開題報告---馬麗娟(共13頁)

1、 研究生學(xué)位論文開題報告學(xué) 號：20110194姓 名：馬麗娟導(dǎo)師姓名：黃永清研究方向： .口腔頜面外科論文題目：MAFB基因多態(tài)性在寧夏人群中與非綜合征型唇腭裂的相關(guān)性研究院（系）：口腔醫(yī)學(xué)院入學(xué)時間：2011年 9月 5日開題時間： 2012年12月18日 二 一二 年 十二 月 十八 日一、立論依據(jù)（包括研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻(xiàn)及出處）1、選題背景 唇腭裂是人類最常見的一種出生缺陷,其發(fā)病率在1/5001/1000之間, 不同種族和地域發(fā)病率有很大差異1, 其中美洲印第安人與亞洲人的發(fā)病率最高，約1/500 2，高加索人居中，約1/10 00 ，非洲人最低，約1/2

2、 50 0 ，我國發(fā)病率為1.82/10003,在我國出生缺陷的發(fā)生率中占第一位或第二位, 在寧夏2007年嬰兒出生缺陷的發(fā)生率中占第一位4，發(fā)病率為2.19/1000。 唇腭裂患者不僅存在外形上的缺陷，其飲食、語言等功能也伴有不同程度的障礙，常常造成性格缺陷，影響正常的社會交往，降低生活質(zhì)量，又因其治療程序復(fù)雜、周期漫長、花費大，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響了出生人口素質(zhì)，因此尋找該病的病因, 進(jìn)而找到有效的預(yù)防手段顯得非常重要。 根據(jù)全身是否伴發(fā)其他畸形,唇腭裂可以分為非綜合征型唇裂伴或不伴腭裂 ( non-syndromic cleft lip with or without cl

3、eft palate, NSCL/P)和綜合征型唇腭裂。大約有20%的唇腭裂與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的400多種綜合征有關(guān),這些綜合征基本符合孟德爾單基因病遺傳模式。大量研究表明NSCL/P 病因是多因素的，可能由某些遺傳易感因子和環(huán)境危險因子暴露所引起5-7。Ardinger 等8 報道了第1個唇腭裂關(guān)聯(lián)基因TGF-，至今已有20 余年。隨著人類單倍型圖譜的完成，單核苷酸多態(tài)性( sin2gle nucleotide polymorphism, SNP), 即單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性, 因其數(shù)量眾多和易檢測性,成為新的第三代遺傳標(biāo)記。SNPs被認(rèn)為是最重要的人類基因組變異形式,人類基因組中

4、至少存在1千萬個SNPs，平均每300個核苷酸內(nèi)就有一個SNP,是造成正常表型個體間差異的主要原因9。 很多涉及NSCL/P 遺傳學(xué)病因的候選基因分子流行病學(xué)研究重復(fù)性很差，表明NSCL/P 是一種具有復(fù)雜遺傳異質(zhì)性病因的疾病。所以，在相對單一遺傳學(xué)背景的人群中去驗證GWAS 研究結(jié)果，對于鑒定該人群特有的NSCL/P 易感基因十分必要,目前基因的篩選、定位以及研究分析方法仍然是NSCL/P病因?qū)W的研究難點和熱點 。 2.國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 人類對基因組變異的認(rèn)識也在逐步深入。1986年,人類基因組的第一個完整的限制性片段長度多態(tài) (restriction fragment length poly

5、morphism, RFLP)圖譜繪制完成,這是人類的第一張分子遺傳圖譜,標(biāo)志著人類疾病發(fā)生機(jī)制的遺傳學(xué)研究進(jìn)入了一個新的階段。而后, 微衛(wèi)星位點(short tandem repeat, STR)代替了RFLP。此時, 基于家系連鎖分析的疾病遺傳學(xué)機(jī)制研究占據(jù)了統(tǒng)治地位。1996年, Risch和Merikangas指出, 通過對一般人群進(jìn)行病例-對照研究,即關(guān)聯(lián)分析,對捕獲變異基因具有更高的效力，因而提出了構(gòu)建人類基因所有變異圖譜的全球計劃,人類單倍型圖譜計劃得以啟動 目前各種遺傳連鎖和關(guān)聯(lián)研究，包括全基因組關(guān)聯(lián)分析（genomewideassociation study， GWAS）報道

