檢測細胞中1―磷酸鞘氨醇含量LC―MS-MS研究方法建立

1、檢測細胞中1 一磷酸鞘氨醇含量lc-ms/ms研究方法建立摘要目的建立并確證可以檢測1-磷酸鞘氨醇(s1p)快速、靈敏、特異的lc-ms/ms定量分析方法。方 法采用c17-s1p作為內(nèi)參，甲醇一步法進行蛋白沉淀，隨 后進行正相電噴霧離子化lc-ms/ms分析。流動相為甲醇 -0.1%甲酸水(95 ： 5, v/v),流速0. 2ml/min,每個樣品的 分析時間為4 min。細胞經(jīng)tnf- a處理后s1p含量顯著增加; 而經(jīng)dms處理后s1p含量顯著下降。結(jié)果s1p的標準曲線 線性范圍為0. 110ng/ml。相關(guān)系數(shù)r2均大于0.989。結(jié) 論 該方法可以快速，靈敏，特異性地同時檢測生物樣

2、品中 s1p的含量。關(guān)鍵詞含量測定；1-磷酸鞘氨醇；液質(zhì)聯(lián)用中圖分類號r743. 3 文獻標識碼a 文章編號 2095-0616 (2013) 09-09-03鞘磷脂不僅是細胞膜的主要成分，也可作為信號分子調(diào) 控多種細胞進程，包括細胞增殖，分化，存活，死亡以及一 些細胞的炎癥反應(yīng)1-2 o幾種磷脂類代謝物，特別是鞘氨 醇(sph)和1-磷酸鞘氨醇(s1p)被認為是具有顯著生物活 性的關(guān)鍵分子，控制著細胞生存和死亡。s1p可以被s1p磷 酸酶去磷酸化為spho sph作為負性調(diào)節(jié)因子，抑制細胞增 殖和促進凋亡。相反，s1p作為sph的磷酸化產(chǎn)物，參與了 促進細胞增殖和抑制凋亡過程3。目前已有一些

3、方法用于 測定生物樣品中低豐度的s1p含量。這些方法包括放射性同 位素摻入酶促反應(yīng)實驗4,放射性受體結(jié)合實驗5, hplc 柱前衍生化6-7,質(zhì)譜8-9以及l(fā)c-ms/ms等。在本研究中，我們建立了一種快速，簡便，靈敏的lc-ms/ms分析方法。本方法成功地測定了 hek293細胞中 s1p的含量。1儀器與試藥finnigan tsq quantum 三重四極桿質(zhì)譜儀(thermo electron, san jose, ca, usa),色譜分析柱為 luna-rpc18 色譜柱 (150 mm lx2 mm i. d. , 5 y m particle size and 100 ? por

4、e size)；外加 c18 保護預柱(4. 0 mm l x2. 0 mm i. d. ) (phenomenex, torrance, ca, usa)o derythro-1- 磷酸鞘氨醇(sip), c17-d-erythro-l-磷酸鞘氨醇(c17-s1p) 購自 avanti polar lipids (美國)。sip 和 c17-s1p 的貯存 液dms0/濃鹽酸(100 : 2, v/v)配制，濃度均為100 u g/mlo 用甲醇配制并于-2(rc保存。實驗時貯存液用甲醇進一步稀 釋成工作液。hplc級甲醇和甲酸購自tedia公司(美國)。 其他所有有機溶劑和化學品均為分析純

5、級。tnf-a購自 biosource(美國)；二甲基鞘氨醇(dms)購自 biomol research laboratories公司(美國)；超純水由milli-q plus水純化 設(shè)備提供(美國)。2方法和結(jié)果2. 1色譜條件溶劑及樣品經(jīng)finnigan自動進樣器和質(zhì)譜泵進行分離。 柱溫為25°co流動相為甲醇-水(95 : 5, v/v)(水中含0. 1% 甲酸)；流速為0. 2 ml/mino每個樣品的分析時間為4 min。 流動相調(diào)控色譜行為和恰當?shù)碾x子化。為了摸索最優(yōu)流動相 條件，我們研究了不同比例的甲醇，乙睛和水對實驗的影響。 乙睛能夠降低樣品的分析時間，每個樣品可以

