第一章 基因工程

1、 第一章第一章 基因工程基因工程 基因工程主要內(nèi)容一、基因及基因工程概述基因及基因工程概述二、基因工程理論基礎(chǔ)二、基因工程理論基礎(chǔ)三、三、DNA重組技術(shù)重組技術(shù)u1 DNA重組路線重組路線u2 基因工程中用的酶基因工程中用的酶u3 基因工程載體基因工程載體u4 目的基因的獲得目的基因的獲得u5 重組重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞u6 重組體篩選與鑒定重組體篩選與鑒定u7 目的基因的高效表達(dá)目的基因的高效表達(dá)四、基因工程的應(yīng)用及發(fā)展前景四、基因工程的應(yīng)用及發(fā)展前景第一節(jié)第一節(jié) 基因及基因工程概述基因及基因工程概述1 基因工程的發(fā)展歷程基因工程的發(fā)展歷程2 基因工程的概念基因工程的概念3 基因

2、工程的主要內(nèi)容基因工程的主要內(nèi)容1 基因工程的發(fā)展歷程基因工程的發(fā)展歷程孟德爾定律：生物每一個(gè)性狀都是通過(guò)孟德爾定律：生物每一個(gè)性狀都是通過(guò)遺傳因子遺傳因子來(lái)來(lái)傳遞的，遺傳因子是一些獨(dú)立的遺傳單位。這樣把傳遞的，遺傳因子是一些獨(dú)立的遺傳單位。這樣把可觀察的遺傳性狀和控制它的內(nèi)在的遺傳因子區(qū)分可觀察的遺傳性狀和控制它的內(nèi)在的遺傳因子區(qū)分開來(lái)了，遺傳因子作為基因的雛形名詞誕生了。開來(lái)了，遺傳因子作為基因的雛形名詞誕生了。1903年薩頓和鮑維里兩人注意到在雜交試驗(yàn)中遺傳年薩頓和鮑維里兩人注意到在雜交試驗(yàn)中遺傳因子的行為與減數(shù)分裂和受精中染色體的行為非常因子的行為與減數(shù)分裂和受精中染色體的行為非常吻合

3、，他們作出吻合，他們作出“遺傳因子位于染色體上遺傳因子位于染色體上”的的“薩薩頓頓鮑維里假想鮑維里假想”。1909年丹麥遺傳學(xué)家約翰遜在年丹麥遺傳學(xué)家約翰遜在精密遺傳學(xué)原理精密遺傳學(xué)原理一書中提出一書中提出“基因基因”概念，以此來(lái)替代孟德爾假定概念，以此來(lái)替代孟德爾假定的的“遺傳因子遺傳因子”。從此，。從此，“基因基因”一詞一直伴隨著一詞一直伴隨著遺傳學(xué)發(fā)展至今。遺傳學(xué)發(fā)展至今。1926年摩爾根年摩爾根基因論基因論：基因以直線形式排列基因以直線形式排列，它決，它決定著一個(gè)特定的性狀，而且能發(fā)生突變并隨著染色體同源定著一個(gè)特定的性狀，而且能發(fā)生突變并隨著染色體同源節(jié)段的互換而交換，它不僅是節(jié)段的

4、互換而交換，它不僅是決定性狀決定性狀的功能單位，而且的功能單位，而且是一個(gè)是一個(gè)突變單位和交換單位突變單位和交換單位。1941年比德爾和塔特姆提出年比德爾和塔特姆提出一個(gè)基因一個(gè)酶一個(gè)基因一個(gè)酶學(xué)說(shuō)，證明學(xué)說(shuō)，證明基因通過(guò)它所控制的酶決定著代謝中生化反應(yīng)步驟，進(jìn)而基因通過(guò)它所控制的酶決定著代謝中生化反應(yīng)步驟，進(jìn)而決定生物性狀。決定生物性狀。1949年鮑林與合作者在研究鐮刀型細(xì)胞貧血癥時(shí)推論年鮑林與合作者在研究鐮刀型細(xì)胞貧血癥時(shí)推論基基因決定著多肽鏈的氨基酸順序因決定著多肽鏈的氨基酸順序。1944年艾弗里、麥卡蒂等人發(fā)表了關(guān)于年艾弗里、麥卡蒂等人發(fā)表了關(guān)于“轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子”的的重要論文，首次用

5、實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)：重要論文，首次用實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)：DNADNA是遺傳信息的載體是遺傳信息的載體。1953年年Watson和和 Crick提出了提出了DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。1957年年Benzer以以T4噬菌體作為研究材料分析了噬菌體作為研究材料分析了基因內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，提出了基因內(nèi)部的精細(xì)結(jié)構(gòu)，提出了順?lè)醋訉W(xué)說(shuō)順?lè)醋訉W(xué)說(shuō)。從而。從而認(rèn)為基因?yàn)檎J(rèn)為基因?yàn)镈NA分子上一段核苷酸順序，負(fù)責(zé)著分子上一段核苷酸順序，負(fù)責(zé)著遺傳信息傳遞。遺傳信息傳遞。1967 Nirenberg和和 Khorana等破譯了全部等破譯了全部64個(gè)個(gè)遺傳密碼遺傳密碼。1970年年Temin發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶這一成就進(jìn)

6、一步發(fā)展發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶這一成就進(jìn)一步發(fā)展和完善了和完善了“中心法則中心法則”。1972年年 美國(guó)美國(guó)P.Berg領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成DNA體外重組，獲得了猿猴病毒體外重組，獲得了猿猴病毒SV40和和DNA的的重組雜種重組雜種DNA分子分子1973年，年，S.Cohen等人成功的將外部質(zhì)等人成功的將外部質(zhì)粒基因重組導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，獲得了既?；蛑亟M導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，獲得了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素抗卡那霉素又抗四環(huán)素的菌落的菌落1982年開發(fā)出第一個(gè)年開發(fā)出第一個(gè)基因工程藥物基因工程藥物：胰：胰島素島素基因工程三大理論基礎(chǔ)基因工程三大理論基礎(chǔ)遺傳物質(zhì)是遺傳物質(zhì)是DNADNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的

