牛奶中雌激素殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1、牛奶中雌激素殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展摘 要：雌激素作為一種類固醇激素，因其對(duì)動(dòng)物及人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的潛在危害已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注。牛奶在人類日常飲食結(jié)構(gòu)中占有重要位置，而研究表明在如今的商業(yè)牛奶中雌激素含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)。本文闡述了牛奶中雌激素的來源與危害，并重點(diǎn)介紹了對(duì)其殘留純化及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：牛奶；雌激素殘留；檢測(cè)Research Progress of Detection Methods on Estrogen Residual in MilkAbstract: In recently years, estrogen, a steroid hormone, has inten

2、sively been investigated due to its functionalities of human and animal endocrine system disorders and carcinogenic elements. More importantly, milk occupies a momentous position in people diet structure, while some researches demonstrate there is an escalating tendency on content of estrogen in com

3、mercial milk nowadays. In this paper, the source and harm of estrogens in milk is present, and the current research of purification and detection methods on estrogen residual in milk is summarized in detail. Key words: milk; estrogen residual; detection 雌激素是一類可直接影響動(dòng)物代謝與繁殖，具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的類固醇激素。該類物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，可干

4、擾體內(nèi)正常分泌物的合成、釋放、運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝及結(jié)合，激活或抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，最終造成機(jī)體代謝調(diào)控紊亂1 。雌激素在自然界中分布廣，危害大，即使在極低濃度下也會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生很大的影響。近年來，為促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)而使用雌激素，導(dǎo)致蛋類、肉類和乳類的雌激素殘留問題日益嚴(yán)重。己烯雌酚等合成類雌激素雖然早在2002年就已被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為禁止使用的藥物，并規(guī)定食品中不得檢出，但在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳粉（GB19644-2010）中，關(guān)于乳粉中雌激素的檢測(cè)并沒有提出要求2。與此同時(shí)，國(guó)際上已公認(rèn)，殘留在食品內(nèi)的雌激素極有可能增加人類睪丸癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌以及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率3-6，鑒于此西方各國(guó)紛紛制定相

5、應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，其中以歐盟最為嚴(yán)格，明確對(duì)其禁止使用。人類攝入雌激素的途徑很多，其中乳制品是主要來源7，因此，為保障飲用牛奶的健康與安全，對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)十分必要，隨著雌激素殘留問題日益受到重視，各種針對(duì)牛奶中雌激素含量的檢測(cè)技術(shù)也迅速發(fā)展。1 牛奶中雌激素的來源與危害1.1 雌激素的分類雌激素按來源可分為內(nèi)源性雌激素和環(huán)境雌激素兩大類。內(nèi)源性雌激素在通常情況下主要由卵巢合成分泌，包括雌二醇、雌酮和雌三醇等，其中以雌二醇的活性最高；環(huán)境雌激素主要是指人工合成的，具有模擬雌激素作用的化合物，一般被作為藥物使用，常見的有雙烯雌酚、己烯雌酚、乙炔雌醇、炔雌醚等8。除此之外，環(huán)境雌激素還包括自然界中存在的真菌

6、性雌激素和植物性雌激素。1.2 牛奶中雌激素的來源如今商業(yè)牛奶中所含的雌激素既有內(nèi)源性雌激素，即奶牛內(nèi)分泌產(chǎn)生的雌激素；也有人工合成雌激素，即應(yīng)用于奶牛的雌激素2。牛奶中內(nèi)源性雌激素的濃度主要取決于產(chǎn)奶動(dòng)物的種類，年齡和生理狀態(tài)等9。牛奶本身即含有種類豐富的類固醇，如雌二醇就可在奶牛乳腺中生物合成10。時(shí)下牛奶早已成為人們?nèi)粘Ｉ攀持械闹匾M成部分，無論國(guó)內(nèi)外牛奶的生產(chǎn)消費(fèi)都保持著猛烈地增長(zhǎng)勢(shì)頭，但需認(rèn)識(shí)到現(xiàn)在的商業(yè)牛奶與過去早已不同，就奶牛品種和飼養(yǎng)方法而言，現(xiàn)代飼養(yǎng)的高產(chǎn)奶牛多經(jīng)基因改良，其分泌牛奶中的雌激素含量較之過去顯著提高；而且為增加牛奶產(chǎn)量，通常使用高蛋白飼料喂養(yǎng)母牛，這也可能導(dǎo)致牛