6、在2 min內(nèi)分 析完畢，但峰型比較寬，有一定的脫尾。而增加液相中甲醇 的比例可以改善靈敏度和峰型，盡管分析時間長了一些。此 外，加入少量甲酸可以提高靈敏度和改善峰型。最終，本實 驗摸索的最優(yōu)流動相組成為：95%甲醇和5%甲酸水(甲酸水 中含有0. 1%的甲酸)。在該流動相條件下，每個樣品在4min 內(nèi)分析完成。2.2質(zhì)譜條件2. 3細胞培養(yǎng)人胚胎腎細胞293 (hek293)培養(yǎng)在含10% (v/v)胎牛 血清，2 mm谷氨酰胺，0.2% (w/v)碳酸氫鈉，100 u/ml青 霉素和100 ug/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中。細胞于37°c, 5% c02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長至匯

7、合狀時，采用0.25%胰酶 進行消化傳代。2. 4樣品收集和制備2. 5制備標準品2. 6方法學考察3討論s1p作為磷脂類小分子化合物，其在生物體內(nèi)的含量較 低。最早人們采用放射自顯影技術(shù)進行s1p含量測定。該實 驗采用放射性標記的底物v-32p1atp進行體外酶促反應(yīng)， 隨后采用有機溶劑抽提和tlc分離，再用放射自顯影方法捕 捉產(chǎn)物信號，最后采用液閃儀或磷屛掃描進行定量分析4。 另一種分析方法涉及到放射性受體競爭性結(jié)合實驗，該實驗 通過3hs1p與未標記的s1p競爭性與s1p1受體結(jié)合5。 以上這些方法不僅費力耗時，而且難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的化合 物，例如s1p和dhsipo因此，隨后人們使用h

8、plc作為一種 替代方法來定量分析s1p以及相關(guān)化合物。使用hplc時， sph直接轉(zhuǎn)換成其熒光衍生物，而s1p則被堿性磷酸酶去磷 酸化轉(zhuǎn)變成sph,再進行柱前衍生化。隨后，熒光衍生物經(jīng) hplc分離后被熒光分光光度計檢測5-6, 12-17。盡管hplc 方法避免使用到放射性試劑，但由于其樣品提取步驟繁瑣， 且需要柱前衍生化，不適合大樣本分析。質(zhì)譜技術(shù)是一類分析鞘磷脂代謝產(chǎn)物非常靈敏的分析 方法，特別適合生物樣本中低豐度s1p的定量分析18。質(zhì) 譜技術(shù)的成功應(yīng)用依賴于目標物質(zhì)能否氣化，并且他們產(chǎn)生 的離子可以被特異性地檢測出來。由于鞘磷脂類分子較容易 離子化，而且所產(chǎn)生的碎片離子因其有特異的

9、官能團和骨架 結(jié)構(gòu)而較容易鑒定區(qū)分19,因此磷脂類分子特別適合質(zhì)譜 分析。近來有通過將樣品提取液直接注入質(zhì)譜儀中進行分析 的方法，該類方法較之hplc更為簡便和靈敏8。不過，由 于缺少色譜分離環(huán)節(jié)，該種方法需要多步提取來盡可能降低 諸如等離子干擾以及基質(zhì)效應(yīng)的影響，這些因素反過來又使 得這種方法存在費力耗時的缺點，限制其廣泛使用。lc-ms/ms技術(shù)是hplc和ms技術(shù)的完美結(jié)合，具有更高的靈 敏度，選擇性，特異性以及高通量等特點，特別適合大樣本 分析。本實驗建立并驗證了一種運用lc-ms/ms技術(shù)測量s1p含量的定量分析方法。該方法采用甲醇一步沉淀法 提取，無需樣品氣化，采用非放射性標記的內(nèi)

