生物化學(xué)工程基礎(chǔ)：14- 生物分離（2）

1、李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering第十四講第十四講生物分離技術(shù)生物分離技術(shù)( (二二) )李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering生化物質(zhì)分離純化的三大技術(shù)生化物質(zhì)分離純化的三大技術(shù) 層析技術(shù)層析技術(shù) 電泳技術(shù)電泳技術(shù) 離心技術(shù)離心技術(shù)李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering14.1 層析技術(shù)及分類層析技術(shù)及分類層析技術(shù)層析技術(shù)也稱也稱色譜技術(shù)色譜技術(shù)， 1906 1906年俄國植物學(xué)家

2、年俄國植物學(xué)家Michael TswettMichael Tswett發(fā)現(xiàn)將發(fā)現(xiàn)將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為由此得名為“色譜法色譜法”（Chromatography) Chromatography) 。 后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。 以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層

3、析等。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering14.1.1 層析技術(shù)原理層析技術(shù)原理 層析系統(tǒng)包含層析系統(tǒng)包含固定相固定相( (不不移動固體或液體移動固體或液體) )和和流動相流動相( (移移動的液體或氣體動的液體或氣體) )。 層析分離是一個動態(tài)過程層析分離是一個動態(tài)過程，一個移動相對另一個固定相，一個移動相對另一個固定相作相對連續(xù)移動。作相對連續(xù)移動。 原理：移動相含有要分離原理：移動相含有要分離各溶質(zhì)受到固定相不同程度的各溶質(zhì)受到固定相不同程度的作用，因而各溶質(zhì)的移動速度作用，因而各溶質(zhì)的移動速度不同，從而達(dá)到分離。不同

4、，從而達(dá)到分離。流動相流動相固定相固定相李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering14.1.2 層析的分類層析的分類 按層析的分離機理分類按層析的分離機理分類 排阻層析排阻層析( (exclusion chromatography)exclusion chromatography) 離子交換層析離子交換層析( (ion exchange chromatography)ion exchange chromatography) 吸附層析吸附層析( (absorption chromatography)absorption chrom

5、atography) 分配層析分配層析( (partition chromatography)partition chromatography) 親和層析親和層析( (affinity chromatography)affinity chromatography) 金屬螯合層析金屬螯合層析( (metal chelating chromatography)metal chelating chromatography) 疏水層析疏水層析( (hydrophobic chromatography)hydrophobic chromatography) 反向?qū)游龇聪驅(qū)游? (reverse phas

6、e chromatography)reverse phase chromatography) 聚焦層析聚焦層析( (focusing chromatography)focusing chromatography) 灌注層析灌注層析( (perfusion chromatography)perfusion chromatography)李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1.排阻層析排阻層析 （凝膠層析凝膠層析或或分子篩層析分子篩層析） 凡是利用生物大分子的相對分子大小差異進(jìn)行層凡是利用生物大分子的相對分子大小差異進(jìn)行層析分

7、離的方法，均稱之為排阻層析。析分離的方法，均稱之為排阻層析。 用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻用于層析的分離介質(zhì)稱為排阻層析介質(zhì)層析介質(zhì)。 凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。 已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥在研究已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥在研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1) 凝膠層析的原理凝膠層析的原理 凝膠層析的

8、固定相是凝膠層析的固定相是惰性的惰性的珠狀凝膠顆粒，凝珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。概念（概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過裝有凝排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。術(shù)。原理：原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下

9、移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering添加大標(biāo)題李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering添加大標(biāo)題李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineeri

10、ng2) 凝膠層析的特點及應(yīng)用凝膠層析的特點及應(yīng)用特點：特點：設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)不改變樣品生物學(xué)活性活性等優(yōu)點。等優(yōu)點。用途：用途：蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)( (包括酶包括酶) )、核酸、多糖等生物、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering3) 凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì)(1)(1)