7、奶中雌激素含量的提高11；由于人工授精技術(shù)的介入，現(xiàn)代奶牛幾乎可以在整個(gè)孕期持續(xù)泌乳，其血液中的雌激素含量在妊娠后期增加尤為顯著5。人工合成雌激素是牛奶中雌激素的重要來源。與天然雌激素相比，合成雌激素更為穩(wěn)定，易在動(dòng)物組織內(nèi)殘留，進(jìn)而通過食物鏈危害人類健康，早在上世紀(jì)六十年代，人工合成雌激素因?qū)π笄輨?dòng)物生長(zhǎng)催肥作用明顯，就被多國(guó)作為促生長(zhǎng)劑廣泛用于畜牧業(yè)，如己烯雌酚，雙烯雌酚12。以雙烯雌酚為例，作為非營(yíng)養(yǎng)飼料添加劑使用可顯著提高動(dòng)物體重和飼料利用率；亦可誘導(dǎo)乳腺發(fā)育的改變，繼而調(diào)控泌乳，提高奶牛的產(chǎn)奶量；還可作為獸藥，治療禽畜代謝紊亂等13。1.3 牛奶中雌激素的危害食物鏈并非雌激素進(jìn)入人體

8、的唯一途徑，直接接觸也是重要渠道之一。雌激素通過模擬或拮抗正常的內(nèi)源性激素，干擾內(nèi)分泌功能，進(jìn)而對(duì)生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生多方面影響，大量研究表明雌激素可刺激細(xì)胞分化，并與人體癌癥的發(fā)生存在因果關(guān)系14,15。Akio Sato等7研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在消費(fèi)的牛奶雌激素含量較高，而這可能與女性乳腺癌，卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)生有關(guān)。米蘭，意大利一項(xiàng)病例對(duì)照研究指出，牛奶飲用量與患前列腺癌之間有強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)，其讓步比（OR）為5.1，與不飲用牛奶的人相比，每天飲用超過兩杯牛奶的人更易患前列腺癌16；紐約的一項(xiàng)研究也有類似的結(jié)果，其OR值為2.49 17。另外有研究表明雌激素極有可能對(duì)嬰兒和青少年的生

9、長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重影響，盡管目前尚無直接證據(jù)，但多國(guó)政府已給予了高度重視。相比于人類而言，雌激素對(duì)于哺乳動(dòng)物的影響已日趨顯現(xiàn)。Jonathan J Li18以倉(cāng)鼠腎臟腺癌為模式探究不同雌激素與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果表明己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚在倉(cāng)鼠中誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機(jī)率是相同的。而雌激素促使幼鼠性早熟的報(bào)道早已屢見不鮮。除此之外，雌激素對(duì)于水生生物也有不可估量的影響。Islinger M等19研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期暴露在低濃度17A-乙炔雌二醇（50 ng/L）中的雄斑馬魚表現(xiàn)出明顯的內(nèi)分泌失調(diào)和睪丸發(fā)病跡象, 導(dǎo)致性器官自溶, 同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在江鱈和黑呆頭魚中, 而且暴露在雌激素環(huán)境中的成年斑馬魚性

10、器官無法再生。2 牛奶中雌激素殘留的純化及檢測(cè)技術(shù)牛奶基質(zhì)比較復(fù)雜，含有許多不同種類的大分子物質(zhì)，如脂肪、蛋白質(zhì)等，而雌激素殘留一般是痕量的，因此在進(jìn)行分析前往往需要復(fù)雜的樣品前處理過程。2.1 牛奶中雌激素殘留的前處理方法2.1.1 液液萃?。↙LE）液液萃取也稱溶劑萃取，是利用提取物在兩種互不相溶的溶劑中溶解度或分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的目的，是比較經(jīng)典的萃取方法，簡(jiǎn)便，無需特殊器材，但費(fèi)時(shí)，溶劑用量大。目前雌激素分離萃取中常見的萃取劑有丙酮、甲醇、乙腈、二氯甲烷等。Ban Ivan等20利用液液萃取，以乙酸乙酯作為萃取劑，獲得了一種天然共軛馬雌激素且同時(shí)去除了非共軛親脂性的化合物。2.1.