6、了越來越多的候選基因和染色體區(qū)域，如IRF6、FOXE1、BCL3、MYH9、SUMO1、MSX1 和染色體1p22、8q24、10q25、17q22、20q12 等10-14。 2010年Terri H Beaty 等15在多個人群（包括歐洲，亞洲和中國人群）的多中心合作的1965個核心家系樣本的GWAS（Illumina HumanHap550 BeadChip）研究也證實了IRF6基因和8q24.21區(qū)段與NSCL/P致病有很強(qiáng)相關(guān)性。同時還得出了MAFB和ABCA4兩個基因與NSCL/P致病有很強(qiáng)相關(guān)性。MAFB基因又稱為KRML基因，位于20q12，編碼亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，此因子不僅

7、在紅細(xì)胞系的生成調(diào)節(jié)過程中扮演者重要的作用，還作為引起巨噬細(xì)胞活化因子表達(dá)骨髓瘤細(xì)胞的癌基因16.17。動物實驗同樣表明MAFB 基因可能參與鼠的顱面外胚層發(fā)育。Beaty 等18 的原位雜交實驗檢測到MAFB 基因的mRNA 和蛋白質(zhì)信號在孕13.5 14.5 d 胚鼠顎板上皮細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)，推測其可能參與了顎板融合過程。假設(shè)某些個體存在由SNP 介導(dǎo)的MAFB 基因單倍不足，則可能導(dǎo)致顎板融合障礙，進(jìn)而導(dǎo)致NSCL/P 發(fā)生。GWAS掃描發(fā)現(xiàn)在MAFB整個基因內(nèi)或其附近的237個SNP中有6個SNP（rs6072081，rs6065259，rs17820943，rs13041247，rs116

8、96257，rs6102085）達(dá)到了統(tǒng)計學(xué)意義（ p<5*10.8）。rs13041247在MAFB基因的下游區(qū)，外顯子測序發(fā)現(xiàn)了一個錯義突變H131Q,其影響了蛋白結(jié)構(gòu)功能15 Yuan 等19 在拉丁美洲人群重復(fù)源GWAS 研究中也證實了另外2 個與rs17820943 存在強(qiáng)連鎖的位點rs11696257 和rs13041247，與NSCL/P 存在陽性關(guān)聯(lián)。2011年5月何運輔研究發(fā)現(xiàn)華南漢族人群中MAFB SNPs rs6072081 、rs1 78 20943 和rs6102085 以及IRF6 SNP rs10863790 與NSCL/P的發(fā)病有顯著關(guān)聯(lián)。這些研究結(jié)果均表

9、明MAFB 基因是一個可靠的NSCL/P候選基因。 ：我國的人口基數(shù)大，唇腭裂患者數(shù)量也多，這既是一個有利于研究的條件，也是一個需要解決的問題。隨著現(xiàn)在微觀領(lǐng)域技術(shù)的不斷進(jìn)步，NSCL/P的基因研究已經(jīng)取得了一定的成果，目前的易感基因一個個被證實，并且新的易感基因也在不斷被發(fā)現(xiàn)，所以在國內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)、學(xué)者都致力于這方面的研究，由于唇腭裂病因的復(fù)雜性、遺傳模式的不確定性、不同地區(qū)甚至不同表型NSCL/P的候選基因座差異性，使研究結(jié)果重復(fù)性差，出現(xiàn)較多分歧，有的甚至出現(xiàn)背離。這仍是一個亟待解決的問題本研究旨在了解中國寧夏地區(qū)回漢族人群中MAFB（rs6072081.rs6065259.rs1782

