞。塞。7 7，液液體體培培養(yǎng)養(yǎng)基基接接種種法法三、微量稀釋法體外抗菌實驗三、微量稀釋法體外抗菌實驗v連續(xù)稀釋法（試管稀釋法）通常用于測定微生物連續(xù)稀釋法（試管稀釋法）通常用于測定微生物的最小抑菌濃度（的最小抑菌濃度（micmic），即將微生物的濃度按），即將微生物的濃度按幾何級數(shù)或數(shù)學級數(shù)進行遞減稀釋，然后將不同幾何級數(shù)或數(shù)學級數(shù)進行遞減稀釋，然后將不同濃度的微生物混入含試驗菌的液體培養(yǎng)基或固體濃度的微生物混入含試驗菌的液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗菌生長的最低培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)后，能抑制試驗菌生長的最低濃度，即為該微生物的最小抑菌濃度。濃度，即為該微生物的最

15、小抑菌濃度。v微量稀釋法微量稀釋法 此種方法常用于測定細菌對藥物敏此種方法常用于測定細菌對藥物敏感性或新藥對細菌的抗菌活性試驗。一般應用感性或新藥對細菌的抗菌活性試驗。一般應用9696孔微量稀釋板，孔底呈孔微量稀釋板，孔底呈u u型，每孔容量為型，每孔容量為0.20-0.20-0.30ml0.30ml。本法操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大。本法操作較便，用培養(yǎng)基量少，可作大批量藥敏試驗。批量藥敏試驗。( (一）實驗過程一）實驗過程（1 1）實驗菌的準備。）實驗菌的準備。選取大腸桿菌選取大腸桿菌(escherichia c o l i ) 、 金 黃 色 葡 萄 球 菌、 金 黃 色 葡 萄 球

16、菌( (staphylicoccus aureus) )、白、白色葡萄球菌色葡萄球菌( (staphylococcus albus) )、蠟狀芽孢桿菌菌種、蠟狀芽孢桿菌菌種在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳在營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)一次后，再將其接種代培養(yǎng)一次后，再將其接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中3737培培養(yǎng)養(yǎng)6-12 h6-12 h，冰箱備用。，冰箱備用。（2 2）抗菌化合物的初步篩）抗菌化合物的初步篩選，按下表取選，按下表取9696孔培養(yǎng)板孔培養(yǎng)板一塊，進行編號，將一塊，進行編號，將4444種種化合物（由有機化學研究化合物（由有機化學研究所其他教師和研究生提供）所其他教師和研究生提

17、供）用用dmsodmso或蒸餾水配制成或蒸餾水配制成5050 mol/mlmol/ml，（也可用無菌，（也可用無菌過濾器過濾后）放置在滅過濾器過濾后）放置在滅菌的小離心管中。菌的小離心管中。篩選實驗過程篩選實驗過程（3 3）在超凈工作臺內(nèi)，酒精燈下）在超凈工作臺內(nèi)，酒精燈下，將液體培養(yǎng)的細菌菌種用培養(yǎng)液，將液體培養(yǎng)的細菌菌種用培養(yǎng)液進行稀釋，稀釋度為進行稀釋，稀釋度為1 1：10001000或或1:5001:500。用無菌的移液器（吸咀經(jīng)。用無菌的移液器（吸咀經(jīng)過滅菌處理）將稀釋的液體菌種過滅菌處理）將稀釋的液體菌種198198 l l加入到除了加入到除了a1,b1a1,b1以外的孔內(nèi)以外的孔

18、內(nèi)，2 2 l l各種化合物溶液（各種化合物溶液（dmsodmso配置配置），），a1,b1,c1,d1a1,b1,c1,d1加加200 200 l l培養(yǎng)液培養(yǎng)液，震蕩混合后，震蕩混合后3737培養(yǎng)培養(yǎng)12h-18h, 12h-18h, 用酶標儀用酶標儀630nm630nm側(cè)吸光度。側(cè)吸光度。dmsodmso的的最終濃度保持在最終濃度保持在1%1%。每個樣品設兩。每個樣品設兩個平行孔。個平行孔。96孔細胞培養(yǎng)板加樣安排孔細胞培養(yǎng)板加樣安排1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212a a培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品1 12 23 34 45 56

