RNA抑制沉默和過(guò)氧化氫酶是CMV病毒2B蛋白與蛋白相互作用引起壞死的原因

1、rna抑制沉默和過(guò)氧化氫酶是cmv病毒2b蛋白與蛋白相互作用引起壞死的原因原文出處：jun-ichi i，bo mk, hanako s，and chikara m. virus-induced necrosis is a consequence of direct protein-protein interaction between a viral rna-silencing suppressor and a host catalasefjl.plant physiology 6, august 2011，vol. 156, pp.2026-2036.virus-induced necro

2、sis is a consequence of direct protein-protein interaction between a viral rna-silencingsuppressor and a host catalase許多植物宿主發(fā)病是因?yàn)椴《镜鞍紫嗷プ饔?，但植物病毒如何誘發(fā)某種疾病 的癥狀還需要進(jìn)一步的研宄。黃瓜花葉病毒（cmv-hl）可誘導(dǎo)在感染百合品系 擬南芥（擬南芥）植物得離散壞死斑;其他的cmv株可誘導(dǎo)類似的斑點(diǎn)，但并不 是所有都由cmv-hl誘導(dǎo)。眾所周知rna沉默抑制cmv的原理是啟動(dòng)2b蛋 白（2b）,參與病毒的誘導(dǎo)。在釆用原位接近連接測(cè)定免疫染色和原生質(zhì)的測(cè)

3、定 中，報(bào)告顯示，cmv2b的直接交互catalase3 （cat3）在受感染的組織，在分解 中有一個(gè)關(guān)鍵酶的作用是有毒性的過(guò)氧化氫分解的。有趣的是，cat3,通常在 細(xì)胞質(zhì)（乙醛酸循環(huán)體）的局部，由2b和cat3之間的相互作用到細(xì)胞核。雖 然cat3在轉(zhuǎn)基因植物中的過(guò)表達(dá)降低的cmv積累和延遲的病毒癥狀發(fā)展到一 定程度，2b中似乎以中和過(guò)氧化氫酶的細(xì)胞有助于主機(jī)防御反應(yīng)，從而有利于 病毒感染。我們的結(jié)果提供的證據(jù)表明，除改變的類型癥狀通過(guò)干擾微rna途 徑和2b可以直接綁定到一個(gè)宿主因子是在清除蜂窩重要過(guò)氧化氫，從而與該主 機(jī)因子干擾具體地說(shuō)，導(dǎo)致一個(gè)特定壞死的誘導(dǎo)。黃瓜花葉病毒（cmv）屬

4、的病毒粒子包含單分子rna1到rna3遞減順 序分子質(zhì)量的三方單鏈rnao基因組rna1和rna2編碼復(fù)制酶蛋白la和2a 分別與rna3編碼運(yùn)動(dòng)蛋白3a上，亞基因組rna, rna4,編碼外殼蛋白。2b蛋白（2b）中被編碼在一個(gè)亞基因組rna, rna4a,其具有在rna2 3端開(kāi)放閱讀框（orf） （ding 等，1994）。該cmv2b蛋白參與局部和全身cmv運(yùn)動(dòng)通過(guò)rna沉默抑制宿主防御，（ding 等，1995;紀(jì)，丁，2001 年;soards 等人，2002 年;shi 等人,2003 年）并且還充當(dāng)一種癥狀的決定因子，這顯然與其rna沉默抑制器（rss）活動(dòng)是相 關(guān)聯(lián)的（bri

5、gneti等人，1998;露等人，2000）。該2b蛋白在其n末端包含兩個(gè) 核定位信號(hào)（核定位信號(hào)）（露等人，2000; goto等人，2007）,在受感染的組織 被證實(shí)實(shí)際定位于細(xì)胞核中;2b蛋白的核定位信號(hào)是所需的病毒癥狀，誘導(dǎo)rss 活動(dòng)（露等人，2000; lewsey等人，2009）。近日，2b發(fā)現(xiàn)能結(jié)合argonaute 1（ago1），必要時(shí)也作為植物抗病毒機(jī)械，與ago4作用，也通過(guò)dna甲基化 過(guò)程，按制異形成和轉(zhuǎn)錄（zhang等人，2006年；gonza配音lez等人，2010）。 此外，據(jù)報(bào)道2b也直接綁定到小干擾rna（goto等，2007; kanazawa等，201