7、雙螺旋結(jié)構(gòu)遺傳信息傳遞方式：中心法則遺傳信息傳遞方式：中心法則技術(shù)上的三大發(fā)明技術(shù)上的三大發(fā)明工具酶工具酶載體載體逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶2 基因工程的概念基因工程的概念基因工程基因工程的定義：按照人們的愿望對(duì)攜的定義：按照人們的愿望對(duì)攜帶遺傳信息的分子（帶遺傳信息的分子（DNA）進(jìn)行設(shè)計(jì)和）進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造的分子工程，包括基因重組、克隆、改造的分子工程，包括基因重組、克隆、表達(dá)；其核心是構(gòu)建重組表達(dá)；其核心是構(gòu)建重組DNA的技術(shù)。的技術(shù)。（P21）3 基因工程的主要內(nèi)容基因工程的主要內(nèi)容基因工程實(shí)施基因工程實(shí)施4 4個(gè)必要條件個(gè)必要條件： 工具酶工具酶 基因基因 載體載體 受體細(xì)胞受體細(xì)胞帶有目的基因

8、的帶有目的基因的DNA片斷的分離或人工合成片斷的分離或人工合成在體外，將帶有目的基因的在體外，將帶有目的基因的DNA片斷連接到載體片斷連接到載體上，形成重組上，形成重組DNA分子分子重組重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞帶有重組帶有重組DNA分子的細(xì)胞培養(yǎng)，獲得大量的細(xì)胞分子的細(xì)胞培養(yǎng)，獲得大量的細(xì)胞繁殖群體繁殖群體重組體的篩選重組體的篩選重組體中的目的基因的功能表達(dá)重組體中的目的基因的功能表達(dá)基因工程研究的主要內(nèi)容基因工程研究的主要內(nèi)容第二節(jié)第二節(jié) 基因工程理論基礎(chǔ)基因工程理論基礎(chǔ)1.DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制的結(jié)構(gòu)與復(fù)制2.DNA的變性、復(fù)性與雜交的變性、復(fù)性與雜交3.RNA的轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄

9、的轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄4.基因的表達(dá)與調(diào)控基因的表達(dá)與調(diào)控1 DNA的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能1）DNA的分子組成與基本結(jié)構(gòu)的分子組成與基本結(jié)構(gòu)2）DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)3）DNA的復(fù)制的復(fù)制1）DNA的分子組成與基本結(jié)構(gòu)的分子組成與基本結(jié)構(gòu)DNADNA的分子組成與一級(jí)結(jié)構(gòu)的分子組成與一級(jí)結(jié)構(gòu)核酸核酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖（核糖戊糖（核糖或脫氧核糖或脫氧核糖）含氮堿基（嘌呤含氮堿基（嘌呤或嘧啶）或嘧啶）核苷酸核苷酸堿基堿基嘧啶堿嘧啶堿嘌呤堿嘌呤堿核苷：核苷： NC鍵，糖環(huán)上的鍵，糖環(huán)上的C1與嘧啶堿與嘧啶堿 的的N1或與嘌呤堿的或與嘌呤堿的N9相連接相連接（3）核苷酸：戊糖羥基被磷酸化，多是）

10、核苷酸：戊糖羥基被磷酸化，多是5-核苷酸。用堿水核苷酸。用堿水解解RNA，可得到，可得到2-與與3-核糖核苷酸的混合物核糖核苷酸的混合物 脫氧核糖核酸（脫氧核糖核酸（DNA）（1）Chargaff法則法則AT，GC， AGTCDNA的堿基組成具的堿基組成具有種的特異性有種的特異性（2）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，的一級(jí)結(jié)構(gòu)，形成形成3,5-磷酸二酯磷酸二酯鍵鍵DNA雙螺旋模型基本特點(diǎn)雙螺旋模型基本特點(diǎn)兩條反向平行的多核苷兩條反向平行的多核苷酸圍繞同一中心軸相互酸圍繞同一中心軸相互纏繞纏繞嘌呤與堿基位于雙螺旋嘌呤與堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸在外測(cè)的內(nèi)側(cè)，磷酸在外測(cè)雙螺旋的平均直徑為雙螺旋的平均直徑為2nm

11、兩條核苷酸依靠彼此之兩條核苷酸依靠彼此之間形成的氫健相聯(lián)系而間形成的氫健相聯(lián)系而結(jié)合在一起結(jié)合在一起堿基在一條鏈的順序不堿基在一條鏈的順序不受任何限制，但是兩條受任何限制，但是兩條鏈之間互補(bǔ)。鏈之間互補(bǔ)。2）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)3) DNA的復(fù)制的復(fù)制復(fù)制方式：半保留復(fù)制復(fù)制方式：半保留復(fù)制， 復(fù)制的起點(diǎn)和過(guò)程：在特定位點(diǎn)（復(fù)制起始點(diǎn)）開始，在通常情況下，復(fù)制是雙向的和對(duì)稱的，每一條雙鏈鏈都是由一條親鏈和一條子鏈組成，復(fù)制高度忠實(shí)。復(fù)制在起始階段進(jìn)行控制，一旦復(fù)制開始，即繼續(xù)下去，直到整個(gè)復(fù)制子（能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位）完成。DNA復(fù)制過(guò)程（原核生物）復(fù)制過(guò)程（原核生物） DNA復(fù)制叉上進(jìn)

12、行的基本活動(dòng)復(fù)制叉上進(jìn)行的基本活動(dòng)包括包括雙鏈的解開雙鏈的解開RNA引物的合成引物的合成DNA鏈的延長(zhǎng)鏈的延長(zhǎng)切除切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的連接相鄰的DNA片斷片斷切除和修復(fù)滲入切除和修復(fù)滲入DNA的脫氧的脫氧尿苷酸和錯(cuò)配堿基尿苷酸和錯(cuò)配堿基真核生物的真核生物的DNA復(fù)制復(fù)制有許多復(fù)制起點(diǎn)有許多復(fù)制起點(diǎn)在全部復(fù)制完成之前，不再新的復(fù)制在全部復(fù)制完成之前，不再新的復(fù)制首先復(fù)制的是常染色質(zhì)細(xì)胞，然后才是異首先復(fù)制的是常染色質(zhì)細(xì)胞，然后才是異染色質(zhì)染色質(zhì)親代核小體的組蛋白全保留親代核小體的組蛋白全保留 2 DNA2 DNA的變性、復(fù)性與雜交的變性、復(fù)性與雜交核酸的變性、復(fù)性

