OX-LDL對內(nèi)毒素作用的影響及其機(jī)制(1)

1、第三軍醫(yī)大學(xué) 碩t學(xué)位論文ox- ldl對內(nèi)毒素作用的影響及其機(jī)制 姓名±洪愉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷指導(dǎo)教師：鄒全明20031101ox-ldl對內(nèi)毒素作用的影響及其機(jī)制摘 要現(xiàn)有研究表明，內(nèi)毒素血癥是導(dǎo)致嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷患者發(fā)生全身性炎癥反應(yīng)綜合 征(sirs)及多器官功能障礙綜合征(mods)等病理生理過程的重要原因之一，因此，深 入研究內(nèi)毒素血癥的致病機(jī)制有重要的臨床意義。有體外研究報道，氧化型低密度脂 蛋白(ox-ldl)能調(diào)節(jié)細(xì)胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)性，但內(nèi)毒素血癥時體內(nèi)ox-ldl生成情 況如何、ox-ldl能否調(diào)節(jié)機(jī)體對lps的反應(yīng)性、其調(diào)節(jié)機(jī)制怎樣等目前尚未見有

2、報 道。為此，本實(shí)驗(yàn)從以下三個方而進(jìn)行研宂：1.觀察內(nèi)毒素血癥時小鼠血漿ox-ldl 水平的變化；2.在體觀察ox-ldl預(yù)處理對小鼠一lps反應(yīng)性的影響；3.體外觀察 ox-ldl預(yù)處理對肺泡巨噬細(xì)胞一lps反應(yīng)的影響及其機(jī)制。旨在通過以上研究，深 化對內(nèi)毒素血癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為尋找防治內(nèi)毒素血癥的奮效措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要結(jié)果如t:1. 內(nèi)毒素血癥時小鼠血漿ox-ldl含量明顯增加。lps注射后0.58h，各劑量組 ox-ldl水平呈內(nèi)毒素劑量依賴的方式升高，ii內(nèi)毒素劑量越大，ox-ldl達(dá)峰時間 越早。2. ox-ldl預(yù)處理能增加內(nèi)毒素血癥小鼠肝、肺組織及血漿tnf水平。lps注

3、射后肝、肺組織及血漿中tnf增高，ox-ldl預(yù)處理復(fù)合lps注射小鼠肝、肺組 織及血漿中tnf水平高于lps單純注射組同吋相點(diǎn)。3. lps注射可致小鼠肝臟發(fā)生病理損害，ox-ldl預(yù)處理復(fù)合lps注射可加重 肝臟的病理改變。4. ox-ldl預(yù)處理能增加內(nèi)毒素血癥小鼠死亡率。不同劑量ox-ldl預(yù)處理對動 物死亡率的增加無統(tǒng)計學(xué)差異。5. ox-ldl預(yù)處理能增強(qiáng)lps誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生tnf的作用，其增強(qiáng) 作用與抗s r抗體2f8預(yù)處理組相同，抗cd14抗體預(yù)處理則能阻斷這種增強(qiáng)作用。結(jié)論.1. 內(nèi)毒素血癥時小鼠體內(nèi)ox-ldl生成急劇增加，增加程度內(nèi)毒素與劑量呈明顯 的量效關(guān)系。

4、2. ox-ldl能堉敏小鼠對內(nèi)毒素的反應(yīng)，導(dǎo)致肝、肺組織及血漿屮tnf水平顯著升高，死亡率明顯上升。3. ox-ldl增敏小鼠對內(nèi)毒素反應(yīng)性的機(jī)制與其拮抗清道夫受體清除內(nèi)毒素，增 加內(nèi)毒素與cd14結(jié)合，進(jìn)而增強(qiáng)其激活作用有關(guān)。關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素，氧化型低密度脂蛋白，清道夫受體，cd14effect of oxidized low density lipoprotein on lpsresponse and its mechanismabstractrecent researches have indicated that endotoxemia is a major reason for th

5、e development of systemic inflammatory response syndrome(sirs) and multiple organ dysfunction syndrome(mods) in severe infections and trauma patients，therefore it is very important to further explore the pathogenesis of endotoxemia. some in vitro experiments reported that oxidized low density lipopr

6、otein(ox-ldl) can regulate the cellular response to lipopolysaccharide (lps),but how about the production of ox-ldl in endotoxemia, whether ox-ldl can regulate the cellular response to lps，and，what is its mechanism，all the problems have not been reported. this study was performed as the following th

7、ree aspects: 1 .to investigate the change of ox-ldl in endotoxemia mice. 2.to observe the effect of ox-ldl on response of mice to lps. 3. to study the effect of ox-ldl on alveolar macrophage response to lps and its mechanism. these studys may be helpful for improving the knowledge about pathogenesis

8、 ofendotoxemia and putting forwardeffective methods for the prevention and therapy of endotoxemia.the main results are as follows:1. the mice plasma ox-ldl increases significantly after lps injection，which is in dose dependent manner from 30 minutes to 8 hours after lps injection, and，the higher the

9、 lps dosage is，the more quickly the increasing of plasma ox-ldl is.2. t n f (?levels in the liver，lung，and plasma of mice increase after lps injection. pretreatment of ox-ldl can increase t n f ？levels in the liver，lung，and plasma of endotoxemia mice, which are higher than that of the lps injected m

10、ice at the same points.3. lps injection results in histological damages of mice liver and ox-ldl pretreatment can aggravate these damages.4. ox-ldl pretreatment can increase the mortality of endotoxemia mice，and different dosage of ox-ldl pretreatment has no effect on the increasing of mortality.5.