10、0943.rs11696257）與NSCL/P的相關(guān)性，探討在寧夏地區(qū)回漢族人群中NSCL/P 發(fā)病的可能作用，同時也為寧夏地區(qū)人群基因數(shù)據(jù)庫積累資料，不斷完善和發(fā)展其在唇腭裂發(fā)病機(jī)制，為臨床基因診斷提供理論依據(jù)，以及為唇腭裂的產(chǎn)前診斷和預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)，對有唇腭裂病人的家庭提供有效遺傳咨詢，最終達(dá)到降低唇腭裂發(fā)生率的目的。 參考文獻(xiàn) 1.Harville ,E.W.,Wilcox ,A.J.,Lie ,R.T.,etal.,Epidemiology of cleft pa late alone and cleft palate with accompanying defects .Eur J

11、E pidemiol ,2007 .22 (6):p.38 9-95 2.Cooper,M.E.,Ratay J.S.and Marazita M.L.,Asianral-facialcleftbir th prevalence.Cleft Palate Craniofac J,2006.43(5):p.580-9.3黃洪章.唇腭裂病因?qū)W研究的新進(jìn)展.口腔頜面外科雜志, 2007, 17 (3) : 201 - 204.4 Zhou Hou-De LiXiao-Ling Li Gui-Yuan. The reasearch development of Single nucleotide po

12、lymorphism. Foreign Med Sci Pathophysial Clin Med ，2003，23(5):4444475 Vieira AR. Unraveling human cleft lip and palate research. J Dent Res,2008, 87(2): 119-125.6 Murray CJ. Gene/environment causes of cleft lip and/or palate. ClinGenet, 2002, 61(4): 248-256.7 Dixon MJ, Marazita ML, Beaty TH, et al.

13、Cleft lip and palate: understandinggenetic and environmental infl uences. Nat Rev Genet, 2011,12(3): 167-178.（可續(xù)頁） 8 Ardinger HH, Buetow KH, Bell GI, et al. Association of genetic variation of the transforming growth factor-alpha gene with cleft lip and palate. Am J Hum Genet, 1989, 45(3): 348-353.9

14、.Lander ES, Linton LM, Birren B, et al.Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409(6822): 860921. 10 Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, et al. Interferon regulatory factor6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate. NEngl J Med, 2004, 351(8): 769-780

15、.11 Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, et al. Key susceptibility locus fornonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24. Nat Genet, 2009, 41(4): 473-477.12 Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, et al. Genome-wide association study identifi es two susceptibility loci for nonsyndro

16、mic cleft lip with or without cleft palate. Nat Genet, 2010, 42(1): 24-26.13 Alkuraya FS, Saadi I, Lund JJ, et al. SUMO1 haploinsuffi ciency leads tocleft lip and palate. Science, 2006, 313(5794): 1751.14 Mangold E, Ludwig KU, Nöthen MM. Breakthroughs in the genetics oforofacial clefting. Trend

17、s Mol Med, 2011, 17(12): 725-733.15 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4. Nat Genet. 2010,42(6): 525529.16Gemelli C, Montanari M, Tenedini E, Zanocco Marani T, Vignudelli T, Si

18、enaM, Zini R, Salati S, Tagliaco E,Manfredini R, Grande A, Ferrari S. Virally mediated MafB transduction induces the monocyte commitment of human CD34þ hematopoietic stem/progenitor cells. Cell Death Differ 2006. 13:16861696.19. Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, B

19、ast BJ. Identication of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2009. 37:7886.17 Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, Neri A, Clevers HC, Bast BJ. Identication of primaryMAFB target genes inmultiplemyeloma. Exp Hematol 2009. 37:7886.18 Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al.