19、 67 78 89 910101111b b培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111c c培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品12121313141415151616171718181919202021212222d d培養(yǎng)液培養(yǎng)液200200 l l樣品樣品12121313141415151616171718181919202021212222e e菌對照菌對照(2(2 l dmso)l dmso)樣品樣品23232424252526262727282829293030313132323333f f菌對照菌對照(2(2

20、 l dmso)l dmso)樣品樣品23232424252526262727282829293030313132323333g g菌對照菌對照(2(2 l dmso)l dmso)樣品樣品34343535363637373838393940404141424243434444h h菌對照菌對照(2(2 l dmso)l dmso)樣品樣品34343535363637373838393940404141424243434444樣品濃度樣品濃度0.02mmol/ml 0.02mmol/ml 樣品分子量樣品分子量/100.mg /100.mg 用用dmsodmso配成配成0.5ml0.5ml即可，

21、每即可，每次實驗用次實驗用2 2 l l，9696孔板的孔體積孔板的孔體積200200 l l，樣品的最終濃度為，樣品的最終濃度為200200 mol/lmol/l，大，大于該濃度則無價值。于該濃度則無價值。試驗用樣品試驗用樣品1.1.環(huán)丙沙星環(huán)丙沙星 2.2.2 2 ,4,4 ,3-,3-三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 3.3.2,4,42,4,4 - -三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 4.4.2,4,22,4,2 - -三羥基二苯甲酮三羥基二苯甲酮 5.5.2,3,4,22,3,4,2 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 6.6.2,3,4,32,3,4,3 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮

22、 7.7.2,3,4,42,3,4,4 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 8.8.2,4,22,4,2 ,4,4 - -四羥基二苯甲酮四羥基二苯甲酮 9.9.2,3,4,22,3,4,2 ,4,4 - -五羥基二苯甲酮五羥基二苯甲酮 10.10.丹皮酚丹皮酚 11.11.丹皮酚丹皮酚- -鎳（鎳（iiii）配合物）配合物 12.12.丹皮酚丹皮酚- -氧釩（氧釩（v v）配合物）配合物 13.13.丹皮酚丹皮酚- -銅（銅（iiii）配合物）配合物 14.14.丹皮酚丹皮酚- -鈷（鈷（iiii）配合物）配合物 15.15.丹皮酚丹皮酚- -錳（錳（iiii）配合物）配合物 16.16.丹皮

23、酚丹皮酚- -鋅（鋅（iiii）配合物）配合物 17.17.苯甲基苯甲基-n-n-苯基亞胺苯基亞胺 18.18.3-3-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-n-苯基亞胺苯基亞胺 19.19.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 20.20.2-2-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-3,5-n-3,5-二苯基亞胺二苯基亞胺 21.21.3,4-3,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-n-苯基亞胺苯基亞胺 22.22.4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-3,4-n-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 23. 4-23. 4-羥基羥基-3-3-甲氧基甲氧基-n-2,

24、4-n-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺24. 24. 苯甲基苯甲基-n-4-n-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 25.25. 3,4-3,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺26.26. 4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-4-n-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺27.27. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-3,4-n-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺28.28. 2,5-2,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-4-n-4-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺 29.29. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-4-n-4-羥

25、基苯基亞胺羥基苯基亞胺 30.30. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺31.31. 4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-3-n-3-羥基苯基亞胺羥基苯基亞胺32.32. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 33.33. 4-4-羥基羥基-3-3-甲氧基甲氧基-n-3,4-n-3,4-二甲氧基苯基亞胺二甲氧基苯基亞胺 34.34. 4-4-羥基苯甲基羥基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 35.35. 4-4-羥基羥基-3-3-甲氧基苯甲基甲氧基苯甲基-n