6、1 ）?；钚匝跷锓N之一過(guò)氧化氫（h2o2）,在許多生理現(xiàn)象如衰老，光呼吸和光合 作用，生長(zhǎng)和發(fā)育，以及對(duì)病原體的抵抗反應(yīng)都有一定作用（noctor和門(mén)廳，1998 年中起重耍作用;福爾曼和唐，2003; peng等人，2005）。此外，宿主植物生成過(guò)氧化氫，作為主要信使以誘導(dǎo)過(guò)敏性細(xì)胞死亡。catalase是一種酶存在于幾乎所 有的活的生物體，能分解h2o2，阻斷其功能。在擬南芥（擬南芥）屮，過(guò)氧化 氫酶基因家族由三名成員組成，分別是cat1, cat2和cat3 （frugoli等人， 1996）。cat2和cat3主要用于控制活性氧清除劑過(guò)氧化氫是穩(wěn)態(tài)植物過(guò)氧化 物酶體（du等人，2008

7、年a）。突變體cat2與cat3通常顯示萎黃的補(bǔ)丁和壞 死性病變（孔滕托和bassham，2010）。雖然cmv （cmv-hl）的百合菌株能誘 發(fā)許多擬南芥生態(tài)型植物壞死。columbia （col-0）和蘭茨貝格萬(wàn)壽菊，我們選 擇col-0中實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵S多突變系可用于進(jìn)一步研究。在擬南芥col-0中，cmv 誘導(dǎo)的植物鮮明壞死，這是與h2o2相關(guān)聯(lián)的，被h2o2感染后產(chǎn)生的。在木文 中，我們調(diào)查的cmv,和2b cat3相互作用直接引起相關(guān)壞死，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死 亡確實(shí)誘導(dǎo)cat3在2b中結(jié)合。在2b和cat3之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 這一簡(jiǎn)單的和特定的基礎(chǔ)上，我們可以開(kāi)始解釋cmv引起擬南

8、芥壞死潛在的分 子機(jī)制。結(jié)果cmv-hl感染擬南芥引起葉壞死cmv可系統(tǒng)侵染擬南芥的各種癥狀，原因取決于特定結(jié)合病毒株和擬南芥 的生態(tài)型。col-0植物上接種cmvy株（cmv-y）,他們幵發(fā)的系統(tǒng)花葉接種后 10天，并在3周后癥狀接種，壞死性病變觀察在上葉片。當(dāng)col-0中的植物接種 cmv-hl后，病毒最初局部接種葉內(nèi)傳播速度與cmv-y相比非常緩慢，但相比 cmv-y它引起的在上葉比更嚴(yán)重壞死（圖la）omock cmv-y y1h2y3 cmv-hlmockcmv-yy1h2y3biibo:mock cmv-y y1ii2y3d mock cmv-y y1h2y3圖1.壞死的誘導(dǎo)和h2

9、o2代由y1h2y3, cmv-y和cmv-hl之間pseudorecombinant擬南芥梢物 col-0中。在感染cmv-的植物，壞死癥狀hl和y1h2y3在18 dpi的b,以10 cmv感染的植物癥狀 dpi的，c，檢測(cè)h2o2在col-0巾的植物感染y1h2y3使w過(guò)氧化氫敏感熒光探針h2dcfda。葉子收獲 1（） dpi的拍照使用任何明亮的場(chǎng)光顯微鏡（bf）或熒光顯微鏡（h2o）。需要注意的是壞死在勾發(fā)熒光的pgbkt7-hl2b+p(；adt7pgbkt7-hl2bpgadt7-catlpgrkt7-ih.2bpgadt7-cat2p(ibkt7-hl2bpgadt7-cat3