10、標(c17-s1p) 來檢測生物樣品中s1p的含量。流動相組分為甲醇和0.1% 甲酸水(95 : 5, v/v)o每個樣品的分析時間控制在4 min 內(nèi)，可以滿足大樣本分析的要求。本方法將在研究s1p的生 物學效應(yīng)以及相應(yīng)靶標藥物的篩選方面得到廣泛應(yīng)用。參考文獻 huwiler a, zangemeis ter-w it tke u. targe ting the conversion of ceramide to sphingosine 1-phosphate as a novel strategy for cancer therapyjcrit rev oncol hematol, 200

11、7, 63 (2)： 150-159.2 張麗志，蘇健，溫克1-磷酸鞘氨醇對過氧化氫所致微血管通透性增高的影響j中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2013, 30 (1)： 6-9.3 wymann mp, schneiter r. lipid signalling in diseasej nat rev mol cell biol, 2008, 9 (2)： 162-176.4 edsall lc, spiegel s enzymatic measurement of sphingosine 1-phosphatej anal biochem, 1999, 272(1)： 80-86.5 murata n,

12、 sato k, kon j, et al. quantitative measurement of sphingosine 1-phosphate by radioreceptor-binding assayj.anal biochem, 2000, 282 (1)： 115-120.6 he x , huang cl , schuchman eh. quantita/tiveanalysis of sphingosine-l-phosphate by hplc after napthalene-2 , 3-dicarboxaldehyde nda ) derivatizationj j c

13、hromatogr b analyt technol biomed life sci, 2009, 877(10)： 983-990.7 李長勇，姜向明，俞豪，等.高效液相色譜法測定 生物樣品中磷酸鞘氨醇的含量j.首都醫(yī)科大學學報， 2008, 29 (4)： 459-4628 jiang li, collins j, davis r, et al. use of a camp bret sensor to characterize a novel regulation of camp by the sphingosine l-phosphate/g13 pathwayjj biol chem

14、, 2007, 282 (14)： 10576-10584.9 han x, cheng h. characterization and direct quantitation of cerebroside molecular species from lipid extracts by shotgun lipidomicsjj lipid res, 2005, 46 (1)： 163-175.10 schmidt h , schmidt r , geisslinger g. lc-ms/ms-analysis of sphingosine-l-phosphate and related co

15、mpounds in plasma samples j . pros taglandins other lipid mediat, 2006, 81 (34)： 162-170.11 scherer m , schmitz g , liebisch g.high-throughput analysis of sphingosine 1-phosphate , sphinganine 1-phosphate , and lysophosphatidic acid in plasma samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

16、j clin chem, 2009, 55 (6)： 1218-1222.12 min jk, yoo hs, lee ey, et al.simuitaneous quantitative analysis of sphingoid base 1-phosphates in biological samples by o-phthalaldehyde precolumn derivatization after dephosphorylation with alkaline phosphatasej. anal biochem, 2002, 303 (2)： 167-175.13 calig

17、an tb , peters k , ou j , et al. a h i gh-performance liquid chromatographic method to measure sphingosine 1-phosphate and related compounds from sphingosine kinase assays and other biological samplesj. anal biochem, 2000, 281 (1 )： 36-44.14 ribar s, mesaric m, bauman m. high-performance liquid chro

18、matographic determination of sphinganine and sphingosine in serum and urine of subjects from an endemic nephropathy area in croatiaj. j chromatogr b biomed sci appl, 2001, 754 (2)： 511-519.15butter jj, koopmans rp, michel mc. a rapid and validated hplc method to quantify sphingosine 1-phosphate in human plasma using solid-phase extraction followed by derivatization with fluorescence detectionj. j chromatogr b, 2005, 824 (1-2)： 65-70.16 lee ym, venkataraman k, hwang si, et al. a novel method to quantify sphingosine 1-phosphate by immobilized metal a