13、和雜交核酸的變性、復(fù)性和雜交變性：氫鍵斷裂，形成單鏈，不涉及共價(jià)鍵變性：氫鍵斷裂，形成單鏈，不涉及共價(jià)鍵復(fù)性：兩條彼此分開的鏈，重新締合復(fù)性：兩條彼此分開的鏈，重新締合核酸的雜交：異源核酸的雜交：異源DNA之間，或之間，或DNA與與RNA之間會(huì)之間會(huì)形成雜交形成雜交3 RNA的轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄與逆轉(zhuǎn)錄1）RNA的結(jié)構(gòu)2）RNA的轉(zhuǎn)錄3）RNA的逆轉(zhuǎn)錄1 1）RNARNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)核糖核酸核糖核酸（1）主要由腺嘌呤）主要由腺嘌呤(A)、鳥嘌呤、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶、胞嘧啶(C)和尿嘧啶（和尿嘧啶（U）核糖核苷酸組成核糖核苷酸組成 （2）RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)：一級(jí)結(jié)構(gòu)： 形成于形成于3,5-磷酸二酯

14、鍵磷酸二酯鍵單鏈線形分子，只是局部區(qū)域?yàn)殡p螺旋結(jié)構(gòu)單鏈線形分子，只是局部區(qū)域?yàn)殡p螺旋結(jié)構(gòu) （3）RNA類型：類型： 核糖體核糖體RNA，rRNA 5S，5.8S，16S，23S 轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA， tRNA 4S沉降沉降 信使信使RNA，mRNA 變化范圍大變化范圍大 2）RNA的轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶聚合酶 原核生物原核生物 真核生物真核生物在體外，兩條鏈可同時(shí)轉(zhuǎn)錄，在體內(nèi)僅在體外，兩條鏈可同時(shí)轉(zhuǎn)錄，在體內(nèi)僅有一條鏈，或某些區(qū)域以這條鏈轉(zhuǎn)錄，有一條鏈，或某些區(qū)域以這條鏈轉(zhuǎn)錄，另一條區(qū)域以另一條鏈轉(zhuǎn)錄另一條區(qū)域以另一條鏈轉(zhuǎn)錄以完整雙鏈以完整雙鏈DNA為模板，為模板，DNA鏈局部鏈局部解開，轉(zhuǎn)錄后雙鏈仍

15、然保持雙鏈的結(jié)構(gòu)解開，轉(zhuǎn)錄后雙鏈仍然保持雙鏈的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄分為起始、延長(zhǎng)和中止三個(gè)步驟轉(zhuǎn)錄分為起始、延長(zhǎng)和中止三個(gè)步驟合成方向合成方向5 3方向方向3）轉(zhuǎn)錄過(guò)程3）RNA的逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶：研究致癌逆轉(zhuǎn)錄酶：研究致癌RNA病毒過(guò)程中發(fā)現(xiàn)病毒過(guò)程中發(fā)現(xiàn) 屬于多功能酶：屬于多功能酶：以以RNA為模板合成為模板合成DNA鏈，形成雜交分子鏈，形成雜交分子以新合成以新合成DNA為模板合成互補(bǔ)為模板合成互補(bǔ)DNA鏈鏈具有具有3 5和和5 3核酸外切酶作用核酸外切酶作用逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程：致癌逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程：致癌RNA病毒進(jìn)入細(xì)胞病毒進(jìn)入細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈酶合成雙鏈DNA（前病毒）（前病毒）環(huán)化并進(jìn)入細(xì)胞環(huán)化并進(jìn)入細(xì)

16、胞核核整合進(jìn)宿主細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄整合進(jìn)宿主細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄4 基因的表達(dá)與調(diào)控基因的分類和結(jié)構(gòu)基因的分類和結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因：決定某一種蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)相：決定某一種蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)相應(yīng)的一段應(yīng)的一段DNA調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因：帶有阻遇蛋白基因，控制結(jié)構(gòu)：帶有阻遇蛋白基因，控制結(jié)構(gòu)基因活性基因活性操縱基因操縱基因：與阻遇蛋白結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因無(wú)：與阻遇蛋白結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因無(wú)活性，當(dāng)誘導(dǎo)物與阻遇蛋白結(jié)合，操縱活性，當(dāng)誘導(dǎo)物與阻遇蛋白結(jié)合，操縱基因打開控制結(jié)構(gòu)基因的開關(guān)基因打開控制結(jié)構(gòu)基因的開關(guān)操縱子操縱子：細(xì)菌基因的表達(dá)和調(diào)控單位，包括結(jié)：細(xì)菌基因的表達(dá)和調(diào)控單位，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和由調(diào)節(jié)基因所控制的序列。構(gòu)基因

17、、調(diào)節(jié)基因和由調(diào)節(jié)基因所控制的序列。啟動(dòng)子啟動(dòng)子：與：與RNA聚合酶識(shí)別，結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄聚合酶識(shí)別，結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段的一段DNA序列序列中止子中止子：提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的：提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列序列外顯子外顯子：真核基因的編碼區(qū)域：真核基因的編碼區(qū)域內(nèi)含子內(nèi)含子：真核基因中結(jié)構(gòu)基因中的非編碼區(qū)域：真核基因中結(jié)構(gòu)基因中的非編碼區(qū)域原核生物中的基因的表達(dá)和調(diào)控原核生物中的基因的表達(dá)和調(diào)控組成型：組成型：即基因的轉(zhuǎn)即基因的轉(zhuǎn)錄、地點(diǎn)、水平基本錄、地點(diǎn)、水平基本不受發(fā)育階段或組織不受發(fā)育階段或組織特異性的調(diào)控，始終特異性的調(diào)控，始終處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 調(diào)控型：調(diào)控型：低分子量化低分子

18、量化合物與調(diào)控蛋白之間合物與調(diào)控蛋白之間的相互作用，或誘導(dǎo)的相互作用，或誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄，或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，如大腸基因的轉(zhuǎn)錄，如大腸桿菌乳糖操縱子模型桿菌乳糖操縱子模型真核生物中基因的表達(dá)和調(diào)控真核生物中基因的表達(dá)和調(diào)控 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因分布在染色體不同部位，甚功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)基因分布在染色體不同部位，甚至不同的染色體上至不同的染色體上體內(nèi)調(diào)控信號(hào)常來(lái)自體內(nèi)的激素體內(nèi)調(diào)控信號(hào)常來(lái)自體內(nèi)的激素真核生物存在增強(qiáng)子，對(duì)轉(zhuǎn)錄起增強(qiáng)作用，有時(shí)真核生物存在增強(qiáng)子，對(duì)轉(zhuǎn)錄起增強(qiáng)作用，有時(shí)必不可少必不可少 基因翻譯調(diào)控基因翻譯調(diào)控形成正確的二硫鍵形成正確的二硫鍵切割前體