26、-4-n-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 36.36. 3,5-3,5-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 37.37. 2,4-2,4-二羥基苯甲基二羥基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亞胺甲基苯基亞胺 38.38. 4-4-磺酸基磺酸基-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯39.39. 4-4-磺酸基磺酸基-2-2 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯40.40. 4-4-硝基硝基-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯41.41. 4-4-硝基硝基-2-2 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯42.42. 4-4-硝基硝基-2-

27、2 ,5,5 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯43.43. 4-4-溴溴-3-3 ,4,4 - -二羥基偶氮苯二羥基偶氮苯 44.44. 對羥基苯甲酸甲酯對羥基苯甲酸甲酯 篩選數(shù)據(jù)分析篩選數(shù)據(jù)分析 測試的樣品中，測試的樣品中，1 1號樣為號樣為市場上臨床使用的環(huán)丙沙市場上臨床使用的環(huán)丙沙星，濃度為星，濃度為0.005mmol/l0.005mmol/l。 其 他 樣 品 濃 度 為。 其 他 樣 品 濃 度 為0.02mmol/l0.02mmol/l。 實驗中，以培養(yǎng)基為空實驗中，以培養(yǎng)基為空白白0%0%，以帶菌培養(yǎng)液為對，以帶菌培養(yǎng)液為對照照100%100%。如果酶標儀如果酶標儀630nm630

28、nm測試的結(jié)果中，測試的結(jié)果中，空白為空白為-0.2-0.2，空內(nèi)液體呈透明清，空內(nèi)液體呈透明清澈，對照孔的值為澈，對照孔的值為+0.1-0+0.1-0.2 2。如果測試樣品的值也同樣達到如果測試樣品的值也同樣達到- -0.20.2，表明樣品在，表明樣品在200200 mol/lmol/l具有具有較好的抗菌活性。較好的抗菌活性。如果測試樣品的值在對照孔和空如果測試樣品的值在對照孔和空白之間，表明樣品在高濃度有抗白之間，表明樣品在高濃度有抗菌作用，請選取菌作用，請選取1111個抗菌效果較個抗菌效果較好的樣品做下面的最小抑菌濃度好的樣品做下面的最小抑菌濃度實驗。實驗。篩選數(shù)據(jù)分析篩選數(shù)據(jù)分析 測試

29、的樣品中，測試的樣品中，1 1號樣為號樣為市場上臨床使用的環(huán)丙沙市場上臨床使用的環(huán)丙沙星，濃度為星，濃度為0.005mmol/l0.005mmol/l。 其 他 樣 品 濃 度 為。 其 他 樣 品 濃 度 為0.02mmol/l0.02mmol/l。 實驗中，以培養(yǎng)基為空實驗中，以培養(yǎng)基為空白白0%0%，以帶菌培養(yǎng)液為對，以帶菌培養(yǎng)液為對照照100%100%。如果酶標儀如果酶標儀630nm630nm測試的結(jié)果中，測試的結(jié)果中，空白為空白為-0.2-0.2，空內(nèi)液體呈透明清，空內(nèi)液體呈透明清澈，對照孔的值為澈，對照孔的值為+0.1-0+0.1-0.2 2。如果測試樣品的值也同樣達到如果測試樣品

30、的值也同樣達到- -0.20.2，表明樣品在，表明樣品在200200 mol/lmol/l具有具有較好的抗菌活性。較好的抗菌活性。如果測試樣品的值在對照孔和空如果測試樣品的值在對照孔和空白之間，表明樣品在高濃度有抗白之間，表明樣品在高濃度有抗菌作用，請選取菌作用，請選取1111個抗菌效果較個抗菌效果較好的樣品做下面的最小抑菌濃度好的樣品做下面的最小抑菌濃度實驗。實驗。（4 4）最小抑菌濃度或）最小抑菌濃度或ec50ec50的測試的測試 v操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用操作步驟與試管稀釋法相似，一般常用mhmh培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，根據(jù)上面篩選試驗選取出來的樣品，在微孔板孔根據(jù)上面篩選試驗選取出來