10、圖2.hl2b和過(guò)氧化氫酶之間的相互作用。在酵母twohybrid檢測(cè)。每個(gè)質(zhì)粒（pgadt7屮，pgadt7 中，cat1，pgadt7 中，cat2,或 pgadt7 中-cat3）的 cotransferred 用的 pgbkt7-hl2b 到酵母株 ahi09。轉(zhuǎn)化ah109細(xì)胞鋪在生長(zhǎng)中無(wú)亮氨酸和色氨酸（2lw;左圖）或無(wú)亮氨酸，色氨酸，他的，和腺嘌呤（2lwha;右圖）。只冇當(dāng)表達(dá)的蛋ft質(zhì)彼此結(jié)合可以在細(xì)胞生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基上。看到網(wǎng)上文章，這個(gè)數(shù)字彩色版2b-cat3相互作用誘導(dǎo)壞死梢物生理學(xué)。卷156，20112027。為了確定用于壞死誘導(dǎo)的病毒因子（s），我們創(chuàng)建pseudo

11、recombinants、 cmv-y和cmv-hlo這三個(gè)基因組在cmv-y和cmv-hl中的rna分別被指 定 y1 到 y3 和 h1 至ij h3o pseudorecombinants 在 cmv-y、cmv-hl和y1h2y3之間引起接種植物明顯壞死的不同，這表明rna2為 重要癥狀原因之一。相反，對(duì)于原來(lái)的cmv-hl,我們選擇y1h2y3進(jìn)一步分 析壞死，因?yàn)椴幌馽mv-hl可以系統(tǒng)地移動(dòng)col-0和cmv-y樣快，并且在 葉部誘導(dǎo)相差很大的壞死（圖1）。y1h2y3在10天postinoculation （dpi）誘導(dǎo)壞死不同的上層葉，而cmv-y 誘導(dǎo)壞死的葉不在這個(gè)階段（

12、圖1b）。通過(guò)y1h2y3感染被發(fā)現(xiàn)，如通過(guò)氧化測(cè) h2dcfda; 2# , 7#二氯熒光素二乙酸酯（圖1c）,壞死斑的引起與過(guò)氧化氫的產(chǎn)生關(guān)聯(lián)增加。因?yàn)閔2o2充當(dāng)誘導(dǎo)防御基因，比如發(fā)病機(jī)理相關(guān)的蛋白（pr） 的基因，我們分析了一些公關(guān)的表達(dá)基因。結(jié)果是，pr1和pr5水平有所提高， 這意味著壞死可能是一種防御應(yīng)答（參考圖sl）o在組織印刷實(shí)驗(yàn)中，cmv-y 和y1h2y3分布在整個(gè)上部葉片，但病毒聚結(jié)壞死的中心沒(méi)有檢測(cè)到斑點(diǎn)（圖 1d）。因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)cmv-rna2hl （h2）對(duì)壞死是重耍的，我們接著考慮是否 rna2編碼的蛋白質(zhì)（2a和/或2b）都參與了壞死。我們專注于2b,因?yàn)樗?/p>

13、被 提出，2b與cmv癥狀有牽連，包括壞死（杜等人，2008年b）。hl2b與cat3在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中交互作用分析cmv2b如何參與壞死感應(yīng)，我們開(kāi)始將cmv2b的互動(dòng)與宿主因子隔 離。我們用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)在擬南芥cdna文庫(kù)gal4激活結(jié)構(gòu)域矢量pgadt7 中篩選基因，表達(dá)gal4結(jié)合結(jié)構(gòu)域誘餌載體所述hl2b框內(nèi)融合同結(jié)合結(jié)構(gòu)域 （質(zhì)粒pgbkt7-hl2b）。已報(bào)告，雖然cmv2bs作為酵母屮的轉(zhuǎn)錄激活劑（火 腿等，1999年；sueda等，2010）,幸運(yùn)的是，hl2b沒(méi)有此功能。我們篩選了約 5.0x106獨(dú)立的酵母轉(zhuǎn)化，并最終獲得八個(gè)候選克隆。其中一個(gè)克隆即有很強(qiáng)的 p-半乳糖

