實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)變性凝固及沉淀WT實(shí)用教案

1、實(shí)驗(yàn)(shyn)目的能夠說(shuō)出蛋白質(zhì)變性(binxng)、凝固反應(yīng)的原理及實(shí)驗(yàn)方法能夠說(shuō)出蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng)的原理及實(shí)驗(yàn)方法能夠運(yùn)用鹽析法及重金屬沉淀法第1頁(yè)/共20頁(yè)第一頁(yè)，共20頁(yè)。主要(zhyo)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 蛋白質(zhì)的加熱變性(binxng)凝固 蛋白質(zhì)沉淀反應(yīng) 蛋白質(zhì)鹽析 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)第2頁(yè)/共20頁(yè)第二頁(yè)，共20頁(yè)。 在某些理化因素(yn s)的作用下，蛋白質(zhì)嚴(yán)格的空間結(jié)構(gòu)被破壞（不包括肽鍵的斷裂），從而引起若干理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)改變的現(xiàn)象。第3頁(yè)/共20頁(yè)第三頁(yè)，共20頁(yè)。變性(binxng)因素物理(wl)因素高溫、高壓紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)、電離輻射和超聲波等化學(xué)因

2、素強(qiáng)酸、強(qiáng)堿有機(jī)溶劑、重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等變性實(shí)質(zhì)：變性實(shí)質(zhì)： 破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響（分子組成、破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響（分子組成、分子量不變）。分子量不變）。第4頁(yè)/共20頁(yè)第四頁(yè)，共20頁(yè)。變性(binxng)的可逆性可逆變性(binxng)：除去變性(binxng)因素，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)可以恢復(fù)原狀。不可逆變性(binxng)：除去變性(binxng)因素，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)不能恢復(fù)原狀。消滅病原微生物消滅病原微生物蛋白質(zhì)制劑的保存蛋白質(zhì)制劑的保存保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)保護(hù)體內(nèi)蛋白質(zhì)第5頁(yè)/共20頁(yè)第五頁(yè)，共20頁(yè)。 蛋白質(zhì)分子顆粒大小(dxio)1-100nm之間,屬膠體

3、顆粒范圍，在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體。原因(yunyn)表面形成水化層表面同種電荷的斥力除去這兩個(gè)因素，就會(huì)發(fā)生沉淀。蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)為沉淀。+第6頁(yè)/共20頁(yè)第六頁(yè)，共20頁(yè)。+-蛋白質(zhì)膠體顆粒(kl)的沉淀 帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水(tu shu)脫水(tu shu)脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 （沉淀）帶正電荷的蛋白質(zhì) （疏水膠體）帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì) （疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）-第7頁(yè)/共20頁(yè)第七頁(yè)，共20頁(yè)。結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(jigu)(jigu)和性質(zhì)都不變和性質(zhì)都不變適當(dāng)條件下可重新溶解適當(dāng)條件下可重新溶解是分離

4、和純化的基本方法是分離和純化的基本方法結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生變化結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都發(fā)生變化沉淀不再溶解于水沉淀不再溶解于水蛋白質(zhì)的沉淀第8頁(yè)/共20頁(yè)第八頁(yè)，共20頁(yè)。蛋白質(zhì)變性沉淀并凝聚成塊狀稱(chēng)為凝固(nngg)。不可逆變性狀態(tài)第9頁(yè)/共20頁(yè)第九頁(yè)，共20頁(yè)。蛋白質(zhì)變性、沉淀(chndin)與凝固的關(guān)系 變性屬于蛋白質(zhì)本質(zhì)的變化，沉淀和凝固屬于一種現(xiàn)象 變性不一定沉淀，變性蛋白質(zhì)只在等電點(diǎn)附近才沉淀 變性蛋白易于(yy)沉淀， 沉淀蛋白不一定變性 沉淀的變性蛋白質(zhì)也不一定凝固第10頁(yè)/共20頁(yè)第十頁(yè)，共20頁(yè)。蛋白質(zhì)的加熱(ji r)變性凝固 蛋白質(zhì)分子受熱作用，分子空間結(jié)構(gòu)變化，疏水基團(tuán)( j tu

5、n)暴露于分子表面，溶解度降低。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子不帶電荷（處于等電點(diǎn)條件下），則蛋白質(zhì)發(fā)生聚集出現(xiàn)沉淀； 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子帶電（處于非等電點(diǎn)條件下），則蛋白質(zhì)因靜電排斥作用而不出現(xiàn)沉淀；第11頁(yè)/共20頁(yè)第十一頁(yè)，共20頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)內(nèi)容 取三只小玻璃試管，各加入10%蛋白質(zhì)溶液10d，分別標(biāo)記為1、2和3號(hào)管；向1號(hào)管中加入：pH4.8緩沖液10d ?；靹颍诰凭珶羯暇徛訜嶂练悬c(diǎn)，觀(guān)察(gunch)變化（ ）；高溫下，蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變性(binxng)并凝固。第12頁(yè)/共20頁(yè)第十二頁(yè)，共20頁(yè)。2.向2號(hào)管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L HCl 2d。混勻，于酒精燈上緩慢加