20、 A genome-wide associationstudy of cleft lip with and without cleft palate identifi es risk variantsnear MAFB and ABCA4. Nat Genet, 2010, 42(6): 525-529. 19 Yuan Q, Blanton SH, Hecht JT. Association of ABCA4 and MAFB withnon-syndromic cleft lip with or without cleft palate. Am J Med GenetA, 2011, 15

21、5A(6): 1469-1471.二、研究方案1、研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題一）、研究內(nèi)容：(1)標(biāo)本收集收集300個寧夏地區(qū)非綜合征型唇腭裂(NSCLP)核心家系【包括大家系和3人核心家系（雙親和患者）】以及300名匹配的正常對照組。按知情同意的原則，填寫知情同意書，簽字。并詳細(xì)填寫唇腭裂遺傳流行病學(xué)研究問卷及臨床檢查表。標(biāo)本來自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院以及寧夏各地方的協(xié)作醫(yī)院。(2)進(jìn)行SNPs位點篩選。(3)對已經(jīng)確定的候選基因SNPs位點進(jìn)行基因分型，應(yīng)用病例對照和傳遞不平衡檢驗（transmitted disquilibrium test,TDT）的方法，研究確定的SNPs位點

22、等位基因和單倍型與NSCL/P的相關(guān)性。二）、研究目標(biāo)：通過應(yīng)用病例對照研究和傳遞不平衡檢驗（TDT），比較候選基因SNPs位點等位基因頻率的顯著性差異，以進(jìn)一步證實和精確定位與寧夏地區(qū)NSCL/P有相關(guān)性的SNPs位點，并計算有意義SNPs位點對寧夏地區(qū)人群NSCL/P發(fā)病的貢獻(xiàn)率，發(fā)現(xiàn)寧夏地區(qū)回漢族人群中這些位點與NSCL/P的相關(guān)性，同時也為寧夏地區(qū)人群基因數(shù)據(jù)庫積累資料，不斷完善和發(fā)展其在唇腭裂發(fā)病機(jī)制，為臨床基因診斷提供理論依據(jù)。三）、擬解決的關(guān)鍵問題：（1）樣本的收集【包括大家系和3人核心家系】及問卷表填寫的認(rèn)真和完善是本研究的根本保證。（2）候選基因有意義SNPs位點的篩選以及基

23、因分型方法的選擇和結(jié)果的可靠性。（3）TaqMan SNP基因分型技術(shù)的學(xué)習(xí)及掌握。（4）用于遺傳統(tǒng)計學(xué)分析的軟件及其正確的應(yīng)用。2、擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析（1）標(biāo)本的采集：按知情同意的原則，填寫知情同意書，簽字。詳細(xì)填寫唇腭裂遺傳流行病學(xué)研究問卷及臨床檢查表。采集外周靜脈血5ml,加EDTA抗凝劑，20°C保存?zhèn)溆谩ＥR床鑒別綜合征型唇腭裂（SCL/P）和非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）病例。并進(jìn)行常規(guī)項目的統(tǒng)計、分析，如：NSCL/P類型、性別、年齡，民族及母親懷孕起始三個月吸煙（分為主動和被動吸煙）、飲酒，維生素補(bǔ)充及使用藥物史等流行病學(xué)資料。病例組納入

24、標(biāo)準(zhǔn) 患兒為先天性非綜合征型唇腭裂。 患兒不伴有其他系統(tǒng)器官的先天性畸形。 患兒家庭無其他遺傳病家族史。 患兒雙親精神正常，能接受調(diào)查者。 患兒雙親須是患兒生物學(xué)父母。 患兒父母家庭至少三代為寧夏籍貫。 對照組納入標(biāo)準(zhǔn)健康兒童不伴有系統(tǒng)器官的先天性畸形和疾病。 健康兒童家庭無遺傳病家族史。 健康兒童雙親精神正常，能接受調(diào)查者。 健康兒童雙親須是患兒生物學(xué)父母。 。 健康兒童父母家庭至少三代為寧夏籍貫。（2）樣本基因組DNA的提?。篋NA試劑盒提取法（原理為苯酚抽提法）。抽提好的DNA樣本用紫外吸收法測定DNA的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)加以確認(rèn)，并將樣品稀釋至20ng/l， -20