11、2 固相萃?。⊿PE）固相萃取作為一種常見的預(yù)處理技術(shù)，是利用固體吸附劑將目標(biāo)物從液體樣品中吸附出來，然后再用洗脫劑洗脫，從而達(dá)到分離和富集的目的。固相萃取可分為正相SPE，反相SPE，離子交換SPE和吸附SPE四大類，近年來SPE吸附劑不斷推陳出新，如免疫親和SPE，分子印跡SPE等。其中分子印跡SPE是當(dāng)前各國(guó)研究的熱點(diǎn)21，它是基于分子識(shí)別理論發(fā)展而來，雖然發(fā)展時(shí)間較短，但因其獨(dú)特的性能而倍受關(guān)注，如制備簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、使用壽命長(zhǎng)、可抵抗惡劣環(huán)境，尤其是可以定做特殊的分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，可特異識(shí)別印記分子等。Wang等22以雌酮為模板，丙烯酰胺為功能單體，-(2,3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基

12、硅烷作交聯(lián)劑，制備出了對(duì)雌酮有特異識(shí)別和選擇性的印跡材料，與液相色譜聯(lián)用，最低檢測(cè)限（LOD）可達(dá)9.3 ng/L。如今，分子印跡領(lǐng)域正逐步引入新的功能特性，如親水性、超導(dǎo)性、超順磁性等。2.1.3 固相微萃?。⊿PME）興起于上世紀(jì)末的固相微萃取技術(shù)是依托SPE發(fā)展而來的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)，包括直接萃取，頂空萃取和膜保護(hù)萃取。與SPE相比，SPME具有溶劑用量少，目標(biāo)物更易洗脫等特點(diǎn)，但美中不足的是，它的精密度較低，且無法有效地分離一些極性差異較小的物質(zhì)（如植物色素等）。Yang等23采用碳納米管強(qiáng)化固相微萃取技術(shù)聯(lián)合液相色譜檢測(cè)牛奶中的己烯雌酚，經(jīng)檢驗(yàn)該方法快速簡(jiǎn)便，效果良好，且LOD為5

13、.1g/L，適于日常飲用牛奶的分析。2.1.4 液相微萃取（LPME）液相微萃取技術(shù)集分離、濃縮、進(jìn)樣于一體，其基本原理與LLE相似，是微型化了的LLE，LPME僅使用很少的有機(jī)溶劑，就可對(duì)微量目標(biāo)物產(chǎn)生良好的富集作用，其不足之處在于重現(xiàn)性較差，萃取劑體積不易控制等。顧東海等24采用液相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法，以苯為萃取劑，檢測(cè)奶粉中的雙酚A，結(jié)果顯示該方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9，LOD為0.2 g/kg，加標(biāo)回收率為100.9103.4，方法快速準(zhǔn)確，適于此類分析。2.2 牛奶中雌激素殘留的儀器分析檢測(cè)方法2.2.1 氣相色譜法（GC）氣相色譜法是利用樣品中不同物質(zhì)在氣相和固定液液相間的分配系

14、數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)分離，以氣體為流動(dòng)相（如氮?dú)?、氫氣等），傳質(zhì)速度快，固定相一般由固定液涂漬在載體上制備而成。雖具高效和高靈敏性的特點(diǎn)，但只對(duì)可氣化且不易分解的物質(zhì)有效，而且進(jìn)樣量不易固定。在雌激素的檢測(cè)中，GC往往采用雌激素先與二氯乙酰氯衍生，然后用電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)，雖然靈敏度較高，但由于衍生化步驟較為復(fù)雜且很難控制過程中產(chǎn)生的水解反應(yīng)，所以此方法的應(yīng)用受到一定限制13。2.2.2 高效液相色譜法 (HPLC)作為一種較為成熟的理化檢測(cè)方法，高效液相色譜在農(nóng)獸藥殘留領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，它是利用物質(zhì)在兩相中吸附或分配系數(shù)的微小差異，配以高壓泵，從而實(shí)現(xiàn)快速分離。與GC相比，液相可分析不易揮發(fā)或熱穩(wěn)定性強(qiáng)

