熱點(diǎn)實(shí)驗(yàn)：CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)案例介紹

1、背景：真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。與傳統(tǒng)的EMSA技術(shù)相比，染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（CHIP）能真實(shí)完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的最佳方法。原理：是在活細(xì)胞狀態(tài)下以甲醛固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，超聲將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后加入目的蛋白抗體，通過抗體沉淀靶蛋白-DNA復(fù)合物，通過洗脫的方法得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測（PCR分析），從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。應(yīng)

2、用：1.組蛋白修飾研究 2.轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析 3.藥物開發(fā)研究 4.有絲分裂研究 5.DNA損傷與凋亡分析。步驟：      1）甲醛處理細(xì)胞      2）收集細(xì)胞，超聲破碎      3）加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合      4）加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，沉淀      5）對沉淀下來的

3、復(fù)合物進(jìn)行清洗，除去一些非特異性結(jié)合      6）洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物      7）解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷      8）PCR或基因芯片分析。                 實(shí)驗(yàn)案例     

4、60;        證明C/EBP與Tmub1啟動子或增強(qiáng)子序列的結(jié)合 實(shí)驗(yàn)背景：在IL6誘導(dǎo)條件下,利用CHiP技術(shù)提取C/EBPDNA復(fù)合物，以Tmub1基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物，以提取的DNA為底物，進(jìn)行擴(kuò)增，從而證明C/EBP結(jié)合的DNA含有Tmub1基因，進(jìn)一步確認(rèn)C/EBP與Tmub1啟動子或增強(qiáng)子序列的相互作用。實(shí)驗(yàn)分組：分2個組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)普通PCR檢測和WB檢測（檢測Tmub1蛋白表達(dá)水平，抗體嘉美生物實(shí)驗(yàn)室提供。注：嘉美生物實(shí)驗(yàn)室提供絕大多數(shù)常用國外原裝進(jìn)口抗體，為實(shí)驗(yàn)委托者節(jié)約大量實(shí)驗(yàn)經(jīng)

5、費(fèi)。）第一組：A組 第二組：B組 轉(zhuǎn)染3天后收集細(xì)胞做CHIP-PCR以及WB檢測實(shí)驗(yàn)對照：設(shè)定的對照有      1、陽性對照（系統(tǒng)陽性對照，Anti-RNA Polymerase II）      2、INPUT對照（DNA片段在沉淀以前，收集下來的對照）      3、陰性對照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）細(xì)胞轉(zhuǎn)染流程:略      EZ-Ch

6、IP染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測流程（Upstste Catalog # 17-371)1、Kit Description：試劑盒內(nèi)含的RNA聚合酶II陽性對照抗體2、試劑盒組分：     A. Provided Kit Components          Store at 4:         ChIP Blocked Protein G Agarose  

7、;                1.5 ml          ChIP Dilution Buffer, One vial containing       24 ml         Low Salt Immune

8、 Complex Wash Buffer             24 ml         High Salt Immune Complex Wash Buffer            24 ml       

9、60; LiCl Immune Complex Wash Buffer                 24 ml         TE Buffer                

10、0;                      24 ml         0.5 M EDTA                 

11、                     250 ul         5 M NaCl                  

12、60;                     500 ul         SDS Lysis Buffer                

13、0;               10 ml         1 M Tris-HCl, pH 6.5                       &

14、#160;    500 ul         10X Glycine                                   

15、  11 ml         10X PBS                                      

16、0;  24 ml                 Store at -20:         Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制劑）  2×110 ul         RNase

17、 A                                  600 ug of RNase A in 60 ul sterile water.         Prot

18、einase K                             600 ug of Proteinase K in 60 ul           1M NaHCO3   

19、0;                            600 ul         Anti-RNA Polymerase II         

20、;        25ug  clone CTD4H8.         Normal rat IgG         Store at Room Temperature:        20% SDS    

21、                242 ul of 20% SDS.         Spin Filters               One bag containing 22 Spin Filters with Colle

22、ction Tubes         Collection Tubes           22 Collection Tubes.         Bind Reagent A             25 ml o

23、f Bind Reagent A.         Wash Reagent B             12.5 ml of Wash Reagent B.         Elution Reagent C          

24、1.5 ml of Elution Reagent C.     B. 抗體及血清         特異性抗體：Anti-CEBP Beta antibody E299 (ab32358,嘉美生物提供)          Normal rat IgG     C. 儀器設(shè)備    

25、;     微量混勻器Vortex mixer,         震搖器Rotating wheel/platform.         計(jì)時器Timer,         可調(diào)微量加樣槍以及tip頭，Variable volume (5-1000 ml) pipettes +

26、tips         高速離心機(jī)Microfuge,Variable temperature water bath,         細(xì)胞刮子Cell scraper,Sonicator,         1.5 Ml離心管Microfuge tubes,       

27、60;  PCR管PCR tubes,      D. 引物設(shè)計(jì)          略4、CHIP 操作流程      A. 細(xì)胞蛋白與染色質(zhì)的交聯(lián)及細(xì)胞裂解          預(yù)先準(zhǔn)備：       