31、的樣品，在微孔板孔內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋，內(nèi)用微量移液器直接在微孔板孔內(nèi)作二倍稀釋，然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對照，然后接種稀釋菌液，其中留一列孔作為藥液對照，另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對照，試驗完畢另一孔僅加培養(yǎng)基和菌液作為菌對照，試驗完畢后，用微量攪拌器震蕩混勻后，置后，用微量攪拌器震蕩混勻后，置3737溫孵溫孵12-12-18h18h，用酶標儀，用酶標儀630nm630nm側(cè)吸光度。側(cè)吸光度。樣品稀釋后的濃度表樣品稀釋后的濃度表a 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，200 m234567891011b 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，100 mc 培養(yǎng)液

32、培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，50 md 培養(yǎng)液培養(yǎng)液200 l樣品樣品1，25 me 菌對照菌對照(2 l dmso)樣品樣品1，12.5 mf 菌對照菌對照(2 l dmso)樣品樣品1，6.25 mg 菌對照菌對照(2 l dmso)樣品樣品1，3.13 mh 菌對照菌對照(2 l dmso)樣品樣品1，1.56 m（二）數(shù)據(jù)處理與分析（二）數(shù)據(jù)處理與分析抗菌藥物的最小抗菌濃度測抗菌藥物的最小抗菌濃度測試結(jié)果可能出現(xiàn)兩種形式：試結(jié)果可能出現(xiàn)兩種形式：1 1，在某一個稀釋的樣品濃，在某一個稀釋的樣品濃度，結(jié)果表現(xiàn)出細菌沒有生度，結(jié)果表現(xiàn)出細菌沒有生長，菌液較清（可與空白培長，菌液較清（可與空

33、白培養(yǎng)基比），而下一個稀釋的養(yǎng)基比），而下一個稀釋的樣品濃度，菌液中細菌生長樣品濃度，菌液中細菌生長比較旺盛（可與含菌對照比比較旺盛（可與含菌對照比），那么，這個稀釋的樣品），那么，這個稀釋的樣品濃度就為該樣品抗菌的最小濃度就為該樣品抗菌的最小濃度。這種化合物的抗菌作濃度。這種化合物的抗菌作用可以稱為殺菌作用。用可以稱為殺菌作用。如右表中紅色值中的樣品濃如右表中紅色值中的樣品濃度就是最小抗菌濃度。度就是最小抗菌濃度。培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2013-0.2013樣品樣品1 1值值-0.2094-0.2094樣品樣品2 2值值-0.2066-0.2066培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2027-0.2027

34、樣品樣品1 1值值-0.2102-0.2102樣品樣品2 2值值-0.2103-0.2103培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2005-0.2005樣品樣品1 1值值-0.2068-0.2068樣品樣品2 2值值-0.2112-0.2112培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2106-0.2106樣品樣品1 1值值-0.2054-0.2054樣品樣品2 2值值-0.2022-0.2022菌對照值菌對照值 0.21820.2182樣品樣品1 1值值-0.2028-0.2028樣品樣品2 2值值 0.20870.2087菌對照值菌對照值 0.20680.2068樣品樣品1 1值值-0.2008-0.2008樣品樣品2 2值

35、值 0.21120.2112菌對照值菌對照值 0.21460.2146樣品樣品1 1值值 0.20230.2023樣品樣品2 2值值 0.20880.2088菌對照值菌對照值 0.20330.2033樣品樣品1 1值值 0.20360.2036樣品樣品2 2值值 0.20330.20332 2，實驗中，不同稀釋的樣，實驗中，不同稀釋的樣品濃度的測試結(jié)果沒有上面品濃度的測試結(jié)果沒有上面的現(xiàn)象，而是出現(xiàn)規(guī)律性的的現(xiàn)象，而是出現(xiàn)規(guī)律性的上升。即，這種樣品測出的上升。即，這種樣品測出的數(shù)據(jù)是隨著樣品濃度的下降數(shù)據(jù)是隨著樣品濃度的下降而上升，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)畫而上升，可以根據(jù)其數(shù)據(jù)畫出一條細菌的生長曲線，