14、苷酶活性在雙雜交測(cè)定選擇用于測(cè)序，發(fā)現(xiàn)為所述cat3基因 （at1g20620）。因?yàn)閺膒gadt7文庫(kù)中分離cat3基因不完全，驗(yàn)證hl2b和 cat3之間的相互作用然后克隆cat3基因的全長(zhǎng)orf并復(fù)查它通過(guò)酵母雙雜交 測(cè)定法；包括兩個(gè)擬南芥的過(guò)氧化氫酶基因（cat1和cat2）。過(guò)氧化氫酶基因 （cat1, cat2,和 cat3）克隆到載體 pgadt7 分別創(chuàng)建 pgadt7-catl, pgadt7, cat2,和 pgadt7-cat3。每個(gè)構(gòu)建體 cotransferred 與 pgbkt7-hl2b 到釀酒酵母菌株ah109。結(jié)果表明，hl2b確實(shí)與cat3相互作用，但不與其

15、他 兩個(gè)過(guò)氧化氫酶（cat1和cat2;圖2）作用。要確定哪些領(lǐng)域2b與cat3互動(dòng) 很重要，我們通過(guò)缺乏創(chuàng)造了幾個(gè)hl2b缺失突變體c-末端氨基酸。c末端氨基 酸用40個(gè)氨基酸殘基缺失，創(chuàng)造了 hl2bd40,在雙雜交實(shí)驗(yàn)中突變2b失去與 cat3 結(jié)合的能力，而病毒（c 2 h 1） - hl2bd40 （c2-hl-hl2bd40）也失去了 誘導(dǎo)壞死的能力，指示2b結(jié)合cat3和壞死誘導(dǎo)之間的一個(gè)過(guò)程（圖3）。c 2 h 1是在cmv-y型病毒載體的多克隆位點(diǎn)，代替了圖2b基因（松尾等人，2007）。 hl2b的c-末端區(qū)域2b和cat3之間的相互作用很重要。過(guò)氧化氫酶活壞死的cmv感染

16、的植物和轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)2b(aa)hl2bm0c2-hi- c2-hl hl2b iil2ba40plant physiol. vol. 156, 2011因?yàn)槲覀兿耄?b和cat3之間的相互作用可誘導(dǎo)壞死，我們?cè)贉y(cè)得的過(guò)氧 化氫酶的活性在病毒感染的組織。cat2和cat3在葉里高度表達(dá)從而七據(jù)了大 部分的過(guò)氧化氫酶的活性。這兩個(gè)cat2和cat3敲除植物顯示壞死的斑塊病變, 這表明不論cat2還原還是cat3都能導(dǎo)致壞死葉（孔滕托和bassham, 2010）。 實(shí)際上，過(guò)氧化氫酶活顯著減少了 10 dpi的y1h2y3感染當(dāng)與mock或 cmv-yinoculated 葉相比。對(duì)照植物（圖

17、 4a ）。yeastp-galactosidase necrosis assay+圖3. cmv-hl2b與擬南芥相丸作用cat3o c端的，示意圖hl2b為酵母twohybrid缺失突變體檢測(cè)。 該hl2b基因刪除形式被融合到結(jié)合結(jié)構(gòu)域在pgbkt7屮載體（clontech），并且cat3 orf插入在pgadt7屮激活域載體（clontech）。b-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)。加號(hào)（+ ）表示轉(zhuǎn)錄激活，而減去（2）表示陰性結(jié)果。氨基酸，氨基酸。b，在col-0中的植物的癥狀感染了 c 2 h l-hl2b或c2-hl-hl2bd40。熏組hl2bs （hl2b, hl2bd12，hl2bd

18、33，和 hl2bd40）分別插在 cmv 載體，c2-h1，為病毒接種實(shí)驗(yàn)。無(wú)壞死癥狀觀察到col-0巾的植物感染的c2-hl-hl2bd40o c, cmv積累水平。elisa進(jìn)行分析cmv積a 12mock cmv yc2-hi yih2y30mockcmv.yflylh2y3inoculated leafupper leaf閣4.過(guò)氧化氫酶的活性，轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)的cmv感染的col-o梢物。在cmv-y，mock-和y1h2y3-a，過(guò)氧化氫酶活接種的楨物是通過(guò)測(cè)呈在降低來(lái)測(cè)定a240在10 dpi的。過(guò)氣化氫酶的活性表示為亳摩爾 min21 mg2i蛋白。熏1z三次被完成。誤差棒re