11、ox-ldl pretreatment also can increase t n f ？production of the mice alveolar macrophages induced by lps，which is the same of that of the group pretreated with 2f8，monoclonal antibody of sr，while pretreatment with antibody of cd 14 can block this effect.conclusions:1. the production of ox-ldl in endo

12、toxemia mice increases sharply and the increasing extent represents a dose dependent manner.2. ox-ldl can strengthen the response of mice to lps，aggravate inflammatory response and increase the mortality of endotoxemia mice.3. the mechanism that ox-ldl strengthens the response of mice to lps is due

13、to the blockage of the scavenger receptor.key words: lipopolysaccharide，oxidized low density lipoprotein，scavenger receptor，cd 14.英文縮寫一覽表英文縮寫英文全稱中文全稱cdcluster of differentiation白細(xì)胞分化抗原mcd14membrane cd 14膜結(jié)合cd14srscavenger receptor清道夫受體lpslipopolysaccharide脂多糖tnf-atumor necrosis factor a腫瘤壞死因子ailsint

14、erleukins白細(xì)胞介素amalveolar macrophages肺泡巨噬細(xì)胞m（）macrophage巨噬細(xì)胞sirssystemic inflammatory response syndrome全身炎癥反應(yīng)綜合征modsmultiple organ dysfunction syndrome多器官功能不全綜合征ox-ldloxidized low density lipoprotein氧化低密度脂蛋內(nèi)ac-ldlacetyled low density lipoprotein乙?；兔芏戎鞍譮bsfetal bovine serum胎牛血清sepsissepsis膿毒癥ox-ldl對

15、內(nèi)毒素作用的影響及其機(jī)制刖 a內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，lps)是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要毒性成份，能介異多種 炎癥介質(zhì)的釋放，現(xiàn)有研究表明，內(nèi)毒素血癥是導(dǎo)致嚴(yán)重感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷患者發(fā)生全 身性炎癥反應(yīng)練合征(systemic inflammatory response syndrome, sirs)及多臟器功能障 礙線合征(multiple organ dysfunction syndrome, mods)等病理改變的重要原因之一。因此，深入研究內(nèi)毒素血癥的致病機(jī)制有重要的臨床意義。低密度脂蛋o(low density lipoprotein，ldl)是一類存在于正常血液循環(huán)中

16、、對維 持機(jī)體多種生理機(jī)能冇重要作用的蛋白質(zhì)，在某些病理情況下可經(jīng)多種方式氧化生成 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-ldl)并發(fā)揮其特有的病理學(xué) 作用，如可致內(nèi)皮細(xì)胞損傷并使巨噬細(xì)胞泡沫化，在動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮重 要作用。近年有研究顯示，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)吋體內(nèi)ox-ldl生成增多，而體外 研究證實(shí)ox-ldl對lps細(xì)胞間的反應(yīng)有明顯調(diào)節(jié)作用，影響細(xì)胞因子如1l-1和 tnf及其它炎癥因子的表達(dá)w。但由于所采用的細(xì)胞體系及ox-ldl所使用的劑量 與刺激吋間不向，所得結(jié)論不盡相同。冇研究結(jié)果顯示，高劑量ox-ldl長吋間刺激

17、 能降低細(xì)胞對lps的反應(yīng)性，抑制細(xì)胞因子的釋放，另有結(jié)果顯示，低劑量ox-ldl 短時間刺激能增敏細(xì)胞對lps的反應(yīng)性，使細(xì)胞因子等產(chǎn)生明顯增高。但關(guān)于內(nèi)毒素 血癥時體內(nèi)ox-ldl的變化規(guī)律、其對機(jī)體一lps反應(yīng)性的影響及其可能機(jī)制尚未見 相關(guān)文獻(xiàn)報道。為此，本實(shí)驗(yàn)從以下三個方面進(jìn)行研宄：1.觀察內(nèi)毒素血癥時小鼠血漿ox-ldl 的變化；2.在體觀察ox-ldl預(yù)處理對小鼠一lps反應(yīng)性的影響；3.體外觀察ox-ldl 預(yù)處理對肺泡巨噬細(xì)胞一lps反應(yīng)的影響及其機(jī)制。旨在通過以上研究，深化對認(rèn)識 內(nèi)毒素血癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為尋找防治內(nèi)毒素血癥的有效措施提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動

18、物昆明種小鼠20-26g，雌雄不拘，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。二、主要儀器設(shè)備1.超低溫冰箱（-70°c）（sanyo-382at，日本）2.電子分析天平（precisal2a,瑞士）3.高速低溫離心機(jī)（beckman,美國）4.低速常溫離心機(jī)（sigma, 2-5 型美國）5.二氧化碳培養(yǎng)箱（shellab,美國）6.超浄工作臺（bcm-1000,蘇州）7.照相顯微鏡（olympus ck2, 口本）8.電子酸度計（beckman, 520ano,美國）9.紫外分光光度儀（du-640, beckman,美國）10.培養(yǎng)板（24孔）（nunc,丹麥）11.微量可調(diào)移液

