動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)

1、綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目指導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱：動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)及活力檢測(cè)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)握原代細(xì)胞培養(yǎng)的一般方法和步驟及培養(yǎng)過程屮無菌操作技術(shù), 熟悉原代培養(yǎng)細(xì)胞的觀察方法及細(xì)胞活力的測(cè)定方法，為細(xì)胞工程中的胚胎移植、細(xì) 胞融合與單克隆抗體制備等技術(shù)奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)。三、實(shí)驗(yàn)原理用直接從機(jī)體獲取的細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。這種培養(yǎng)過程是把組織或器官?gòu)?動(dòng)物體取出，分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷的生長(zhǎng)和繁殖。原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系的第一步。利用原代培養(yǎng)技術(shù)可以在體外進(jìn)行各種類型細(xì) 胞的壇殖、遺傳、變異、分化和脫分化、惡變與去惡變等研究。原代培養(yǎng)科分為組織 培養(yǎng)法和消化法兩種。臺(tái)盼

2、藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力的原理：臺(tái)盼藍(lán)是檢測(cè)死、活細(xì)胞最常用的牛物染色試劑 z-o健康的正常細(xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，而死廣的細(xì)胞，由于膜的完整性喪失，通透 性增加，細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。!1!實(shí)驗(yàn)材料:1新生兔2. 大剪了、彎頭眼科剪、小鐵了、平皿、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、燒杯、酒精燈、移液槍、超凈 工作臺(tái)、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、0.22 u m細(xì)菌過濾器、移液槍、槍尖、pe手套、一次性無菌橡 膠手套、脫脂棉、無水乙醇、臺(tái)盼藍(lán)、15ml離心管3. dmem培養(yǎng)基、血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋口酶五、實(shí)驗(yàn)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、顯微鏡六、實(shí)驗(yàn)步驟(方案)：(如需要學(xué)生設(shè)計(jì)，也要提交一參考方案供論

3、證評(píng)審)()dmem培養(yǎng)基的配制1. 將dmem培養(yǎng)基干粉用800ml超純水溶解，加入3.7gnahco3,攪拌溶解，加入 雙抗(100iu/ml),調(diào)整ph為7.0,定容至1l,用0.22 u m細(xì)菌過濾器過濾除菌，分 裝，并用封口膜封口，4°c保存?zhèn)溆谩?. 取一定量的配制好的dmem培養(yǎng)基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。（-）新生兔細(xì)胞原代培養(yǎng)1. 準(zhǔn)備（1）取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線消毒20分鐘。（2）預(yù)熱培養(yǎng)用液：把己經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、pbs液的瓶子放入37°c水浴鍋內(nèi) 預(yù)熱。2. 取樣（1）處死新生兔，并用75%酒精浸泡1分鐘。（2）

4、移入超凈工作臺(tái)，用含有雙抗的pbs沖洗2遍。（3）用手術(shù)剪剪取所需部位，置于培養(yǎng)皿中，加適量pbs。（要求學(xué)生自己設(shè)計(jì)所要 分離的細(xì)胞種類，如成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞等。）3. 組織細(xì)胞的分離（1）用pbs沖洗實(shí)驗(yàn)材料2次。（2）用眼科剪剪成小塊（2-3mm3）,并pbs沖洗2次。再用dmem培養(yǎng)液沖洗2 次。（3）用3ml dmem培養(yǎng)液懸浮組織塊，并用移液槍轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶。（4）輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使組織塊均勻的鋪于瓶壁，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（瓶口向下），擰緊瓶 蓋，放入二氧化碳培養(yǎng)箱，并擰松瓶蓋。（5）35小吋后，補(bǔ)加2ml培養(yǎng)液，瓶口向上繼續(xù)培養(yǎng)。4. 培養(yǎng)條件37°c、5%二氧化碳、飽和濕度。（三）培養(yǎng)細(xì)胞的增殖及活力測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)24h觀察組織塊貼壁情況，以后每隔48h觀察細(xì)胞形態(tài)，并換液。細(xì)胞 呈現(xiàn)接觸抑制后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力。1. 用移液槍將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基取出，并用預(yù)熱的pbs液洗滌細(xì)胞2遍。2. 加入預(yù)熱的0.25%朕蛋白酶至剛沒過細(xì)胞，放入37°c消化3min,加入6倍體 積的含血清培養(yǎng)基終止消化，并移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，將細(xì)胞移入離心管，loooipm, 離心5min,加2ml預(yù)熱的pbs液懸浮細(xì)胞，即得細(xì)胞懸液。3. 取潔凈的細(xì)胞計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。4. 取適量細(xì)胞懸液加等體積臺(tái)盼藍(lán)，