19、presentseof的手段。c2-h1缺乏整個(gè)2b。b，catccat1,cat2和cat3）的表達(dá)水平在col-0中的植物接種y1h2y3被確定模擬和cmv接種后定量rt-pcr2周。錯(cuò)誤酒吧rcprcsentse三次重復(fù)。c，免疫印跡分析足使用特異性抗cat3抗體進(jìn)行?？偟鞍滋崛≡赾mv 接種葉在4 dpi與從上葉在4和7 dpi的。需耍注意的是兒乎沒(méi)冇差別，在cat3的mock和cmv接種梢物2間的表達(dá)水平，表明cmv不影響cat3積累。為了弄清楚擬南芥過(guò)氧化氫酶的mrna基因水平（cat1-cat3） cmv感決 明顯下降，我們測(cè)量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄（rt） -pcr,并發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有影響對(duì)于任

20、何過(guò)氧 化氫酶的基因的mrna水平（圖4b）。western blots使用cat3特異性抗體印跡 表明cat3也未在蛋白質(zhì)水平（圖改變。4c）。為了檢查2b是否是通過(guò)y1h2y3 壞死誘導(dǎo)col-0葉子的決定因素，我們用轉(zhuǎn)基因擬南芥植物表達(dá)hl2b基因 （col-hl2b;圖5）。在這些轉(zhuǎn)基因系，我們通過(guò)免疫印跡分析使用抗2b抗體， 證實(shí)2b 了的積累（圖5b）。三轉(zhuǎn)基因株系開(kāi)發(fā)壞死的葉苗期聯(lián)同h2o2,就像觀察到的cmv感染的葉子（圖5c）。這些結(jié)果表明，在col-0葉上表達(dá)2b單 獨(dú)通過(guò)產(chǎn)生h2o2導(dǎo)致壞死，類似于在cmv觀察到的感染擬南芥過(guò)程。我們還 在col-hl2b植物中測(cè)量過(guò)氧化

21、氫酶的活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶在所奮活動(dòng)確實(shí)比 非轉(zhuǎn)基因植物低，過(guò)氧化氫酶的活性減少50% （圖5d）。acol-hl2bwri i nr ilirw*6lin<-7col-hl2bcol-hi 2b閣5.壞死的誘導(dǎo)和h2o2代轉(zhuǎn)基因col-0屮捎物表達(dá)hl2b。在轉(zhuǎn)基因的葉子，壞死癥狀捎物表達(dá)hl2b（col-hl2b）。wt，野生型col-0屮。b，在轉(zhuǎn)基因楨物第2b蛋白質(zhì)的西方印跡分析?？偟鞍祝?0亳克），這是從col-0中（wt）萃取，巨細(xì)胞病毒感染葉（y1h2y3）,和col-hl2b （線路1，6和7），通過(guò)分離sds-page和印跡到聚偏二氟乙烯膜。然后將印跡用抗2b中進(jìn)行免疫

22、檢測(cè)抗體。c，檢測(cè)h2o2在使用/ col-hl2b線過(guò)氧化氫敏感熒光探針h2dcfda。需要注意的足壞死從轉(zhuǎn)基因植物收獲的葉片邊緣是與熒光點(diǎn)冇關(guān)。葉收獲并拍照無(wú)論采用明視場(chǎng)光學(xué)顯微鏡（bf）或熒光顯微鏡（h 2 o 2）。研發(fā)，在col-hl2b線過(guò)氧化氫酶的活動(dòng)。過(guò)氧化氫酶的活性如對(duì)于圖4來(lái)確定。因此，我們認(rèn)為，2b在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的表達(dá)引起在過(guò)氧化氫酶的活性的降低，這可能引起過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致壞死。hl2b與cat3在col-0細(xì)胞中相互作用與改變cat3細(xì)胞定位 確認(rèn)雙雜交的進(jìn)-步的結(jié)果測(cè)定，并確定是否hl2b同伙與cat3在col-0細(xì)胞，我們?cè)诂F(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的duolink鄰近連接測(cè)定