19、器（eppendorf,德國）12.全自動連續(xù)波長酶標(biāo)儀（tecan ranibow,奧地利）13.微量蛋白透析袋（pierce,美國）三、主要試劑來源1.低密度脂蛋白（sigma,美國）2.氧化低密度脂蛋白檢測試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)公司）3.小鼠tnf- elisa試劑盒（diaclone,美國）4.硫酸銅（重慶化學(xué)試劑總廠）5.乙二胺四乙酸二鈉（edta）（重慶北培化學(xué)試劑廠）6.lps（e.coli 026:b6）（difco,美國）7.大鼠抗小鼠sr單克隆抗體（2f8）（serotec,英 m）8.大鼠抗小鼠cd14單克隆抗體（pharmingen，美國）9.hepes（gibco，

20、美國）10. rpmi1640（gibco，美國）11.l-谷氨酰胺（上海生物化學(xué)研究所）12.小-十血清（fbs）（杭州四季青生物公司）13.牛血清白蛋白（bsa）（上海生物化學(xué)研宄所）14.臺盼藍(lán)（typan blue）（sigma,美國）15.十二烷基磺酸鈉（sds）（sigma，美國）四、試劑配制1.消毒液：75%酒精，2%碘酒溶液2.1.5%戊巴比妥鈉溶液戊巴比妥鈉0.75g生理鹽水50ml3. d-hanks溶液(ph7.4)nacl8gkc10.4gna2hpo4.12h2o0.135gkh2po40.06gnah(；o30.35gglucose1 g三蒸水1000ml4. 10

21、%fbsrmpi1640 培養(yǎng)基應(yīng)用液(ph7.4)rmpi1640l0.4ghepes2.4gnahco32gpcnicillin(80 00u/4ml)0.5mlstreptomycin(l 000000u/5ml)0.5ml三蒸水至1000ml使用前，于89ml上培養(yǎng)基中加入以不成分: lomlfbs, l-glutaminc21.9mg , 1ml 胰島素。7.4%nahcosnahco37.4g三蒸水100ml0.5%臺盼藍(lán)溶液臺盼藍(lán)0.2gd-i lanks緩沖液40ml配制不同濃度的內(nèi)毒素(lps):瓶裝loomge.coli. 026:b6,溶解于火菌生理鹽水內(nèi)，分別配 制成

22、lmg/ml，2.5mg/ml， 5mg/ml 三種不同濃 度的lps, 4°c冰箱保存8. 0.01mpbs 應(yīng)用液：a 液：0.2m()l/l na2hpo4:na2hpo4.12h2o71.632g蒸餾水1000mlb 液:0.2mol/l nah2po4：nah2po4.2h2o7.8g，蒸餾水250mlphosphate buffer(pb)：取 a 液 190ml+b 液 810ml,調(diào)整測 ph=7.4, pb 100ml,加nacl 17.8g，加蒸餾水至2000ml，即為0.01mpbs應(yīng)用液9. 0.15mol/l nacl 溶液：nacl8.775g三蒸水100

23、0ml10. 500ocmedta(乙二胺四乙酸二鈉)edta164.2mg0.01mpbs 溶液1000ml100ocmol/l硫酸銅配制：硫酸銅(cuso4.5h2o)16mg0.01mpbs 溶液1000ml10%sds溶液sds10g三蒸水100ml五、實(shí)驗(yàn)方法(一) 小鼠內(nèi)毒素血癥時血漿ox-ldl的變化1. 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理昆明種小鼠80只，隨機(jī)分為正常對照組及l(fā)ps注射組，其中l(wèi)ps注射組又按 注射劑量分為1.0mg/kg、2.5 mg/kg、5.0mg/kg3組，各劑量組又按注射后不同吋間 分為0.5h、lh、2h、4h、8h共5小組。每組均為5只動物。小鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h，

24、可自由飲水。稱重后，經(jīng)尾靜脈內(nèi)注入1、2.5或5.0mg/kg 體重lps(型號e.coli026:b6,下同)，復(fù)制內(nèi)毒素血癥模型。2. 標(biāo)本采集按實(shí)驗(yàn)設(shè)計預(yù)定時相點(diǎn)麻醉小鼠取心血0.5ml,迅速與抗氧化劑混勻， looorpm, 4°c離心10分鐘，取血漿，4°c保存，樣品于一周內(nèi)測定血漿ox-ldl。3. 血漿ox-ldl測定(1) 將試劑盒中試劑及酶標(biāo)板、樣品置于室溫(20-25'c)平衡20分鐘；(2) 按試劑盒說明書配制樣品稀釋液、洗滌液、系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物；(3) 按預(yù)先設(shè)計的酶標(biāo)板各孔分別加入0.1ml樣品稀釋液(空白對照)、系列標(biāo) 準(zhǔn)品和檢測樣品于酶

25、標(biāo)板孔內(nèi)，3丁c，孵育lh;(4) 棄反成液，用洗漆液輕柔洗板3次，吸水紙上控干；(5) 各孔加酶結(jié)合物0.1ml, 37°c,孵育lh;(6) 棄反應(yīng)液，洗板5次，吸水紙上控干；(7) 加底物0.1ml, 37°c,孵育15分鐘；(8) 各孔加終止液50-1；(9) 連續(xù)波長酶標(biāo)儀(tecan ranibow 奧地利)上測定，波長為492nm,空白孔 校零；(二) ox-ldl對lps-小鼠反應(yīng)的影響1. ox-ldl的制備(1) ldl透析：氧化前將購罝的ldl吸入透析袋內(nèi)，置于0.01mpbs(ph7.4)溶液中，避光，4°c,透析3天，去除保護(hù)劑edta。