11、交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)Sephadex) Sephadex G(G-25Sephadex G(G-25、G50G50、G100G100、G250G250。) ) G G 后的數(shù)字為凝膠吸水值的后的數(shù)字為凝膠吸水值的1010倍。倍。(2)(2)瓊脂糖凝膠（瓊脂糖凝膠（Sepharose)Sepharose) 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。(3)(3)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯

12、酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。 商品名為生物膠商品名為生物膠P P（Bio-Gel P).Bio-Gel P).(4)(4) 聚丙乙烯凝膠（聚丙乙烯凝膠（Styrogel) Styrogel) 大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering4) 層析層析柱的重要參數(shù)柱的重要參數(shù)柱體積柱體積VtVt：從柱的底板到凝膠沉積表面的體積：從柱的底板到凝膠沉積表面的體積（床體積）。（床體積）。外水體積外水體積VoVo ：內(nèi)凝膠顆粒間隙的液體體積，亦：內(nèi)凝膠顆粒間隙的液體體

13、積，亦稱間隙體積。稱間隙體積。 內(nèi)水體積內(nèi)水體積ViVi ：顆粒內(nèi)部含水體積（定相體積）：顆粒內(nèi)部含水體積（定相體積）峰洗脫體積峰洗脫體積Ve Ve ：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液的體積。需洗脫液的體積。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering洗脫體積洗脫體積VeVtVoVi李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering5) 凝膠過濾在實驗室中的應(yīng)用凝膠過濾在實驗室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化生物大分子物質(zhì)的分離純化2 2）

14、分級分離）分級分離4 4）溶液濃縮）溶液濃縮李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering2. 離子交換層析離子交換層析 根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種物質(zhì)對樹根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種物質(zhì)對樹脂離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。脂離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。 離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團。分子中含有可解離的基團。 含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂，含有酸性可解離基團的稱為陽離子交換樹脂，可解離出可解離出H H+ +； 含有堿性可解離基團的

15、稱為陰離子交換樹脂，含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出可解離出OHOH- -。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1 1) )離子交換層析的原理離子交換層析的原理 生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價電解質(zhì)有不同的分子生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等多價電解質(zhì)有不同的分子大小及電荷排列方式。大小及電荷排列方式。 當(dāng)在一定當(dāng)在一定pHpH下下凈電荷為負(fù)凈電荷為負(fù)的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到合到帶正電荷的陰離子交換劑帶正電荷的陰離子交換劑上；上； 當(dāng)在一定當(dāng)在一定pHpH下下凈電荷為正凈電荷為正的

16、蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)的蛋白質(zhì)分子可通過靜電鍵結(jié)合到合到帶負(fù)電荷的陽離子交換劑帶負(fù)電荷的陽離子交換劑上；上； 大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢大分子依其與離子交換劑親和力的不同，而在以不同牢度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強度或度被吸附于離子交換劑，通過改變離子強度或( (和和) )pHpH使大分使大分子再從離子交換劑上先后被洗脫下來。子再從離子交換劑上先后被洗脫下來。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering陽離子交換樹脂分離蛋白示意圖陽離子交換樹脂分離蛋白示意圖李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室

17、生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering2 2) ) 離子交換層析的應(yīng)用離子交換層析的應(yīng)用(1)(1)水處理水處理 一種簡單而有效的除去雜質(zhì)及各種離子的方法，廣泛一種簡單而有效的除去雜質(zhì)及各種離子的方法，廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面（的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面（聚丙乙烯樹脂）。聚丙乙烯樹脂）。(2)(2)分離純化小分子物質(zhì)分離純化小分子物質(zhì) 離子交換層析廣泛應(yīng)用于無機離子、有機酸、核苷酸離子交換層析廣泛應(yīng)用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化小分子物質(zhì)的分離純化。 1 1）將氨基