6、熱至沸點(diǎn)，觀(guān)察變化（ ）3.停止加熱，向2號(hào)管中逐滴加入：0.1mol/L NaCO3 。搖勻后繼續(xù)(jx)滴加，一旦出現(xiàn)絮狀物即停止。4.將2號(hào)管于酒精燈上加熱，觀(guān)察現(xiàn)象（ ）5.冷卻后，再加入： 0.1mol/L HCl 2d。觀(guān)察現(xiàn)象（ ）蛋白質(zhì)變性(binxng)不一定出現(xiàn)沉淀；蛋白質(zhì)變性(binxng)后在特定條件下發(fā)生沉淀；沉淀加熱后發(fā)生不可逆變性(binxng)并凝固。第13頁(yè)/共20頁(yè)第十三頁(yè)，共20頁(yè)。3.向3號(hào)管中加入：H2O 8d, 0.1mol/L NaOH 2d?；靹颍诰凭珶羯暇徛?hunmn)加熱至沸點(diǎn)，觀(guān)察變化（ ）；4.停止加熱，向3號(hào)管中逐滴加入：0.1mo

7、l/L HAC。一旦出現(xiàn)絮狀物即停止。5.繼續(xù)滴加：0.1mol/L HAC 1d。觀(guān)察現(xiàn)象（ ）6.將3號(hào)管于酒精燈上加熱，觀(guān)察現(xiàn)象（ ）7.向3號(hào)管中加入： 0.1mol/L NaOH 。一旦出現(xiàn)絮狀物即停止。8.將3號(hào)管于酒精燈上加熱，觀(guān)察現(xiàn)象（ ）9.冷卻后，再加入： 0.1mol/L NaOH 2d。觀(guān)察現(xiàn)象（ ）蛋白質(zhì)變性(binxng)不一定出現(xiàn)沉淀；蛋白質(zhì)變性(binxng)后在特定條件下發(fā)生沉淀，并可逆；第14頁(yè)/共20頁(yè)第十四頁(yè)，共20頁(yè)。蛋白質(zhì)沉淀(chndin)反應(yīng) 蛋白質(zhì)的鹽析 一定濃度中性鹽 （ (NH4)2SO4、Na2SO4等）可去除蛋白質(zhì)分子所帶電荷及其表面的

8、水化層，從而使蛋白質(zhì)從溶液中聚集沉淀出來(lái)。利用這個(gè)原理使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來(lái)的方法為鹽析。 不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度不同，可以(ky)通過(guò)不同濃度鹽溶液分離不同蛋白質(zhì)，就是分段鹽析。 大部分蛋白質(zhì)都可用飽和(NH4)2SO4溶液鹽析出來(lái)。 某些蛋白質(zhì)在半飽和(NH4)2SO4溶液中析出。 鹽析是一個(gè)可逆沉淀反應(yīng)。第15頁(yè)/共20頁(yè)第十五頁(yè)，共20頁(yè)。實(shí)驗(yàn)(shyn)內(nèi)容 取一只小玻璃試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液； 加入等體積飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后靜置3min。觀(guān)察(gunch)現(xiàn)象（ ） 對(duì)該溶液進(jìn)行過(guò)濾，將濾液收集于一只干凈試管中，取部分轉(zhuǎn)入另一只試管中； 向一只試管中加入結(jié)

9、晶(NH4)2SO4粉末，直到粉末不再溶解（成為飽和(NH4)2SO4溶液）； 比較兩只試管現(xiàn)象（ ）第16頁(yè)/共20頁(yè)第十六頁(yè)，共20頁(yè)。蛋白質(zhì)沉淀(chndin)反應(yīng) 重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 在堿性( jin xn)條件下，重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶性蛋白鹽而沉淀。 取一只小玻璃試管，加入1mL蛋白質(zhì)溶液； 加入0.1mol/mL NaOH 2d，混勻； 逐滴加入CuSO4，搖勻，直至出現(xiàn)沉淀為止。第17頁(yè)/共20頁(yè)第十七頁(yè)，共20頁(yè)。蛋白質(zhì)沉淀(chndin)反應(yīng) 生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì) 在酸性條件下，蛋白質(zhì)可與生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些(mu xi)酸(如三氯醋酸、過(guò)氯酸、硝酸)結(jié)合成不溶性的鹽沉淀，此時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷易于與酸根負(fù)離子結(jié)合成鹽。 取一只小玻璃試管，加入1mL蛋白質(zhì)溶液； 加入飽和苦味酸 6d，觀(guān)察現(xiàn)象（ ）；注意：苦味酸屬危險(xiǎn)試劑，操作時(shí)勿接觸皮膚第18頁(yè)/共20頁(yè)第十八頁(yè)，共20頁(yè)。 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(