26、(2) 氧化：透析后的ldl裝入小瓶，加入100ocmol/l硫酸銅(過濾除菌)，使 瓶屮溶液硫酸銅的濃度為10ocmol/l, 37°c孵育24h,溶液顏色由金黃色變?yōu)辄S色。(3) 終止：反應(yīng)液置冰上冷卻，加入500ocmol/ledta,使edta終濃度為 50amol/l<>(4) 透析：將反應(yīng)液裝入透析袋內(nèi)在置于0.9%氯化鈉平衡溶液中，4°c，反 復(fù)透析，去除殘余硫酸銅、edta。(5) 測定ox-ldl濃度。2. ox-ldl對內(nèi)毒素血癥小鼠體內(nèi)tnf及肝組織病理損害的影響(1) 動物分組昆明種小鼠92只，隨機(jī)分為正常對照組，lps注射組，ox-ld

27、l 0.35 mg/kg、 1.4mg/kg 注射組，ox-ldl 0.35 mg/kg、1.4mg/kg 預(yù)處理復(fù)合 lps 注射組，lps 劑量為lmg/kg體重。除正常對照組外各組又按lps或ox-ldl(ox-ldl注射組)注射后時間分為lh、2h、4h、8h4個小組，各小組均為4只動物。所有藥物均從 尾靜脈注射，ox-ldl預(yù)處理組于ox-ldl注射30min后再注射lps。(2) 標(biāo)木采集 血漿、肝肺組織tnf標(biāo)本：按預(yù)定吋相點(diǎn)麻醉動物，無菌條件下顯露心 臟、肝臟、及肺臟，心臟穿刺取血后取肝右葉不緣及右肺不緣組織冰浴勻漿，將 血液和勻漿離心取上清及血漿，-70°c保存?zhèn)錅y

28、tnf_。 肝組織病理標(biāo)本：選lps注射組、ox-ldl 0.35 mg/kg注射組及ox-ldl0.35 mg/kg預(yù)處理復(fù)合lps注射組的1、2、8h小組，于取血及肝、肺組織(供t n f 測定)后，另外剪取肝右葉組織塊約0.5®x0.3x1.0 cm大小于10%中性甲醛中固定 24ho(3) 標(biāo)木測定及觀察 血漿、肝肺組織tnf-測定(elisa法)：按照試劑盒的操作說明，以450nm 為測定波長，620nm為參考波lc在連續(xù)波k:酶標(biāo)儀上測定各標(biāo)木的tnf-含量。 肝組織病理切片觀察：將經(jīng)過10%中性甲醛中固定24h的肝組織常規(guī)脫蠟后 做成5微米石蠟切片，n染色觀察。3. o

29、x-ldl對內(nèi)毒素血癥小鼠死亡率的影響同規(guī)格昆明種小鼠150只，隨機(jī)分為lps單純注射組(n=50),低劑量 ox-ldl(0.35mg/kg)預(yù)處理復(fù)合 lps 注射組(n=50)、高劑量 ox-ldl(1.4mg/kg)預(yù) 處理復(fù)合lps注射組(n=50)三組，lps劑量為lmg/kg體重。所有藥物均從尾靜脈 注射，ox-ldl預(yù)處理組于ox-ldl注射30min后再注射lps。觀察lps注射后 24h內(nèi)動物死亡率。(三) ox-ldl對肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素反應(yīng)的影響及其可能機(jī)制1. 肺泡巨噬細(xì)胞分離、培養(yǎng)(1) 昆明種小鼠禁食12h，乙醚麻醉，(2) 將小鼠從頸部以下浸泡于75 %酒精中2

30、秒后，仰面固定手術(shù)臺上，頸部 再次用2%碘酒消毒、75%酒精脫碘，鋪消毒洞巾。(3) 頸部正中切口，逐層剪開，找到氣管后更換手套和手術(shù)器械。(4) 剪開氣管并行氣管插管，成功后結(jié)扎固定插管，以預(yù)冷的d-hanks液灌 注肺臟，灌注速度約為5 ml/min,每次灌注液總量約為1.5ml,輕揉胸部，回抽灌 注液于離心管，共灌注3次。(5) 以8層紗布過濾灌注液，除去組織碎片，收集細(xì)胞懸液。(6) 細(xì)胞懸液4°c、500g離心5分鐘，棄上清，加10ml rpmi-1640液重懸細(xì)胞。(7) 調(diào)整細(xì)胞計數(shù)為lxl06/ml,接種于24孔培養(yǎng)板屮于5%co2 , 37°c條件 下培養(yǎng)

31、。(8) 3h后換液，用溫育的rpmi-1640液沖洗以除去不貼壁的細(xì)胞，吉氏染色顯 示細(xì)胞純度90%，臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活力295%。(9) 培養(yǎng)24h后即可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。2. 實(shí)驗(yàn)分組及測定指標(biāo)分對照組、ox-ldl 5、20ug/ml .單純處理組、lps單純處理組、ox-ldl 5、20ug/ml 預(yù)處理復(fù)合lps處理組、ox-ldl 5ug/ml+cd 14抗體10ug/ml+lps處理組和sr單克 隆抗體2f8 10ug/ml+lps處理組。lps濃度均為lng/ml , ox-ldl及抗體均與細(xì)胞 孵育30min后再接受lps刺激。ox-ldl單純處理組系ox-ldl與細(xì)胞共孵育2h