18、酸混合液在）將氨基酸混合液在pHpH值為值為2 23 3上柱。上柱。 2 2）再逐步提高洗脫液的離子強度和）再逐步提高洗脫液的離子強度和pHpH值值 3 3）各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。）各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering(3)(3)分離純化生物大分子物質(zhì)分離純化生物大分子物質(zhì) 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH控制大分子如蛋白質(zhì)等兩性電介質(zhì)，依據(jù)大分子物控制大分子如蛋白質(zhì)等兩性電介質(zhì)，依據(jù)大分子物質(zhì)帶電性質(zhì)的不同來進(jìn)行分離純化，是分離純化蛋白質(zhì)等生物質(zhì)帶電性質(zhì)的不同來進(jìn)行分離純化，是分離純化蛋

19、白質(zhì)等生物大分子的一種重要手段。大分子的一種重要手段。 由于生物樣品的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層由于生物樣品的復(fù)雜性，一般很難只經(jīng)過一次離子交換層析就達(dá)到高純度，往往要析就達(dá)到高純度，往往要與其它分離方法結(jié)合使用。與其它分離方法結(jié)合使用。 使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分使用離子交換層析分離樣品要充分利用其按帶電性質(zhì)來分離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到離的特性，只要選擇合適的條件，通過離子交換層析可以得到較滿意的分離效果。較滿意的分離效果。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineerin

20、g3. 3. 吸附層析吸附層析 利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團利用吸附層析介質(zhì)表面的活性分子或活性基團，對流動相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對不，對流動相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對不同溶質(zhì)同溶質(zhì)吸附能力的強弱吸附能力的強弱而進(jìn)行分離的一種方法。而進(jìn)行分離的一種方法。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering常用的固體吸附劑和洗脫溶液常用的固體吸附劑和洗脫溶液 氧化鋁、硅酸鎂、磷酸鈣、氫氧化鈣、活性氧化鋁、硅酸鎂、磷酸鈣、氫氧化鈣、活性鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。鈣、蔗糖、纖維素和淀粉。 常用的洗脫液有：乙烷、苯乙醚

21、、氯仿，以常用的洗脫液有：乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水與有機溶劑形成的各種混合物及乙醇、丙酮或水與有機溶劑形成的各種混合物。 通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素通常用于分離脂類、類固醇類、類胡羅卜素、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強的、葉綠素以及它們的前體等非極性和極性不強的有機物。有機物。 多用于成分和濃度分析多用于成分和濃度分析 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering4. 分配層析分配層析 利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)，

22、相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。目的的層析技術(shù)，相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。 在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、在分配層析中，固定相是極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物甲醇等）。此類溶劑能和多孔的支持物( (常用的是吸附力小、常用的是吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉，濾紙等) )緊密結(jié)合，緊密結(jié)合，使呈不流動狀態(tài)；流動相則是非極性的有機溶劑。使呈不流動狀態(tài)；流動相則是非極性的有機溶劑。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering紙層

23、析分析樣品示意圖紙層析分析樣品示意圖李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering 當(dāng)有機溶劑流動相流經(jīng)樣品點時，樣品中的溶質(zhì)便按其分當(dāng)有機溶劑流動相流經(jīng)樣品點時，樣品中的溶質(zhì)便按其分配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動相向前移動。當(dāng)經(jīng)過前方固定相時，流配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動相向前移動。當(dāng)經(jīng)過前方固定相時，流動相中的溶質(zhì)就會進(jìn)行分配，一部分進(jìn)入固定相。通過這樣不動相中的溶質(zhì)就會進(jìn)行分配，一部分進(jìn)入固定相。通過這樣不斷進(jìn)行的流動和再分配，溶質(zhì)沿著流動方向不斷前進(jìn)。各種溶斷進(jìn)行的流動和再分配，溶質(zhì)沿著流動方向不斷前進(jìn)。各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動的

24、速度也各不相同。分配系數(shù)質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動的速度也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動相少些，溶較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動相少些，溶質(zhì)移動較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動速度較快。從而將質(zhì)移動較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開來。分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開來。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering5. 親和層析親和層析許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生許多物質(zhì)都具有和某化合物發(fā)生特異性可逆結(jié)合特異性可逆結(jié)合的特性。的特性。 例如：例如： 酶與