19、切割前體蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)糖基化對(duì)氨基酸的修飾對(duì)氨基酸的修飾第三節(jié)第三節(jié) DNA重組技術(shù)重組技術(shù)1 DNA重組路線重組路線2 基因工程中用的酶基因工程中用的酶3 基因工程載體基因工程載體4 目的基因的獲得目的基因的獲得5 重組重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞6 重組體篩選與鑒定重組體篩選與鑒定7 目的基因的高效表達(dá)目的基因的高效表達(dá)一、一、 DNA重組技術(shù)路線重組技術(shù)路線DNA重組技術(shù)也稱為重組技術(shù)也稱為DNA克隆或分子克克隆或分子克隆或稱為基因克隆隆或稱為基因克隆 就是將就是將DNA 限制性酶切片段插入克隆載體，限制性酶切片段插入克隆載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖，以獲得相同導(dǎo)入宿主細(xì)胞

20、，經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖，以獲得相同的的DNA擴(kuò)增分子擴(kuò)增分子典型典型DNA重組技術(shù)的步驟重組技術(shù)的步驟 分分獲取目的基因和載體獲取目的基因和載體 接接目的基因與載體的連接目的基因與載體的連接 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞 篩篩重組重組DNADNA的篩選與鑒定的篩選與鑒定 檢檢檢測(cè)外源基因是否表達(dá)檢測(cè)外源基因是否表達(dá)P 25421 1、獲取、獲取TTTTAAAA質(zhì)粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoR IEcoR IAATT DNADNA重組基本過(guò)程重組基本過(guò)程432 2、重組、重組TTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT443 3、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)

21、化到宿主細(xì)胞中(如E. coli)宿主細(xì)胞染色體DNA重組質(zhì)粒重組質(zhì)粒454 4、篩選、篩選篩選含有重組質(zhì)粒的菌株宿主細(xì)胞染色體DNA重組質(zhì)粒含有外源DNA的“工程菌”465 5、克隆、克隆含有外源DNA的“工程菌”繁殖/擴(kuò)增476 6、表達(dá)、表達(dá)表 達(dá) 產(chǎn) 物 分 離 純 化表達(dá)產(chǎn)物分離純化表達(dá)產(chǎn)物分離純化二、二、基因工程工具酶基因工程工具酶 基因工程中的工具酶主要是指基因工程中的工具酶主要是指用于用于DNADNA和和RNARNA分子分子的的切割切割、連接連接、聚合聚合、修、修飾、飾、反轉(zhuǎn)錄等反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶有關(guān)的各種酶系系統(tǒng)統(tǒng)。 可分為三類可分為三類分類： 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 連

22、接酶連接酶 修飾酶修飾酶1 1、限制性核酸內(nèi)切酶、限制性核酸內(nèi)切酶(RE)(P26)(RE)(P26) 是一類能專一識(shí)別雙鏈?zhǔn)且活惸軐Ｒ蛔R(shí)別雙鏈DNA中的特定核苷酸序列、中的特定核苷酸序列、并在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下使特定磷酸二酯鍵斷裂，產(chǎn)生并在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下使特定磷酸二酯鍵斷裂，產(chǎn)生3OH或或5P的核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱的核酸內(nèi)切酶，簡(jiǎn)稱限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根據(jù)根據(jù)限制酶的限制酶的作用特性，一般分為三類：作用特性，一般分為三類： 、和和型，型， 其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。 型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn) 1 1）識(shí)別特定的核苷酸序列，識(shí)別位點(diǎn)大多是）識(shí)別特定的核苷

23、酸序列，識(shí)別位點(diǎn)大多是回文回文 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 長(zhǎng)度多為長(zhǎng)度多為4 4 6 6個(gè)個(gè)bpbp 回文序列回文序列 是指該部位的核苷酸序列呈是指該部位的核苷酸序列呈180180O O旋轉(zhuǎn)對(duì)稱旋轉(zhuǎn)對(duì)稱; ; 型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)2 2）具有特定的酶切位點(diǎn)，并產(chǎn)生特定的酶切末端）具有特定的酶切位點(diǎn)，并產(chǎn)生特定的酶切末端主要產(chǎn)生主要產(chǎn)生3 3種缺口：種缺口： 5 5粘性末端粘性末端 3 3粘性末端粘性末端 平端或鈍端平端或鈍端粘性末端粘性末端 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5 5末端突出或末端突出或3 3末端突出的堿基序列相互具有互補(bǔ)性末端突出的堿基序列相互具有互補(bǔ)

24、性。 產(chǎn)生產(chǎn)生5-5-粘性末端粘性末端 產(chǎn)生產(chǎn)生3-3-粘性末端粘性末端-CTGCA-G53G-ACGTC-35-CTGCA-G53G-ACGTC-+Pst I35-G-CTTAA53AATTC-G-35-G-CTTAA53AATTC-G-35+EcoR I 產(chǎn)生平產(chǎn)生平( (頭末頭末) )端端/ /鈍端鈍端5-CCC3-GGGGGG-3CCC-5+Sma I5-CCC3-GGGGGG-3CCC-5 型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)型限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)3 3）IIII限制修飾系統(tǒng)由限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成限制修飾系統(tǒng)由限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成4 4）有些酶來(lái)源不同，但能識(shí)別相同的順序，或產(chǎn)生）有些酶來(lái)源不

25、同，但能識(shí)別相同的順序，或產(chǎn)生相同的末端相同的末端特殊性質(zhì)特殊性質(zhì)的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（異源同工酶異源同工酶）同尾酶同尾酶可變酶可變酶同裂酶同裂酶 又稱異源同工酶。指來(lái)源不同，但具有又稱異源同工酶。指來(lái)源不同，但具有相同的識(shí)相同的識(shí)別別序列序列。 在切割在切割DNADNA時(shí)，其時(shí)，其切割點(diǎn)切割點(diǎn)可以是可以是相同相同的，產(chǎn)生平的，產(chǎn)生平頭末端，稱為頭末端，稱為同識(shí)同切同識(shí)同切； 切割點(diǎn)切割點(diǎn)也可以是也可以是不同不同的，產(chǎn)生的，產(chǎn)生3 3或或5 5粘性末端，粘性末端，稱為稱為同識(shí)異切同識(shí)異切。 同裂酶同裂酶同識(shí)同識(shí)同同切切5-TTT3-AAAAAA-3TTT-5+Aha Dra 5-

26、TTT3-AAAAAA-3TTT-5同裂酶同裂酶同識(shí)同識(shí)異異切切GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+Kpn I5-G3-CCATGGTACC-3G-5+Asp718 I5-3-3-55-3-3-55-3-3-5同同 尾尾 酶酶GCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCCTAG5-3-3-5Mbo BamH Bgl5-3-3-55-A3-TT-3A-5 同尾酶同尾酶 指來(lái)源不同，但識(shí)別與切割順序有一定的相關(guān)指來(lái)源不同，但識(shí)別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類酶。它們作用后性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同產(chǎn)生相同的的粘性粘性末端末端?？勺兠缚勺兠缚勺兠缚勺兠?