32、后 收集上清，其余各組均為lps加入培養(yǎng)液后2h收集培養(yǎng)上清，一70°c保存，測定上清tnf水平。六、統(tǒng)計學(xué)處理所有計量資料用均數(shù)示準(zhǔn)差表示(x-采用spss10軟件單因素方差分析(one wayanova)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，p<0.05表示差異明顯，p<0.01表示相差非常顯著。結(jié) 果一、內(nèi)毒素血癥小鼠血漿ox ldl的變化lps注射能明顯增加ox-ldl的產(chǎn)生，lps注射后0.58h,各劑量組ox-ldl的 水平均顯著高于正常對照(p<0.01), 2.5mg/kg及5.0mg/kg兩組動物血漿ox-ldl濃度 均顯著高于1.0mg/kg組(p<0.01,或p

33、<0.05)o lps劑量越大，ox-ldl的峰值出現(xiàn)越 早。如表1、圖1所示：表1內(nèi)毐索血癥時血漿ox-ldl的變化(x± s n = 5 )lpsox-ldl(ug/ml)對照0.5hlh2h4h8h1 .omg/kg8.62 士 0.5311.06 士 0.8415.00 士 0.4113.56 士$.647.73 土 0.61-2.5mg/kg3.03=0.2214.25 土 0.88-'16.59=0.70-14.58±0.82-11.86±0.88-8.43 土 0.68»5. omg/kg26.68 士 1.02“'i

34、8.32±1.36-”15.41 土 0.67:12.28±0.76-9.56 士 0.85”注：2.5mg/kg劑組小鼠在lps注射8h死亡1只，5mg/kg劑s組在lps注射4h米血前死亡1 只，8h采血前死亡2只。s f)趙後lqqlxo祭一yi圖1內(nèi)毒素血癥時血漿ox-ldl的變化 與正常對照相比，*p<0.01，與lmg/kg劑s組相比，#p<0.05, #p<0.01。二、ox ldl對小鼠一lps反應(yīng)的影響1. 肝、肺組織tnf-<內(nèi)毒素血癥時小鼠肝、肺組織tnf水平明顯高于正常對照組(p<0.01), lps注射 后lh達(dá)到峰值

35、，8h仍明顯高于正常水平；ox-ldl預(yù)處理能明顯增強(qiáng)lps誘導(dǎo)小鼠 肝、肺分泌tnf的作用，不同劑量ox ldl預(yù)處理組肝、肺t n f 水平均顯著高于 l p s單純注射組同吋相點(diǎn)(p<0.01);不同劑量ox-ldl預(yù)處理比較，在lh吋相點(diǎn) 1.4mg/kg ox-ldl預(yù)處理組肺組織t n f 顯著高于0.35mg/kg ox-ldl預(yù)處理組 (p<0.01),其他時相點(diǎn)及肝組織tnf差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)，見表2、圖2，表3、圖3。表2 ox-ldl對內(nèi)毒素血癥小鼠肝組織tnf-ct的影響(x-=hs n=4)tnf-a(ng/g)分？組對照lh2h4h8hlps

36、14.76 士 1.81 1207.25士 80.88 w *773.14士 35.08540.44士40.94 "315.18 士 13.680.35mg/kgox-ldl+lps16.21 土 1.421698.70±24.99叭八a, a、* * 羚杉1199.10士 26.04771.20±31.81435.86 士 21.951.40mg/kgox-ldl+lps17.35±0.731756.70±54.031194.56士 52.19fe u u746.74土 33.62407.35土 14.25>ifa>/6u) e-

37、llnh圖2 ox-l d l注射對內(nèi)毒素血癥小鼠肝組織tnf-<的影響 與正常對照比較，* *p<0.01;與lps單純注射組相比，#p<0.01。農(nóng)3 ox-ldl注射對內(nèi)毒素血癥小鼠肺組織tnf-a的影響(x-士sn=4)分組tnf-a(ng/g)對照lh2h4h8hlps10.68 土 1.221003.75±16.13“289.75土 16.09”53.25±8.42*29.25土 5.62*0.35mg/kgox-ldl+lps12.20 土 1.711389.5±33.43764.50±43.52292.50土 20.49

38、 286.67士22.501.40mg/kg13.42 土 l91 1518.25 土 77.83811.75±79.44306.00土 14.58 290.75士 18.73ox-ldl+lps lps(1mg/kg) oxldl(0.35mg/kg)+lps(1 mg/kg)輕ia)/6u) elini圖3 ox-ldl注射對內(nèi)毐素血癥小鼠肺組織tnf-a的影響。與正常對照比較，*p<0.05；*p<0.01;與 lps 單純注射組相比，<0.01;與 0.35mg/kg ox-ldl 劑組相比，1 p<0.012. 血漿 tnf_0.35mg/kg ox