25、輔酶酶與輔酶 蛋白亞基和亞基蛋白亞基和亞基 酶與底物酶與底物 抗原與抗體抗原與抗體 供體和受體供體和受體 維生素與結(jié)合蛋白維生素與結(jié)合蛋白 凝集素與多糖（或糖蛋白、細(xì)胞表面受體）凝集素與多糖（或糖蛋白、細(xì)胞表面受體） 核酸與互補鏈核酸與互補鏈 細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）等。細(xì)胞與細(xì)胞表面特異蛋白（或凝集素）等。 。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1 1) ) 親和層析的原理親和層析的原理 親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可親和層析法就是利用化學(xué)方法將可與待分離物質(zhì)可逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接

26、到某種固相載體逆性特異結(jié)合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大上，并將載有配體的固相載體裝柱，當(dāng)待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后特異的結(jié)合而留在柱上，其他物質(zhì)則被沖洗出去。然后再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下再用適當(dāng)方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的目的來，從而達(dá)到分離提純的目的 。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engine

27、ering配體配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物體復(fù)合物交聯(lián)試劑交聯(lián)試劑載體載體配體配體載體與配體載體與配體交聯(lián)體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體游離配體或類似物或類似物李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering2 2). ). 親和層析的特點親和層析的特點 純化效率極高：親和層析由于配體與待純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進(jìn)行分離物質(zhì)進(jìn)行特異性特異性結(jié)合，所以分離提純結(jié)合，所以分離提純的效率極高，的效率

28、極高，提純度可達(dá)幾千倍提純度可達(dá)幾千倍 。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering3). 親和層析的應(yīng)用親和層析的應(yīng)用(1)(1) 抗原和抗體分離純化抗原和抗體分離純化(2) (2) 激素和受體蛋白分離純化激素和受體蛋白分離純化(3) (3) 凝集素和糖蛋白分離純化凝集素和糖蛋白分離純化(4) (4) 多核苷酸和核酸分離純化多核苷酸和核酸分離純化 (5) (5) 輔酶分離純化輔酶分離純化(6) (6) 病毒（疫苗）、細(xì)胞分離純化病毒（疫苗）、細(xì)胞分離純化。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Bioc

29、hemical Engineering4). 親和層析的應(yīng)用舉例親和層析的應(yīng)用舉例 純化人心肌肌鈣蛋白純化人心肌肌鈣蛋白I I分離技術(shù)：分離技術(shù)：親和層析親和層析分離親和劑：分離親和劑：兔肌鈣蛋白兔肌鈣蛋白C C分離原理：分離原理：兔肌鈣蛋白兔肌鈣蛋白C C與與人心肌肌鈣蛋白人心肌肌鈣蛋白C C結(jié)構(gòu)一樣結(jié)構(gòu)一樣，肌鈣蛋白，肌鈣蛋白C C與人心肌肌鈣與人心肌肌鈣蛋白蛋白I I互為亞基，可以特異互為亞基，可以特異性結(jié)合。性結(jié)合。HcTnI人心肌組織破碎液李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering6. 金屬螯合層析金屬螯合層析(IMA

30、C) 利用固定相利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基為配基與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，與二價金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組二價金屬離子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。離的方法，稱之為金屬螯合層析。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering 金屬螯合層析技術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于金屬螯合層析技術(shù)在現(xiàn)代基因工程中常用于表達(dá)

31、蛋白的分離表達(dá)蛋白的分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein載體載體亞胺基二乙酸亞胺基二乙酸李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical EngineeringIMAC純化蛋白操作原理純化蛋白操作原理NiNi2+2+NiNi2+2+咪唑洗脫咪唑洗脫雜質(zhì)目標(biāo)蛋白純化蛋白固定化酶李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering金屬螯合層析舉例金屬螯合層析舉例 純化工業(yè)催化用酶純化工業(yè)催化用酶DAAODAAO酶酶分離技術(shù)：分離技術(shù)：金屬螯合層析金屬螯合層析分離結(jié)合劑：分離結(jié)合劑：Ni