36、如出一條細菌的生長曲線，如果對照樣的值定為果對照樣的值定為100%100%，可，可以從曲線上求出抑制以從曲線上求出抑制50%50%時時樣品的濃度，所以，我們稱樣品的濃度，所以，我們稱這種這種 抗菌為抑菌作用，表抗菌為抑菌作用，表明該化合物不能殺死細菌，明該化合物不能殺死細菌，但可以抑制其生長。但可以抑制其生長。培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2013-0.2013樣品樣品1 1值值-0.2194-0.2194樣品樣品2 2值值-0.2166-0.2166培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2027-0.2027樣品樣品1 1值值-0.2082-0.2082樣品樣品2 2值值-0.1893-0.1893培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值

37、-0.2005-0.2005樣品樣品1 1值值-0.1694-0.1694樣品樣品2 2值值-0.1002-0.1002培養(yǎng)液值培養(yǎng)液值-0.2106-0.2106樣品樣品1 1值值-0.1268-0.1268樣品樣品2 2值值 0.00220.0022菌對照值菌對照值 0.21820.2182樣品樣品1 1值值-0.0428-0.0428樣品樣品2 2值值 0.05870.0587菌對照值菌對照值 0.20680.2068樣品樣品1 1值值-0.0023-0.0023樣品樣品2 2值值 0.16120.1612菌對照值菌對照值 0.21460.2146樣品樣品1 1值值 0.68040.68

38、04樣品樣品2 2值值 0.20880.2088菌對照值菌對照值 0.20330.2033樣品樣品1 1值值 0.13890.1389樣品樣品2 2值值 0.21330.2133四、瓊脂擴散法四、瓊脂擴散法v 此種方法包括紙片法，杯碟法挖洞法等，它們的共同此種方法包括紙片法，杯碟法挖洞法等，它們的共同點均在平皿瓊脂內(nèi)加入適量測試細菌，按上述方法放置點均在平皿瓊脂內(nèi)加入適量測試細菌，按上述方法放置適量藥液在菌層上，藥物在瓊脂四周擴散，經(jīng)孵育后，適量藥液在菌層上，藥物在瓊脂四周擴散，經(jīng)孵育后，細菌生長受抑制，出現(xiàn)抑菌圈，測定抑菌圈直徑，能了細菌生長受抑制，出現(xiàn)抑菌圈，測定抑菌圈直徑，能了解細菌對藥

39、物的敏感程度。解細菌對藥物的敏感程度。 v 瓊脂擴散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一瓊脂擴散法可定性或初步判斷該化合物的抗菌能力，一般是將化合物稀釋后，加如含試驗菌的混菌平板中，由般是將化合物稀釋后，加如含試驗菌的混菌平板中，由于化合物在瓊脂培養(yǎng)基中的擴散作用，使化合物周圍的于化合物在瓊脂培養(yǎng)基中的擴散作用，使化合物周圍的試驗菌不能生長，從而產(chǎn)生抑菌圈或抑菌帶。根據(jù)抑菌試驗菌不能生長，從而產(chǎn)生抑菌圈或抑菌帶。根據(jù)抑菌圈或抑菌帶的大小來評價化合物抗菌作用的強弱。圈或抑菌帶的大小來評價化合物抗菌作用的強弱。圖圖: :標準曲線法標準曲線法 圖圖 ：鏈霉素標準曲線：鏈霉素標準曲線 雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖雙碟、鋼管與抑菌圈位置圖s s：標準品：標準品t t：供