39、-ldl注射后不冋吋間tnf_產(chǎn)生略低于正常對照，而1.40mg/kg ox-ldl注射后不同時間tnf-<產(chǎn)生略高于正常對照，但均無統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。lps注射后小鼠血漿tnf明顯高于正常對照(p<0.01), ox-ldl預(yù)處理能進(jìn)一步增加 血漿tnf的水平，與lps單純注射組相比，各時相點(diǎn)tnf產(chǎn)生水平明顯升高 (p<0.01)；不同劑量ox-ldl預(yù)處理比較，1.4mg/kg ox-ldl預(yù)處理組lh吋相點(diǎn) t n f 顯著高于0.35mg/kg ox-ldl預(yù)處理組(p<0.01),其余時相點(diǎn)無顯著性差異(p0.05)，結(jié)果見表4、圖4、圖5。表4 o

40、x-ldl注射對小鼠血漿tnf-a的影響（x-士s n=4） tnf-a（ng/ml）對照lh0.35ing/kgox-ldl4.26 土 0.413.92 士 0.261.40mg/kg ox-ldl4.26 士 0.414.42 士 0.18lps4.26 土 0.4186.44土4.21*o.35mg/kgox-ldl+lps3.92 士 0.2611 1196.45土 1.801.40mg/kg ox-ldl+lps4.42 土0.18 105.96土 2.34一2h4h8h3.87 土 0.214.15 土0.424.07 土 0.244.62 土 0.374.72 土 0.444.

41、35 土 0.2962.14±3.70*31.78 土 2.87*16.85 土 1.39-11 1171.29 土 4.32”11 1148.58±3.35-24.72 士 3.56”71.39 土 2.56“#51.64 土 2.96“#26.95土 1.36*5.0 e-llzlo.5 4.3.«_0.35mg/kg ox-ldl _<_1.40mg/kg ox-ldlox-ldl注射后時（小時）圖4: ox-ldl注射對小鼠血漿tnf-a的影響100i - 80i - io o 6 4s0e/6u)- , o o 2ctjdnilps(1mg/kg)

42、"5.0.35mg/kg ox-ldl+lps(1 mg/kg).40mg/kg ox-ldl+lps(1 mg;kg)0lpp注射后時（間2小時48圖5 ox-ldl注射對內(nèi)毒素血癥小鼠血漿tnf-a的影響 與正常對照比較，*p<0.01;與lps單純注射組相比，胖p<0.01;與0.35mg/kgox-ldl劑量組相比，1 p<o.oi3. 肝組織病理損害光鏡檢查顯示，ox-ldl注射后8h未見肝組織結(jié)構(gòu)的明顯損害（照片1）, lps注 射后早期可見肝竇擴(kuò)張，匯管區(qū)血管充血（照片2）。隨著吋間延長，可見匯管區(qū)及肝竇 內(nèi)有灶性或散在的炎性細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞胞漿的疏松

43、水腫及氣球樣變（照片3、4）;ox-ld預(yù)處理能加重lps注射造成的肝臟病理改變：在lps注射后lh即可見到部分 肝細(xì)胞胞漿的疏松水腫、氣球樣變及匯管區(qū)、肝竇內(nèi)散在的炎性細(xì)胞浸潤（照片5）; 2h 肝細(xì)胞疏松水腫程度明顯加重并出現(xiàn)空泡（脂肪）變性（照片6）; 8h除肝細(xì)胞水腫變性、 匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤外，還可見部分肝細(xì)胞嗜酸性變性或壞死，多位于肝小葉的外周 區(qū)域（照片7）。4. 動物死亡率lps注射組動物24h死亡率為8%,以注射后1218h時間段死亡為主；ox-ldl 注射不能導(dǎo)致動物死亡（數(shù)據(jù)未列出），但以不同劑量ox-ldl預(yù)處理動物后再注射 lps，動物24h死亡率明顯增高（p<

44、0.05）,不同劑量ox-ldl預(yù)處理對動物死亡率影響 的差別無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）,結(jié)果見表5。表5 ox-ldl對內(nèi)毒素血癥小鼠死亡率的影響分組動物數(shù)死亡數(shù)死亡率（）卡方值p值lps(lmg/kg)5048.000.35mg/kg ox-ldl+lps501224.00*4.7620.0291.4mg/kg ox-ldl+lps501326.00*5.4710.017合計1502919.33與lps單純注射組相比，*，p<0.05三、0x ldl對內(nèi)毒素刺激肺泡巨噬細(xì)胞tnf_產(chǎn)生的影響及其與sr、c d 1 4抗體 的關(guān)系5ug/ml ox-ldl與培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞共孵

45、育2h,不能明顯誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞分泌 tnf，而20ug/ml ox-ldl與培養(yǎng)肺泡巨噬細(xì)胞共孵育2h后能引起t n f 的輕微增 高（p<0.05）;與對照組相比，lps刺激肺泡巨噬細(xì)胞2h, tnf分泌顯著增加（p<0.01）; 與單純lps處理組相比，不同劑量ox-ldl預(yù)處理細(xì)胞后再行l(wèi)ps刺激，t n f 分泌 增加更為明顯（p<0.01）?？箂r單克隆抗體2f8預(yù)處理后再施以lps刺激，細(xì)胞上清 tnf-的水平最高，顯著高于不同劑量ox-ldl預(yù)處理復(fù)合lps刺激組（p<0.01）,而預(yù) 先應(yīng)用抗cd 1 4抗體處理后再施以lps刺激，則tnf的產(chǎn)生明顯受