27、識(shí)別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，識(shí)別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別順序往往超過(guò)并且識(shí)別順序往往超過(guò)6 6個(gè)堿基對(duì)。個(gè)堿基對(duì)。 如，如， BstBstp p，其識(shí)別順序?yàn)?，其識(shí)別順序?yàn)镚GTNACCGGTNACC。2 2、DNADNA連接酶連接酶(DNA ligase(DNA ligase) ) DNADNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈雙鏈DNADNA中一條鏈的中一條鏈的3 3OHOH與另一條鏈的與另一條鏈的5 5POPO3 3H H2 2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNADNA

28、長(zhǎng)長(zhǎng)鏈。鏈。 DNADNA連接酶的用途連接酶的用途（1 1） 兩個(gè)雙鏈兩個(gè)雙鏈DNADNA片段連接起來(lái)片段連接起來(lái)5 5- ACG AATTCGT-3- ACG AATTCGT-3 T T4 4DNADNA連接酶連接酶 5 5-ACGAATTCGT-3-ACGAATTCGT-33 3- TGCTTAA GCA-5- TGCTTAA GCA-5 3 3-TGCTTAAGCA-5-TGCTTAAGCA-5（2 2） 修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈DNADNA分子分子T4DNA連接連接酶酶3 3、DNADNA聚合酶聚合酶 （最常用的最常用的DNADNA聚合酶有以下聚合酶有以下4 4種種） DN

29、ADNA聚合酶聚合酶 DNA DNA聚合酶聚合酶大片段大片段KlenowKlenow片段片段 T T4 4 噬菌體噬菌體DNADNA聚合酶聚合酶 TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶聚合酶 E.ColiE.Coli DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polDNA pol ） 是一個(gè)具有是一個(gè)具有3 3 種酶活性的多功能性酶。種酶活性的多功能性酶。包括：包括： 5 533DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性 KlenowKlenow片段（片段（DNA polDNA pol I I大片段）大片段

30、） KlenowKlenow片段用途片段用途 補(bǔ)齊雙鏈補(bǔ)齊雙鏈DNADNA的的 3 3末端；末端； 用標(biāo)記堿基補(bǔ)用標(biāo)記堿基補(bǔ) 齊齊3 3末端末端 ； 聚合酶Klenow DNA -32PdNTP雙鏈DNA粘端5-外切酶變性+5335353533555533標(biāo)記探針標(biāo)記末端 在在cDNAcDNA克隆中，克隆中， 用于第二股鏈用于第二股鏈 的合成；的合成； DNA DNA序列分析。序列分析。 T T4 4 噬菌體噬菌體DNA DNA 聚合酶聚合酶 作用作用特點(diǎn)特點(diǎn)1 1） 具有具有5 533DNA DNA 聚合酶活性聚合酶活性 和和3 355核酸核酸外切酶活性外切酶活性，類似，類似DNA polD

31、NA pol I I大片段大片段2 2） 不從單鏈不從單鏈DNADNA模板上置換寡核苷酸鏈模板上置換寡核苷酸鏈 3 3） 最適合用于體外突變反應(yīng)最適合用于體外突變反應(yīng) TaqTaq DNA pol DNA pol（耐熱（耐熱DNADNA聚合酶）聚合酶） 作用作用特點(diǎn)特點(diǎn)1 1） Taq DNA polTaq DNA pol催化催化DNADNA合成的最適溫度范圍合成的最適溫度范圍 70 70 7575，2 2） 9595以上高溫，半小時(shí)不失活，以上高溫，半小時(shí)不失活， 3 3） 最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）。）。 4、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶是一類依賴于逆轉(zhuǎn)

32、錄酶是一類依賴于RNA的的DNA聚合聚合酶酶 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3 3種酶種酶活性：活性： 以單鏈以單鏈RNA RNA 為模板，為模板， 催化合成催化合成DNADNA單鏈單鏈 具有具有RNaseRNase H H 活性，能水解活性，能水解RNA:DNARNA:DNA雜交鏈中的雜交鏈中的 RNARNA 以以DNADNA為模板，催化合成為模板，催化合成cDNAcDNA雙鏈。雙鏈。68 逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用： 將將mRNAmRNA逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNAcDNA，構(gòu)建，構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù)；文庫(kù)； 補(bǔ)平和標(biāo)記補(bǔ)平和

33、標(biāo)記5 5- -末端突出的末端突出的DNADNA片段；片段； 代替代替KlenowKlenow酶用于酶用于DNADNA序列分析；序列分析； 制備雜交探針等。制備雜交探針等。5、堿性磷酸酶、堿性磷酸酶 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(BAP) (BAP) 能夠催化水解去除能夠催化水解去除DNADNA或或RNA5RNA5- -端的磷酸基團(tuán)。端的磷酸基團(tuán)。用途用途 制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 5 5端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。高重組效率。 用用3232P P標(biāo)記標(biāo)記5-5-端前，去除端前，去除5-

34、P5-P，再通過(guò)激酶作用，再通過(guò)激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端進(jìn)行標(biāo)記。端進(jìn)行標(biāo)記。重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 活性活性 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割DNA DNA T4 DNAT4 DNA連接酶連接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸與磷酸與3 3- -羥基羥基 形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA為模板合成為模板合成DNA DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 以以RNARNA為模板合成為模板合成DNA DNA 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 切除末端磷酸切除末端磷酸T4T4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸

35、激酶 催化核酸催化核酸5-5-羥基磷酸化羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 催化催化3-3-端合成同聚體尾端合成同聚體尾四四 基因克隆常用的載體基因克隆常用的載體載體載體(vector)(vector) 是將外源是將外源DNA(DNA(目的目的DNA)DNA)片段引入宿主細(xì)胞片段引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA DNA 。主要內(nèi)容主要內(nèi)容 載體必須具備的基本條件載體必須具備的基本條件 載體的種類載體的種類 常用的載體常用的載體一）載體必須具備的基本條件一）載體必須具備的基本條件 有自身的有自身的復(fù)制子復(fù)制子，能獨(dú)立復(fù)制，能獨(dú)立復(fù)制 具備多個(gè)限制