25、6;C冰箱儲存?zhèn)溆?。?）應(yīng)用Primer 5.0軟件對候選SNPs位點的引物、內(nèi)切酶的設(shè)計。（4）應(yīng)用TaqMan SNP基因分型技術(shù)進(jìn)行基因分型。（5）挑選10%的分型結(jié)果直接測序，驗證基因型的正確率。（6）統(tǒng)計學(xué)方法Hard一Weinberg Equilibrium (H一W平衡分析)：指在一個隨機(jī)婚配的群體中，各基因頻率和等位基因頻率將保持不變。如p和q分別代表一對等位基因頻率，由這兩個等位基因構(gòu)成的基因頻率將符合二項分布。候選基因各位點分析前提是基因分型數(shù)據(jù)必須符合Hardy-Weinber平衡，不符合的將剔除于后分析CASE-CONTROL Comparison（病例對照比較）：根

26、據(jù)基因型分別計算病例組和對照組間等位基因頻率，采用卡方檢驗。Transmission-Disequilibrium Testing：（傳遞不平衡檢驗）主要針對的是家系樣本的分析，可以用來檢查家系分型的錯誤，相當(dāng)于UNPHASED中的pdtphase模塊。該軟件的優(yōu)點是可以計算特別小數(shù)目的家系，可以靈活設(shè)定遺傳的模式種類。HaPlotyPe Association （單倍型分析）：單倍型是同一條染色體上緊密相連的兩個或兩個以上多態(tài)位點的狀態(tài)組合。以單倍型為基礎(chǔ)的分析可以提供更多的信息量。每個等位基因或者突變與一個特殊的歷史進(jìn)化有關(guān)，這樣將有一個獨特的染色體背景或者單倍型。與單個位點分型比較，單倍

27、型分析更有力度。Linkage Disequilibrium calculation,LD(連鎖不平衡檢驗)技術(shù)路線圖標(biāo)本的收集基因組DNA的抽取目標(biāo)序列的常規(guī)PCT擴(kuò)增直接測序驗證分型TaqManSNP基因分型病例-對照研究 TDT LD 單倍型及歸因危險度的分析檢驗NSCL/P與SNPs的相關(guān)性3本課題的創(chuàng)新之處 首次將本課題所選的4個位點rs6072081.rs6065259.rs17820943.rs11696257（1q20），在寧夏地區(qū)回漢人群中進(jìn)行大樣本三人核心家系的NSCL/P相關(guān)研究，國內(nèi)有關(guān)NSCL/P的發(fā)病與以上四個位點多態(tài)性的相關(guān)性并未有清楚的研究。4、研究計劃及預(yù)測進(jìn)展（1）第一階段 2012年5月2012年12月：收集寧夏地區(qū)回漢族病例組NSCL/P核心家系【包括大家系和3人核心家系（患者和雙親）】以及同期匹配的正常對照組標(biāo)本；并認(rèn)真填寫唇腭裂遺傳流行病學(xué)研究問卷及臨床檢查表。同時盡快成批抽提基因組DNA，詳細(xì)登記編號，-20儲存?zhèn)溆?。進(jìn)行SNPs位點篩選，在導(dǎo)師幫助下獲得最新國外相關(guān)文獻(xiàn)資料，包括網(wǎng)絡(luò)資源的利用，最終確定rs6072081.rs6065259.rs17820943.rs11696257（1q20）多態(tài)位點。 對已經(jīng)確定的候選基因SNPs位點進(jìn)行基因分型預(yù)實驗，以確定基因分型方法的選擇