15、的組分，適用范圍廣，但分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。HPLC按液相分離模式可分為正相，反相和離子交換等，其中以反相HPLC發(fā)展最快，且已成為大多數(shù)雌激素殘留的常規(guī)檢測(cè)方法。周建科等25以乙腈-水作流動(dòng)相，建立了同時(shí)測(cè)定牛奶中五種雌激素的液相色譜法，分離效果良好，誤差小，平均回收率為67.0 %95.5 %，LOD為1.02.0g/ L。2.2.3 毛細(xì)管電色譜法（CEC）作為一種新興的微柱電分離技術(shù)，CEC是以電滲流為驅(qū)動(dòng)力，兼具毛細(xì)管電泳及HPLC的雙重分離機(jī)理，具有樣品用量少，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但CEC在操作中容易產(chǎn)生氣泡，造成電流不穩(wěn)，影響試驗(yàn)結(jié)果。近來發(fā)展的加壓毛細(xì)管電色譜（pCEC），通過將高壓直

16、流電場(chǎng)引入CEC中，克服了氣泡問題，分辨能力極大提高，尤為適用于分析結(jié)構(gòu)及荷質(zhì)比均相似的一類化合物。Liu等26采用梯度加壓毛細(xì)管電色譜法，有效地分離了己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚，且三種雌激素的檢測(cè)限在1.22.2×107 mol/L范圍內(nèi)。2.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（GC-MS/MS）聯(lián)用技術(shù)因其可以取長(zhǎng)補(bǔ)短，能集分離、定性(分子結(jié)構(gòu))和定量于一身，是現(xiàn)代農(nóng)獸藥殘留分析的重要發(fā)展方向。GC-MS/MS將氣相色譜與質(zhì)譜結(jié)合，具有分離能力強(qiáng)，靈敏度極高等特點(diǎn)，且定性、定量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，在雌激素的分離與檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。目前GC-MS/MS 技術(shù)已相當(dāng)成熟，面對(duì)日益加劇

17、的環(huán)境污染，關(guān)于GC-MS/MS在測(cè)定各環(huán)境組分中雌激素殘留的研究日益活躍，鄧曉麗等27用GC/MS法對(duì)奶粉中四種雌激素雌酮、雌二醇、雌三醇和炔雌酮進(jìn)行檢測(cè)，分離效果良好，且在低濃度下的加標(biāo)回收率為61.285.4%，LOD為0.130.3 ng/g，方法可靠。2.2.5 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（HPLC-MS/MS）與HPLC通過保留時(shí)間對(duì)物質(zhì)定性不同，HPLC-MS/MS通過電子將物質(zhì)擊碎，然后經(jīng)核質(zhì)比來定性，相對(duì)來說更為準(zhǔn)確；同時(shí)它彌補(bǔ)了GC-MS的不足，可對(duì)熱穩(wěn)定性差，強(qiáng)極性物質(zhì)以及生物大分子（如蛋白、核酸等）進(jìn)行分離，這也因此使LC-MS成為近年來激素類藥物研究檢測(cè)的熱點(diǎn)。張愛芝

18、等28采用正離子采集模式，建立牛奶中7種激素的超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測(cè)方法，待測(cè)物以甲醇為萃取劑，輔以超聲提取，經(jīng)LC-C18柱凈化，BEH-C18(100mm×2.1mm,1.7m)柱分離后進(jìn)行UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的定性及定量分析，LOD為0.010.25 g/kg，定量限為0.060.5 g/kg，添加水平為10 g/kg時(shí)，平均回收率為83%124%。2.3 基于生物技術(shù)的雌激素檢測(cè)分析方法2.3.1 免疫分析法（IA）免疫分析法是免疫化學(xué)測(cè)定方法的一種，基本原理是基于抗原抗體的特異性結(jié)合，方法選擇性好、經(jīng)濟(jì)且靈敏度高，適于痕量雌激素的半