36、酶的識(shí)別位點(diǎn)具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)( (多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)) ) 具有具有遺傳表型或遺傳表型或篩選篩選標(biāo)記標(biāo)記 有有足夠的容量足夠的容量以容納外源以容納外源DNADNA片段。片段。 表達(dá)型載體表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)啟動(dòng) 子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、終止子子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子、終止子等調(diào)控元件。等調(diào)控元件。 載體載體DNADNA中均有一段中均有一段非必需區(qū)非必需區(qū)，將外源基因插入，將外源基因插入 該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。7. 7. 載體必須安全載體必須安全二）載體的種類二）載體的種類（一）（一） 克隆載體克隆載體

37、以繁殖以繁殖DNADNA為目的的載體為目的的載體 （二）（二）表達(dá)載體表達(dá)載體 用來(lái)將克隆到的外源性基因在宿主細(xì)胞內(nèi)用來(lái)將克隆到的外源性基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成蛋白質(zhì)的載體表達(dá)成蛋白質(zhì)的載體 除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNADNA順序。順序。三）常用的載體三）常用的載體 （一）（一） 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)(plasmid)： 是存在于細(xì)菌染色體外的、是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNADNA分子。分子。 作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)：作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)

38、具備以下特點(diǎn)： 1. 1. 分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)， 有較高的拷貝數(shù)有較高的拷貝數(shù) 2. 2. 具有具有1 1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選 3. 3. 具有多克隆位點(diǎn)具有多克隆位點(diǎn) 總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的較小、高拷貝的“松弛型松弛型”質(zhì)粒，且具有一質(zhì)粒，且具有一個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒： pBR32質(zhì)粒、質(zhì)粒、pUC系列等系列等 pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒（p plasmid BR

39、 構(gòu)建者構(gòu)建者 Boliver 和和 Rodriguez 322實(shí)驗(yàn)標(biāo)號(hào)實(shí)驗(yàn)標(biāo)號(hào) 4361 bp4361 bp 含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)抗氨卞青霉素標(biāo)含一個(gè)抗氨卞青霉素標(biāo) 記記( (ampampR R) ) 一個(gè)抗四環(huán)素標(biāo)記一個(gè)抗四環(huán)素標(biāo)記 ( (tettetR R) ) ampampR R和和tettetR R基因內(nèi)各基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入供外源基因插入 當(dāng)外原基因插入抗藥當(dāng)外原基因插入抗藥基因位點(diǎn)時(shí)，基因位點(diǎn)時(shí)，AmpAmpR RAmpAmp敏敏感感( (AmpAmpS S ) )、TetTetR RTetTet敏敏感感( (TetTe

40、tS S).).pUC系列質(zhì)粒系列質(zhì)粒 由由pBR322pBR322和和M13M13噬菌體構(gòu)噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；（1 1） 2674bp2674bp；（2 2） 有有ampampr r和與和與M13M13噬菌體噬菌體 相同的多克隆位點(diǎn)（相同的多克隆位點(diǎn)（MCSMCS）（3 3）有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌的）有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌的LacZLacZ操縱子的操縱子的DNADNA片段片段, , 編編碼半乳糖苷酶碼半乳糖苷酶 ( (二二) ) 噬菌體載體噬菌體載體 組成特點(diǎn)：組成特點(diǎn)： 雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA分子，分子， 全長(zhǎng)全長(zhǎng)50kb,50kb,含含6565個(gè)基因個(gè)基因

41、左臂、右臂、中央片段左臂、右臂、中央片段 在其分子兩端各含有在其分子兩端各含有1212個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱為的粘性末端，被稱為COSCOS位點(diǎn)。位點(diǎn)。1、 噬菌體噬菌體 噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng)噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng) 溶菌性生長(zhǎng)（溶菌性生長(zhǎng)（lyticlytic pathway pathway） 噬菌體感染細(xì)菌后，借助其噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2 2個(gè)個(gè)COSCOS位點(diǎn)互補(bǔ)位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)成環(huán)，在宿，在宿主菌體內(nèi)主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，顆粒，裂

42、解宿主菌裂解宿主菌，釋放出來(lái)的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。，釋放出來(lái)的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。 溶源性生長(zhǎng)溶源性生長(zhǎng)(lysogenic(lysogenic pathway) pathway) 噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNADNA整合整合到細(xì)菌的染色體到細(xì)菌的染色體中去，與之中去，與之一起復(fù)制一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解解 。 噬菌體兩種生長(zhǎng)途徑（示意圖）噬菌體兩種生長(zhǎng)途徑（示意圖）82噬菌斑噬菌斑832、 COS質(zhì)粒質(zhì)?？滤官|(zhì)粒柯斯質(zhì)粒(cosmid)是人工構(gòu)建的帶有粘性是人工構(gòu)建的帶有粘性末端末端cos的一類質(zhì)粒，其

43、主要組成有的一類質(zhì)粒，其主要組成有:l質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)和抗藥標(biāo)記質(zhì)粒的復(fù)制起始區(qū)和抗藥標(biāo)記、l一種或多種限制酶的一種或多種限制酶的單一切點(diǎn)單一切點(diǎn)lDNA的的COS區(qū)小片段區(qū)小片段(約約20至數(shù)百個(gè)堿基對(duì)至數(shù)百個(gè)堿基對(duì))。 因而這類質(zhì)粒兼具因而這類質(zhì)粒兼具噬菌體和質(zhì)粒的優(yōu)越噬菌體和質(zhì)粒的優(yōu)越性性，又具有高容量的克隆能力，容納外源，又具有高容量的克隆能力，容納外源DNA的長(zhǎng)度可達(dá)的長(zhǎng)度可達(dá)45 kb左右左右 84Cos質(zhì)粒的特點(diǎn)質(zhì)粒的特點(diǎn)第一，具有第一，具有噬菌體的特性。噬菌體的特性。第二，具有質(zhì)粒載體的特性。第二，具有質(zhì)粒載體的特性。第三，具有高容量的克隆能力。第三，具有高容量的克隆能力。第四

44、，具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組第四，具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。的能力。8586（三）其他載體（三）其他載體動(dòng)物病毒動(dòng)物病毒DNA改造的載體改造的載體（如腺病毒，皰疹病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）（如腺病毒，皰疹病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）酵母人工染色體（酵母人工染色體（p32） (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)PAC（P1-Derived artificial chromosome)哺乳動(dòng)物人工染色體哺乳動(dòng)物人工染色體（mammalian artif