32、Ni離子離子分離原理：分離原理：構(gòu)建融和蛋白構(gòu)建融和蛋白，使其在蛋白質(zhì)的，使其在蛋白質(zhì)的N N端或端或C C端帶上端帶上6 6HisHis（組氨酸）（組氨酸）結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)，6 6HisHis結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)與NiNi離離子特異性結(jié)合。子特異性結(jié)合。 1 2 3 4 5Lane 1：粗酶液：粗酶液Lane 2：沒有吸附在純化柱上的蛋白：沒有吸附在純化柱上的蛋白Lane 3：咪唑濃度為：咪唑濃度為51mM的溶液洗脫的蛋白的溶液洗脫的蛋白Lane 4：同：同3Lane 5：同：同3谷胱甘肽谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶-GST標(biāo)簽標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生

33、物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering電泳技術(shù)電泳技術(shù)電泳的概念電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電帶電物質(zhì)在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。 電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（18081808年俄國物理學(xué)家年俄國物理學(xué)家ReRessss進(jìn)行了世界上第一次電泳實驗進(jìn)行了世界上第一次電泳實驗）。）。 1937 1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型

34、的電泳技術(shù)相是近幾十年以來，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1 電泳的基本原理電泳的基本原理 電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，電泳是在電場的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運動，不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同的物質(zhì)在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。度不同進(jìn)而達(dá)到分

35、離目的。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering2 2 電泳的分類電泳的分類原則上原則上按電泳的原理來分按電泳的原理來分，可分為二類：，可分為二類：自由界面電泳：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應(yīng)用。推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止

36、電泳過程中對流分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過程中對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering紙電泳：紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。定量分析。醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、

37、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。紙電泳分辨率高。 以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有以上二種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering淀粉凝膠電泳：淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分

38、析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：可

39、用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。其分辨率較高?；皺z測。其分辨率較高。 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質(zhì)李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering瓊脂糖凝膠電泳分離純化瓊脂糖凝膠電泳分離純化DNA片段片段李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering3 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel elect

40、rophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對pHpH和溫度變化小，沒和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。質(zhì)。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱簡稱Acr）和交聯(lián)劑和交聯(lián)劑N N，N N- -甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙丙烯酰胺（methylane bisacrylam

41、ide，簡稱簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。在催化劑作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical EngineeringCH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N, N-甲叉甲叉雙丙烯酰胺雙丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH

42、2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH( )n( )n( )m( )m李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1） 聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠的制備聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合為自由基聚合，其催化體系有兩種： 1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合 化學(xué)聚合的催化劑（化學(xué)聚合的催化劑（引發(fā)劑引發(fā)劑）通常采

43、用）通常采用過硫酸銨過硫酸銨（ammonium persulfate，Ap），），此外還需要此外還需要加速劑加速劑TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量存在。微量TEMED的加入，可促使過硫酸銨形成自由基的加入，可促使過硫酸銨形成自由基： S2O82- 2SO4- 這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Bioche

44、mical Engineering2） 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都凝膠的物理性質(zhì)如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（取決于凝膠總濃度（T T）和和AcrAcr與與BisBis兩者之比。凝膠總濃度（兩者之比。凝膠總濃度（T T）和交聯(lián)度（和交聯(lián)度（C C）的計算公式分別為：的計算公式分別為：Acr（g）+Bis（g）Bis(g)X100%C =Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%T = 凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越凝膠濃度越大，孔

45、徑越小大，孔徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為后，交聯(lián)度為5%5%時，凝膠具有最小孔徑，時，凝膠具有最小孔徑，超過超過5%5%或低于或低于5%5%時凝膠孔徑都要增大。時凝膠孔徑都要增大。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering3） 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面： 1）凝膠由上、下兩層