46、抑，見表6、圖6、 圖7。ox-ldl(5ug/ml)ox-ldl(20ug/ml)正常對照024681012141618202224 pq/mltnf-a圖6 ox-ldl對肺泡巨噬細(xì)胞分泌tnf-a的影響勹正常對照組相比，p<b.o5(ie/6d) e-ulnl| ox-ldl(5ug/ml)ox-ldl20uml)lpsox-ldl(5ug/ml)4-lpsox. ldl(20ug/rnl)+lps qjjjj2f8+lps|ox-ldl(5ug.iml)+cd14 抗體 lps# 分m00500050005000500050005000500050 877665544332211

47、o表6 ox-ldl對肺泡e噬細(xì)胞分泌tnf-a的影響(x-：fcs n=3)分組tnf-a?pg/ml?培養(yǎng)細(xì)胞上清16.35 士 1.045ug/mll6.80±l.92ox-ldl八20ug/ml21.78 土 2.60°lps320.3 l±l l.04-0x-ldl(5ug/ml)+lps424.7o±lo.3l-ox-ldl(20ug/ml)+lps575.24士 8.4卜"2f8(loug/ml)+lps672.67±9.69- ”嫩ox-ldl(5ug/ml)+cdl4 抗體(l oug/ml)+lps49.57

48、77;2.53-圖7 ox-ldl對lps誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生tnf-a的影響 與ox-ldl注射組比較，*p<0.01;與lps注射組相比，#p<0.01;與ox-ldl+lps處理組相比，'p<0.()lo討 論一、內(nèi)毒素血癥時小鼠血漿0x ldl急劇增高，增高程度與內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)本實(shí)驗(yàn)動態(tài)觀察了三種不同劑量lps注射小鼠后不同時相點(diǎn)血漿ox-ldl的變化情況。結(jié)果顯示，lps注射后0.58h，各劑量組動物血漿ox-ldl均顯著高于正常 對照(p<0.01)，以lps注射后0.5h最高，隨后逐步下降，但在lps注射后8h仍顯著 高于正常對照。實(shí)驗(yàn)同時顯示

49、，ox-ldl增高水平與lps劑量具有一定相關(guān)性，2.5mg/kg及5.0mg/kg兩組動物在lps注射后0.5h及l(fā)h兩時相點(diǎn)血漿ox-ldl顯著 高于同時相點(diǎn)1.0mg/kg組(p<0.01), 4h、8h組也高于lmg/kg組(p<0.05),充分證明 lps注射能使小鼠血漿ox-ldl水平以劑量依賴的方式增加，即ox-ldl增高程度與 lps劑量呈正相關(guān)。動物內(nèi)毒素血癥吋血漿ox-ldl的異常增高與內(nèi)毒素血癥時體內(nèi)一系列癇理生理 改變尤其是氧化環(huán)境顯著增強(qiáng)有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，多種機(jī)制均可介導(dǎo)體內(nèi)天然存在 的ldl(包括蛋白及脂質(zhì))的氧化從而形成ox-ldl。自由基是介導(dǎo)ld

50、l氧化的主要機(jī) 制之一，這一氧化過程是由多不飽和脂肪酸(亞油酸、花生四烯酸等)過氧化起始反應(yīng)， 經(jīng)過分子重新排列，形成共軛雙烯，以致形成自由基產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，作用于其他更多 的脂肪和蛋白質(zhì)，最后雙鍵斷裂形成醛(丙二醛-mda、4-羥壬烯醛、己烯醛等)與蛋白 質(zhì)氨基酸交聯(lián)；細(xì)胞參與ldl氧化的機(jī)理雖然尚不完全清楚，但實(shí)驗(yàn)證實(shí)多種細(xì)胞如 腎小球系膜細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞株thp-1等均可以誘導(dǎo)對ldl的氧 化，有學(xué)者認(rèn)為脂氧合酶(lipoxygenase)特別是15-脂氧合酶參與ldl氧化，使單核 細(xì)胞釋出超氧&由基。內(nèi)毒素血癥時，機(jī)體內(nèi)滋生人量ft由基參與ox-ldl形 成的分子

51、如還原型輔酶ii(nadph)氧化酶、15脂氧合酶的水平也顯著升高而 單核-巨噬細(xì)胞的活化和聚集增強(qiáng)了局部和全身的氧化環(huán)境，這些變化均可使ox-ldl 的形成增加。另外，內(nèi)毒素血癥時動物血漿ldl的氧化易感性也明顯增高，這在其他 學(xué)者的實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí))。上述多種因素的綜合作用使a毒素血癥時血漿 ox-ldl水平急劇升高，其在炎癥反應(yīng)中的作用有待進(jìn)一步研究。二、ox_ldl增敏動物對內(nèi)毒素的反應(yīng)性有不少學(xué)者對ox-ldl影響細(xì)胞一lps的反應(yīng)性進(jìn)行了研究，但由于所使用的細(xì) 胞種類、ox-ldl劑量及刺激時間不同，結(jié)論不一。有研宄結(jié)果顯示，高劑量ox-ldl 長時間刺激巨噬細(xì)胞能降低細(xì)胞對lp