45、icial chromosome, MAC)87四）宿主系統(tǒng)四）宿主系統(tǒng)易于接受外源易于接受外源DNA無(wú)限制酶無(wú)限制酶無(wú)重組能力無(wú)重組能力易于生長(zhǎng)和篩選易于生長(zhǎng)和篩選安全安全五、目的基因的獲?。ㄎ濉⒛康幕虻墨@?。ǚ址?）目的基因目的基因 是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克是指所要研究或應(yīng)用的基因，也是需要克隆或表達(dá)的基因。隆或表達(dá)的基因。 目的基因來(lái)源目的基因來(lái)源 1 1） 制備基因組制備基因組DNADNA 2 2） 制備制備cDNAcDNA 3 3） 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) 4 4） 人工合成基因人工合成基因89（一）制備基因組（一）制備基因組DNADNA（基因組（基因組文庫(kù)概念文庫(kù)概

46、念 P34）分離、純化基因組分離、純化基因組DNADNA 條件：條件：溫和，在溫和，在EDTAEDTA或或SDSSDS等存在下等存在下 RERE 用蛋白酶用蛋白酶K K消化細(xì)胞、酚抽提消化細(xì)胞、酚抽提大小不同酶切片段大小不同酶切片段 片段分離：片段分離：常用蔗糖梯度或電泳分離常用蔗糖梯度或電泳分離 分別與同樣分別與同樣RERE消化的載體連接消化的載體連接 常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體常用噬菌體載體或質(zhì)粒載體 DNA DNA連接酶連接。連接酶連接。 導(dǎo)入細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞 進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增。進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)擴(kuò)增。 篩選鑒定篩選鑒定 用分子雜交、凝膠電泳用分子雜交、凝膠電泳 等方法鑒定。等方法鑒定。

47、 90（二）制備（二）制備cDNAcDNA （cDNAcDNA文庫(kù)）文庫(kù)）（1 1）分離細(xì)胞，提取總）分離細(xì)胞，提取總RNARNA（或（或mRNAmRNA）（2 2）合成）合成cDNAcDNA第一條鏈第一條鏈 反應(yīng)體系只有反應(yīng)體系只有mRNAmRNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、4 4種種dNTPdNTP、引物。、引物。 引物引物是寡聚是寡聚dTdT（121218dT18dT片段）片段）cDNA文庫(kù)：細(xì)胞全部文庫(kù)：細(xì)胞全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并被并被克隆的總和?？寺〉目偤?。（3）合成）合成cDNA第二條鏈第二條鏈 RNase H去掉模板去掉模板mRNA，主要方法：，主要方法： 置換合成法置

48、換合成法 引物接頭銜接法引物接頭銜接法（4）構(gòu)建）構(gòu)建cDNA文庫(kù)文庫(kù)cDNA兩端加接頭或銜接頭兩端加接頭或銜接頭接頭接頭是人工合成的雙鏈寡核苷酸兩端平頭，含有限制是人工合成的雙鏈寡核苷酸兩端平頭，含有限制酶切位點(diǎn)。酶切位點(diǎn)。銜接頭銜接頭是另一種人工合成的雙鏈寡核苷酸一端平頭，是另一種人工合成的雙鏈寡核苷酸一端平頭，另一端為粘性末端。另一端為粘性末端。cDNA與載體相連。與載體相連。導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，這些菌體內(nèi)保存導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆，這些菌體內(nèi)保存cDNA集集合體便是合體便是cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。（一）制備（一）制備cDNA （cDNA文庫(kù)）文庫(kù)） 分離目的基因分離目的基因 的的mRNAm

49、RNA逆轉(zhuǎn)錄生成逆轉(zhuǎn)錄生成cDNAcDNA單鏈單鏈 水解去除水解去除mRNAmRNA， 合成合成cDNAcDNA雙鏈雙鏈 水解回折處單鏈水解回折處單鏈得到平端雙鏈得到平端雙鏈cDNAcDNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆, ,構(gòu)建構(gòu)建cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)（三）聚合酶鏈反應(yīng)（三）聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)( PCR) 在模板在模板DNADNA、引物、引物、dNTPdNTP、TaqDNATaqDNA聚合酶等條件下，聚合酶等條件下，體外經(jīng)體外經(jīng)9494變性、變性、5454退火及退火及7272延伸延伸3 3個(gè)步驟的反復(fù)多個(gè)步驟的反復(fù)多次循環(huán)（次循環(huán)（2525 3030次次），擴(kuò)增目的基因），擴(kuò)增目

50、的基因RTRTPCRPCR： 從從mRNAmRNA入手，先反轉(zhuǎn)錄得到入手，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNAcDNA，以此作為模，以此作為模板。板。 95（四）人工合成基因（四）人工合成基因 引用引用DNA測(cè)序儀測(cè)出某一基因的堿基測(cè)序儀測(cè)出某一基因的堿基序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成序列，或根據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸組成反推核苷酸序列，再用反推核苷酸序列，再用DNA合成儀通過(guò)合成儀通過(guò)化學(xué)合成原理合成目的基因。化學(xué)合成原理合成目的基因。 一般先合成短片段一般先合成短片段DNA，然后再拼接成，然后再拼接成長(zhǎng)片段。長(zhǎng)片段。六、重組六、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)） 重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

51、的類型導(dǎo)入宿主細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 以以質(zhì)粒質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 以病毒以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo) 以以噬菌體噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞 用特殊方法處理后，受體細(xì)胞具有易于接受外源用特殊方法處理后，受體細(xì)胞具有易于接受外源DNA的能的能力，力， 這種細(xì)胞稱這種細(xì)胞稱感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞。 感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。感受態(tài)細(xì)胞有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。 七、重組七、重組DNA的篩

52、選與鑒定（的篩選與鑒定（篩篩）（篩選含重組體的陽(yáng)性菌落，一般有下列幾種方法篩選含重組體的陽(yáng)性菌落，一般有下列幾種方法） 1） 平板篩選平板篩選 2）原位雜交技術(shù)）原位雜交技術(shù) 3） PCR篩選重組體篩選重組體 4）限制酶切圖譜篩選）限制酶切圖譜篩選 5）序列測(cè)定）序列測(cè)定 6）免疫法）免疫法插入失活插入失活藍(lán)白篩選藍(lán)白篩選1 平板篩選平板篩選 是指利用載體的是指利用載體的遺傳性標(biāo)記遺傳性標(biāo)記直接篩選的方法。直接篩選的方法。 如，具有如，具有抗藥性標(biāo)記抗藥性標(biāo)記的載體，的載體，（1） 插入失活插入失活 當(dāng)外源當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，

