考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)含量

1、.實(shí)驗(yàn)十四 考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)含量一、 目的學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。二、原理考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑

2、配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為01 000gmL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。二、 材料、主要儀器和試劑1實(shí)驗(yàn)材料新鮮綠豆芽2主要儀器（1）分析天平、臺式天平（2）刻度吸管（3）具塞試管、試管架（4）研缽（5）離心機(jī)、離心管（6）燒杯、量筒（7）微量取樣器（8）分光光度計(jì)3試劑（1）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1 000gmL的原液。（2）蛋白試劑考馬斯亮藍(lán)G-250的配制：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90乙醇中，加入85（

3、WV）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1 000mL。此溶液在常溫下可放置一個月。（3）乙醇（4）磷酸（85）四、操作步驟1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（1）0100gmL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取6支10mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長下比色，記錄各管測定的光密度OD595nm，并做標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1 低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管 號1234561 000gmL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10蒸餾水（mL）1.000.980.960.940.920.90考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）555555蛋白質(zhì)含量（g

4、）020406080100OD595nm      （2）01 000gmL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：另取6支10mL具塞試管，按表2取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為01 000gmL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表2 高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管 號7891011121 000gmL標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0蒸餾水（mL）1.000.80.60.40.20考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）555555蛋白質(zhì)含量（g）02004006008001 000OD595nm      

5、;2樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定（1）待測樣品制備：稱取新鮮綠豆芽下胚軸2g放入研缽中，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.51h以充分提取，然后在4 000r/min離心20min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測樣品提取液。（2）測定：另取2支10mL具塞試管，按下表取樣。吸取提取液0.1mL（做一重復(fù)），放入具塞刻度試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，記錄光密度OD595nm，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣品提取液中蛋

6、白質(zhì)的含量X（g）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號試管做空白。表3 待測液蛋白質(zhì)濃度測定管 號1314蛋白質(zhì)待測樣品提取液（mL）0.10.95  0.10.95  蒸餾水（mL）考馬斯亮藍(lán)G-250試劑（mL）OD595nm蛋白質(zhì)含量（g）五、結(jié)果計(jì)算 X×提取液總體積（mL）樣品蛋白質(zhì)含量（g / g鮮重）=測定時取樣體積（mL）樣品鮮重（g）式中：X為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（g）。六、附 注1Bradford法由于染色方法簡單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。2有些陽離子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物質(zhì)不干擾測定，但大量的去污劑如TritonX-100、SDS等嚴(yán)重干擾測定。3蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，在2min左右反應(yīng)達(dá)到平衡；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測定時，不可放置太長時間，否則將使測定結(jié)果偏低。七、思考題1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定樣品時，為什