28、0;  1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，150 mm培養(yǎng)瓶（20ml培養(yǎng)液）密度為80-90%，細(xì)胞數(shù)量1 x 10-7個；          2) 準(zhǔn)備42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培養(yǎng)皿以冰塊預(yù)冷；          3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常溫確保SDS溶解不析出；    &#

29、160;     4) Protease Inhibitor Cocktail II恢復(fù)至室溫。          正式步驟：          1) 于培養(yǎng)瓶中加入終濃度為1%的甲醛，室溫孵育10min；          2) 每個培養(yǎng)皿加入2 ml 10X Glycine（

30、甘氨酸）混勻，室溫放置5min，以中和甲醛反應(yīng)；          3) 盡可能吸取培養(yǎng)基，不要損傷細(xì)胞（冰上操作）；          4) 以20 ml預(yù)冷的1X PBS洗滌培養(yǎng)皿，去掉PBS，重復(fù)洗滌1次；          5) 同時取干凈試管加入2 ml預(yù)冷PBS，每管加5ul Protease Inhibitor C

31、ocktail II；          6) 每培養(yǎng)皿加入2 ml PBS，刮取細(xì)胞至錐形管；          7) 4離心700rpm，時間5min以沉淀細(xì)胞，去掉上清；          8) 將5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer

32、；          9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重懸細(xì)胞；          10) 分裝細(xì)胞懸液取容積約300-400 ul 至微量離心管備用。     B.  超聲處理裂解DNA            &#

33、160; 1) 管子置于碎冰上，超聲處理以打碎DNA，超聲發(fā)熱會部分降解染色質(zhì)，注意在冰上操作，普通貼壁細(xì)胞約1x 10-7個細(xì)胞/ml需要10次，每次4-5秒的超聲處理；             超聲儀基本要求：50-100WW功率，1-2mm探頭。          2) 4離心12000rpm，時間10min，移除沉淀，留下上清。   

34、60;      3) 上清轉(zhuǎn)移至干凈的微量離心管，每管約50-100ul；      C. 免疫共沉淀蛋白質(zhì)/DNA          準(zhǔn)備稀釋液（Dilution Buffer,，含蛋白酶抑制劑）置于冰上備用，         按照1塊膠計(jì)算（9個樣本）：900ul稀釋液中加入4.5ul Protease

35、 Inhibitor Cocktail II。         注：IP應(yīng)設(shè)置陽性對照(Anti-RNA Polymerase II)和陰性對照(Normal IgG)，陰性對照IgG應(yīng)保持與目的抗體來源種屬一致。         略     D. 蛋白/DNA-復(fù)合物洗脫           預(yù)先

36、準(zhǔn)備：將1M的NaHCO3恢復(fù)至室溫，使沉淀溶解。,         1) 準(zhǔn)備Elution Buffer以備IP管和input對照管使用“見C（5）”，每管按照如下準(zhǔn)備200ul elution buffer：10 ul 20% SDS，20ul 1 M NaHCO3和 170 ul sterile, distilled water。         2) C（5）input對照管加入200 ul Elution Buffer放置于

37、室溫備用，步驟E備用；         3) C（10）完成后，每管（IP管）加入100ul Elution Buffer，混勻于室溫孵育15min；         4) 3000rpm離心1min以沉淀Pellet agarose，收集上清至新離心管；         5) 重復(fù)4-5步驟，最終收集上清約200ul。   &

38、#160; E. 逆轉(zhuǎn)蛋白/DNA交聯(lián)（留取目的DNA片段）           略     F. 目的DNA的純化           取出Spin Filter-Collection Tube（自旋過濾器/收集管）和單獨(dú)的收集管Collection Tube備用；       

39、;   略          棄去Spin Filter，收集管Collection Tube里面的洗出液即為純化的DNA，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作或凍存于-20.     G. PCR of Controls         試劑：           

40、60;   PCR Master Mix(2x), Jiamay Biotech              DNA Marker DL2000, Jiamay Biotech              0.1% DEPC水、氯仿（分析純）、異丙醇（分析純）75%乙醇    

41、60;         AGAROSE(瓊脂糖)  AMRESCO，K499              10×DNA上樣緩沖液, Jiamay Biotech              0.5mg/ml EB 溶液，實(shí)驗(yàn)室常備 &

42、#160;            1×TBE, 實(shí)驗(yàn)室常備，配方參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 第二版         儀器：              (1) PCR儀,ABI9600        

43、;      (2) 電泳儀，北京六一儀器公司，DYCP-31DN型              (3) 高速離心機(jī)，湘儀H1650-W              (4) 紫外分光光度計(jì)，上海江儀儀器有限公司，UV-7502C(751)              (5) 成像系統(tǒng)，柯達(dá)紫外顯相系統(tǒng) 400W像素3、PCR（25L體系）CompositionVolume（L）目的DNA1.0Primer s