46、凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠（層為大孔徑的濃縮膠（23），下層為小孔徑的分離膠（），下層為小孔徑的分離膠（ 515 ）。）。 2）緩沖液離子組成的不連續(xù)性。主要是陰離子不同（緩沖液離子組成的不連續(xù)性。主要是陰離子不同（Gly-, Cl-）。）。 3）凝膠的凝膠的pH不同。電極緩沖液為不同。電極緩沖液為pH8.3的的Tris-甘氨酸緩沖液甘氨酸緩沖液，濃縮膠為，濃縮膠為pH6.8的的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為緩沖液，而分離膠為pH8.9 的的Tris-HCl緩沖液。緩沖液。 4）在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在電場中形

47、成不連續(xù)的電位梯度。 在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical EngineeringTris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工

48、程基礎(chǔ) Biochemical Engineering李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering4 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈的不同。這種差異就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。電荷以及分子量和形狀有關(guān)。 當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的當(dāng)電泳

49、體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉（SDSSDS）時，則電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可時，則電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。直接由電泳遷移率推算出蛋白質(zhì)的分子量。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering1) SDS的作用原理的作用原理 這種陰離子去污劑能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子部這種陰離子去污劑能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子部、分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵、分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵, ,使蛋白質(zhì)變使蛋白質(zhì)變性

50、而改變原有的空間構(gòu)象。性而改變原有的空間構(gòu)象。 當(dāng)當(dāng)SDSSDS的總量為蛋白量的的總量為蛋白量的3 31010倍且倍且SDSSDS單位濃度大于單位濃度大于1 1mol./Lmol./L時，這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合時，這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.41.4克克SDSSDS。 蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDSSDS陰離子，所帶負(fù)電荷陰離子，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間電荷符號的差異。且由于分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的電荷符號的差異。且由于分子量越大的

51、蛋白質(zhì)結(jié)合的SDSSDS越多越多，所帶負(fù)電荷也越多，這就使各蛋白質(zhì)，所帶負(fù)電荷也越多，這就使各蛋白質(zhì)- -SDSSDS復(fù)合物的復(fù)合物的電荷密度電荷密度趨于一致趨于一致。 不同蛋白質(zhì)的不同蛋白質(zhì)的SDSSDS復(fù)合物形狀也相似，均是長復(fù)合物形狀也相似，均是長。 在電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質(zhì)在電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質(zhì)- -SDSSDS復(fù)合物的大小復(fù)合物的大小，也可以說是，也可以說是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，而與蛋白質(zhì)原來所，而與蛋白質(zhì)原來所帶電荷量無關(guān)。帶電荷量無關(guān)。 李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engi

52、neering2) 測定蛋白質(zhì)分子量測定蛋白質(zhì)分子量 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,00017,000165,000165,000之間時，蛋白質(zhì)之間時，蛋白質(zhì)- -SDSSDS復(fù)合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：復(fù)合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系： lgMW=lgK lgMW=lgKbmbm MW為蛋白質(zhì)的分子量， m為相對遷移率(走的距離)， K為常數(shù)， b為斜率 將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS -SDS -聚丙烯酰胺凝膠中的聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖

53、，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering未知蛋白未知蛋白李強 化工系生化所 抗體與生物催化工程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical EngineeringSDSPAGE 蛋白質(zhì)電泳(實驗例子)李強 化工系生化所 抗體與生物催化工

54、程實驗室生物化學(xué)工程基礎(chǔ) Biochemical Engineering5 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳(Isoelectric Focusing-PAGE，IEF-PAGE) 聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，聚丙烯酰胺凝膠中加入一種合成的兩性電解質(zhì)載體，在電在電場的作用下會自發(fā)形成一個連續(xù)的場的作用下會自發(fā)形成一個連續(xù)的pHpH梯度梯度。蛋白質(zhì)樣品在電泳。蛋白質(zhì)樣品在電泳中被分離，運動到等電點膠層時就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在中被分離，運動到等電點膠層時就失去所帶電荷而穩(wěn)定停留在該處，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點不同，因而在等電聚焦電該處，樣品中不同蛋白質(zhì)組分等電點不同，因而在等電聚焦電泳中得到有效分離。在等電聚焦電泳中，利用各蛋白質(zhì)組分等泳中得到有效分離。在等電聚焦電泳中，利用各蛋白質(zhì)組分等電點的