52、s的反應(yīng)性m-n，同時也有研究結(jié)果顯示，低劑 量ox-ldl短時間刺激巨噬細(xì)胞能增敏細(xì)胞對lps的反應(yīng)性，使細(xì)胞因子等產(chǎn)生明顯 增高d。但至今未見有在體ox-ldl對動物一lps反應(yīng)性影響的研宄報道。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純注射ox-ldl并不能使小鼠肝、肺組織及血漿tnf水 平增加，對肝組織病理損害及小鼠死亡率也沒有明顯影響，但是預(yù)先注射ox-ldl后 再注射lps,小鼠肝、肺組織及血漿tnf水平明顯高于單純注射lps組動物，肝組 織病理損害也明顯加重，其最終結(jié)果是動物的死亡率明顯上升，提示ox-ldl預(yù)處理 能增敏小鼠對lps的反應(yīng)性。隨著內(nèi)毒素血癥的發(fā)展，炎癥級聯(lián)反應(yīng)逐步放大及炎癥介質(zhì)過度

53、釋放將使炎癥反 應(yīng)從防御性向致害性轉(zhuǎn)變，造成組織細(xì)胞損害，進(jìn)而發(fā)展為器官功能障礙?，F(xiàn)己明確，導(dǎo)致sepsis及mods的基本原因是由于細(xì)菌及毒素激活了機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)等 炎癥效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生、釋放大量炎癥介質(zhì)以及炎癥介質(zhì)之間相互作用，其屮tnf是 炎癥級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵啟動因子。內(nèi)毒素血癥時ox-ldl的水平升高，蘇增敏lps誘 導(dǎo)炎性效應(yīng)細(xì)胞合成炎癥介質(zhì)的能力也加強(qiáng)，導(dǎo)致具有廣泛生物活性的介質(zhì)如細(xì)胞因 子等大量釋放，加之細(xì)胞因子通過自身反饋調(diào)節(jié)及相互作用產(chǎn)生“瀑布”效應(yīng)，使炎 癥反應(yīng)得到進(jìn)一步放大；大量的生物活性物質(zhì)通過損傷、破壞細(xì)胞生物膜，增高血管 通透性及激活凝血過程進(jìn)一步加重微循環(huán)障礙

54、，并破壞細(xì)胞、組織的結(jié)構(gòu)與功能，另 一方面，機(jī)體過度炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞解毒功能受損，減弱單核-巨噬細(xì)胞防御功 能，使宿主對內(nèi)毒素的清除能力下降，加速內(nèi)毒素血癥的發(fā)展進(jìn)程，最終導(dǎo)致mods 發(fā)也(17)。三、ox ldl增敏小鼠對內(nèi)毒素反應(yīng)性的可能機(jī)制sr是一類在宿主防御中起重要作用的細(xì)胞膜表面分子，其中sr-a是己知清除、滅活lps的主要分子，是內(nèi)毒素的滅活受體而cd14則是lps的主要激活受體。 體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均表明巨噬細(xì)胞可以通過sr-a識別、結(jié)合并降解細(xì)菌及其毒素，防止 感染發(fā)生，基因敲除實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步證實(shí)sr-a能通過清除lps而在宿主防御中發(fā) 揮重耍保護(hù)作用(22)。外研究顯示，ox

55、-ldl與sr-a具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，是sr-a 的一種高親和力非特異性受體p3.24k在體研宄顯示，預(yù)先應(yīng)用sr-a的特異性配體如 巖藻糖對sr-a受體進(jìn)行封閉性處理后再使用同位素標(biāo)記的ox-ldl,機(jī)體結(jié)合 ox-ldl的能力明顯下降(25,26)。病理?xiàng)l件下過多的ox-ldl有可能對sr-a功能的發(fā) 揮產(chǎn)生重要影響：內(nèi)毒素血癥時增加的ox-ldl可能與lps競爭結(jié)合sr-a,導(dǎo)致lps 清除減少而游離lps增多(27,28),這些游離的lps與lps激活受體結(jié)合，激活巨嗜細(xì) 胞從而產(chǎn)生程度更為強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)。為此，我們采用抗體阻斷技術(shù)從細(xì)胞水平研宂其增敏作用的可能機(jī)制，結(jié)果顯示： 低劑

56、量(5ug/ml)ox-ldl刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞不能明顯誘導(dǎo)tnf的產(chǎn)生，高劑量 (20ug/ml)刺激對小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌tnf有較弱的誘導(dǎo)的作用(p<0.05)，但與lps 誘導(dǎo)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞tnf分泌相比，高劑量ox-ldl刺激對tnf分泌的誘導(dǎo)作 用很微弱；而應(yīng)用不同濃度ox-ldl預(yù)處理肺泡巨噬細(xì)胞后再用lps刺激，與單純 lps刺激和比，tnf的分泌顯著增加，且高濃度ox-ldl預(yù)處理組tnf的分泌增加 更為顯著，僅次于抗sr單克隆抗體2f8預(yù)處理復(fù)合lps刺激組。相反，應(yīng)用抗cd14 抗體預(yù)處理后，ox-ldl復(fù)合lps刺激對tnf分泌的誘導(dǎo)作用人幅度減弱。以上實(shí) 驗(yàn)結(jié)果一方面證實(shí)cd14是lps活化細(xì)胞不可或缺的分子，cd14在lps介導(dǎo)的生物 學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮了絕對重要的作用，另一方面更為重要的是證實(shí)ox-ldl在細(xì)胞水平對 lps反應(yīng)性同樣具有增敏作用，這種增敏作用的產(chǎn)生與ox-ldl競爭性拮抗sr-a清 除lps,使后者與巨噬細(xì)胞表面的內(nèi)毒素活化受體cd14結(jié)合相對增加，進(jìn)而增強(qiáng)其 激活作用，加重炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。1. 內(nèi)毒素血癥時小鼠體內(nèi)o