19、定量分析，不過影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。目前測(cè)定雌激素的免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、發(fā)光免疫分析法以及分辨熒光免疫分析法等。Sun等29建立了對(duì)環(huán)境樣品中多種雌激素分子的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便可靠，對(duì)雌激素分子具有良好的專一性，且靈敏度約為普通液相的100倍。2.3.2 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（PCT）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是基于DNA芯片技術(shù)的發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生，它將各種微量純化的蛋白質(zhì)陣列在高密度固相載體上，而后與待測(cè)樣品雜交進(jìn)行高靈敏度的分析，可同時(shí)檢測(cè)幾百甚至上千種目標(biāo)蛋白，但由于蛋白質(zhì)作用動(dòng)力學(xué)的多樣性與復(fù)雜性以及生物樣品中目標(biāo)分子含量的不確定性，如何分辨假陽性信號(hào)和陽性弱

20、信號(hào)尚待解決。曹巧玲30將蛋白質(zhì)和小分子偶聯(lián)，通過Cy3對(duì)蛋白標(biāo)記，從而間接標(biāo)記小分子，利用非標(biāo)記小分子對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液中偶聯(lián)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)強(qiáng)度確定待測(cè)物質(zhì)的含量，成功地將壬基酚、雌二醇、阿特拉津、氯霉素和罌粟堿五種小分子與卵清蛋白偶聯(lián)，標(biāo)記后的偶聯(lián)物均能與各自的抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了五種小分子在一張芯片上的同時(shí)檢測(cè)。2.3.3 電化學(xué)分析方法（EC） 電化學(xué)分析方法是基于電化學(xué)原理與物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)而建立的一種分析方法，可快速準(zhǔn)確地測(cè)定微量或痕量組分，適用于有機(jī)生物、臨床藥物及苛刻環(huán)境中，但在操作過程中，易發(fā)生副反應(yīng)，影響電流效率，且電極易受污損。Ji-Eun Im等31通過分子水平上硫醇基和羰基的表面變性，

21、制造出了帶有雌激素受體的電極共價(jià)鍵，形成了打開側(cè)裝有羰基末端的自組裝單層膜，然后引入交聯(lián)劑與雌激素受體形成穩(wěn)定共價(jià)鍵以滿足分析的需要，結(jié)果顯示該方法雌激素檢測(cè)限在106 M級(jí)。3 展望雌激素在環(huán)境中通常以較低濃度存在，有時(shí)甚至是ng/L級(jí)，在水、土壤、空氣、沉積物和生物相中均有檢出，對(duì)人類和動(dòng)物生殖，發(fā)育，免疫，致癌和生態(tài)等方面存在潛在的危害效應(yīng)32。在經(jīng)歷了牛奶產(chǎn)業(yè)多重問題事件之后，我國(guó)消費(fèi)者早已變得人人自危，部分人群更是談奶色變，鑒于牛奶中雌激素殘留是涉及人類健康的公共安全問題，加強(qiáng)檢測(cè)刻不容緩。國(guó)外對(duì)于雌激素的潛在危害及檢測(cè)手段研究較早，無論是制度還是技術(shù)都較為成熟，國(guó)內(nèi)雖然起

22、步較晚，但近來年也引起了多方重視，此方面的研究也取得了迅猛發(fā)展。加快發(fā)展我國(guó)雌激素殘留的檢測(cè)技術(shù)，尤其是雌激素復(fù)雜基質(zhì)的前處理技術(shù)，與儀器分析法互補(bǔ)，進(jìn)而發(fā)展快速便攜化的多殘留篩選分析技術(shù)，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)分析過程自動(dòng)化或智能化，以提高分析效率、降低成本，保證消費(fèi)者的安全與健康，無論是對(duì)于估測(cè)食品安全，使國(guó)內(nèi)消費(fèi)者對(duì)乳業(yè)重拾信心，還是突破進(jìn)出口貿(mào)易壁壘，讓我國(guó)乳業(yè)走向世界，進(jìn)一步擴(kuò)大國(guó)際市場(chǎng)都是非常必要的。參考文獻(xiàn)：1 潘尚霞, 張建鵬, 戴昌芳.環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究進(jìn)展J.中國(guó)環(huán)境衛(wèi)生, 2006, 9(12):29-32.2 唐曉姝, 張秋香, 杜先鋒, 等.DSPE-LC-MS/MS

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