53、轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。培養(yǎng)平板上。 抗生素平板篩選抗生素平板篩選（插入失活插入失活）（2 2）藍(lán)藍(lán)- -白白篩選篩選 利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選含有編碼利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選含有編碼-半乳糖半乳糖苷酶的基因。苷酶的基因。 載體：載體：編碼編碼-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 編碼編碼-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端端序列序列 苷酶苷酶C C端端序列序列 - -互補(bǔ)互補(bǔ)細(xì)菌表達(dá)：細(xì)菌表達(dá)： -半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ X-gal） 形成形成藍(lán)色菌落藍(lán)色

54、菌落 當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源當(dāng)在質(zhì)粒中插入外源DNA-DNA-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活不不能與宿主能與宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端進(jìn)行進(jìn)行-互補(bǔ)互補(bǔ)產(chǎn)生產(chǎn)生白色菌落白色菌落。 （IPTG 存在下）存在下） 藍(lán)藍(lán)白白篩選篩選示意圖示意圖1021032. 核酸雜交篩選核酸雜交篩選3. PCR3. PCR篩選重組體篩選重組體 抽提少量重組抽提少量重組DNADNAPCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增電泳鑒定電泳鑒定4 4、 序列測(cè)定序列測(cè)定通過(guò)核酸測(cè)序，來(lái)確定外源基因準(zhǔn)確性通過(guò)核酸測(cè)序，來(lái)確定外源基因準(zhǔn)確性1055、免疫法、免疫法106顯色或顯影ProteinProteinBlockin

55、g AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme (E)sssssPPPP Substrate6. 6. 限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定限制性內(nèi)切酶圖譜鑒定 八、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控八、重組體在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控 基因工程的最終目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)牖蚬こ痰淖罱K目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白合適的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。質(zhì)產(chǎn)品。109需要考慮的幾個(gè)問(wèn)題：需要考慮的幾個(gè)問(wèn)題：?jiǎn)?dòng)子和終止子啟動(dòng)子和終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)核

56、糖體結(jié)合位點(diǎn)基因的拷貝數(shù)和基因的定位基因的拷貝數(shù)和基因的定位合成外源基因的定位合成外源基因的定位宿主的翻譯效率宿主的翻譯效率外源蛋白在宿主中的穩(wěn)定性外源蛋白在宿主中的穩(wěn)定性110非融合蛋白與融合蛋白非融合蛋白與融合蛋白非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白非融合蛋白：指所表達(dá)的外源蛋白N端不端不含有任何其他的氨基酸含有任何其他的氨基酸融合蛋白：蛋白質(zhì)或多肽的融合蛋白：蛋白質(zhì)或多肽的N-末端由原末端由原核核DNA編碼編碼,C-末端由克隆的真核末端由克隆的真核DNA編編碼碼,這樣表達(dá)的蛋白質(zhì)由原核多肽和真核這樣表達(dá)的蛋白質(zhì)由原核多肽和真核蛋白連接在一起蛋白連接在一起,稱稱融合蛋白融合蛋白 第四節(jié)第四節(jié) 重

57、組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)一、疾病基因的發(fā)現(xiàn) 19901990年年美國(guó)科學(xué)家首先啟動(dòng)美國(guó)科學(xué)家首先啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃人類基因組計(jì)劃（HGPHGP），），計(jì)劃歷時(shí)計(jì)劃歷時(shí)1515年，至年，至20052005年完成；年完成； 20012001年年2 2月月1212日日由由SinceSince和和NatureNature雜志同時(shí)向世界雜志同時(shí)向世界宣布，人類基因組宣布，人類基因組3X103X109 9bpbp的最新圖譜，約含的最新圖譜，約含3 3 4 4萬(wàn)個(gè)萬(wàn)個(gè)基因；基因； 整個(gè)人類基因組的全部核苷酸序列不久即將完成。整個(gè)人類基因組的全部核苷酸

58、序列不久即將完成。但要揭示人類但要揭示人類4 4萬(wàn)個(gè)基因功能的任務(wù)將更為艱巨。萬(wàn)個(gè)基因功能的任務(wù)將更為艱巨。 人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因人類基因組圖譜的初步完成，不僅為全部基因的定位建立了一個(gè)開放框架，而且為分離、鑒定人的定位建立了一個(gè)開放框架，而且為分離、鑒定人類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。類疾病相關(guān)基因提供了參照模板。 如，已知如，已知人類遺傳性疾病約有人類遺傳性疾病約有30003000種種，推測(cè)可，推測(cè)可能是由于能是由于某些基因結(jié)構(gòu)異?；蚧蛭灰频韧蛔兯履承┗蚪Y(jié)構(gòu)異常或基因位移等突變所致。 產(chǎn)品名稱產(chǎn)品名稱 治療功能與醫(yī)藥范圍治療功能與醫(yī)藥范圍 1. 1. 人胰島素人胰

59、島素 治療糖尿病治療糖尿病 2. 2. 人生長(zhǎng)激素人生長(zhǎng)激素 治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合治療侏儒癥，加速創(chuàng)口愈合 3. 3. 干擾素干擾素 治療癌癥、病毒感染治療癌癥、病毒感染 4. 4. 干擾素干擾素 治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎治療帶狀皰疹，眼結(jié)、角膜炎 5. 5. 干擾素干擾素 治療癌癥、病毒感染治療癌癥、病毒感染 6. 6. 人組織纖溶酶原激活因子人組織纖溶酶原激活因子(tPA(tPA) ) 溶解血栓，治療急性心肌梗塞溶解血栓，治療急性心肌梗塞 7. 7. 紅細(xì)胞生成素紅細(xì)胞生成素 (Epo(Epo) ) 治療腎病性貧血，增加紅細(xì)胞及血色素水平治療腎病性貧血，增加紅細(xì)胞及血色素水平 8.

60、8. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 清除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死清除超氧化物，治療關(guān)節(jié)炎，緩解心肌壞死 9. 9. 凝血因子凝血因子 治療治療A A型血友病型血友病 10. 10. 乙型肝炎疫苗乙型肝炎疫苗 防治肝炎防治肝炎 11. 11. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子神經(jīng)生長(zhǎng)因子 維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化維持神經(jīng)元細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分化 12. 12. 腦啡膚腦啡膚 鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)痛 13. 13. 降鈣素降鈣素 治療骨質(zhì)疏松癥治療骨質(zhì)疏松癥二、二、 生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì) 基因工程生產(chǎn)胰島素的原理（示意圖）基因工程生產(chǎn)胰島素的原理（示意圖） 三、制備基因工程疫苗三、制備