23、（pla）, 一個(gè)方法來(lái)檢測(cè)采用 可視化兩個(gè)主要的抗體蛋白和量化特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的在原處 （因此"derberg等人，2008）。根據(jù)該試驗(yàn)的原則，只有當(dāng)兩個(gè)靶蛋白是帶熒光 信號(hào)彼此接近來(lái)檢測(cè)。col-0屮的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)hl2b，cat3與 flag 標(biāo)簽（cat3-flag）和 gfp （控制）。在帶 hl2b+cat3-flag 轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞，強(qiáng)熒光信號(hào)中的核分別定位（圖6a）,而在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到任何一 個(gè)單獨(dú)信號(hào)的質(zhì)粒，表明2b-cat相互作用是在細(xì)胞核。同比較hl2b-cat3的 互動(dòng)，我們比較得到y(tǒng)2b和cat3之間較弱的信號(hào)，表明y2b結(jié)

24、合比hl2b到 cat3更弱（參考圖。s2）。觀察發(fā)現(xiàn)這是一致的，cmv-y沒(méi)有引起壞死的擬南 芥一樣強(qiáng)烈稱為cmv-hl那樣（圖1 ）。2b和cat3的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析通過(guò) 使用一個(gè)在pla中的單個(gè)識(shí)別方法初級(jí)抗體。我們調(diào)查2b和cat3之間是否相 互作用改變了原來(lái)的2b或cat3定位。在轉(zhuǎn)染的原生質(zhì)抗-flag抗體與單純 cat3, flag, cat3信號(hào)通過(guò)可視化胞漿擴(kuò)散（圖6b）。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染hl2b+ cat3-flag,在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均未檢出cat3信號(hào)，圖2b最初被定位（圖6, b和c）,提示該cat3被易位到與2b核上。我們還使用y2b代替獲類似結(jié)果 的hl2b,這表明2

25、b的蛋白質(zhì)通常在體內(nèi)與cat3相互作用，盡管它們相互作用 的強(qiáng)度不同（參考圖。s2）。a interaction between hl2b and cat3mock cat3-f lagtx2 inurgcuv tx2 mergehl2b + ct3-rlag 5flv tx2 mergesubcellular localization of hl2b1 il2bcat3-flagi il2b + cat3-flagplanl phvsiol vol 156, 2011zrsubcellular localization of cat3-flagiil2bcat3-flac,圖6.在hl2b和

26、原位之間的關(guān)聯(lián)cat3在擬南芥細(xì)胞。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)hl2b, cat3, flag,或hl2b+cat3-flag。bf表示與觀察到的圖像明視場(chǎng)光學(xué)顯微鏡。原少質(zhì)體細(xì)胞核利川赫斯特33342染色顯現(xiàn)和uv光（紫外線）。為了檢測(cè)原位分子互動(dòng)，duolink原位解放軍套件被使用。hl2b和之間，互動(dòng)cat3。抗flag初級(jí)抗體和cmv 2b屮分別檢測(cè)cat3和2b分別。通過(guò)炎光顯微鏡，解放軍來(lái)徳克薩斯州紅（tx2）紅色信號(hào)，理論上將被檢測(cè)到吋，才會(huì)有一個(gè)在體內(nèi)相互作用間2b和cat3。紫外線的圖像和tx2被合并（合并列），以確定信號(hào)的精確定位。b,亞細(xì)胞cat3-標(biāo)志的原生質(zhì)體的定位。使用抗flag抗

27、體cat3檢測(cè)作為tx2的紅色信兮，需要注意的足cat3足在核檢測(cè)到hl2b表達(dá)與cat3基因，而該蛋白質(zhì)分散在細(xì)胞無(wú)hl2b。c，亞細(xì)胞hl2b的原生質(zhì)體的定位。hl2b是使川抗2b的抗體檢測(cè)，這產(chǎn)生a yiii2y3-infcctcd wthne4yui2y3- infcacd col-catline6iine7yih2y3-infectedyih2y3- intccicd col-catimc4 iinc6 iiivc7rff> ? mll> 1112 ii u is 161?davs after y1h2y3 inoculationr col乂:at iine4 -*-co

28、l<at ii"e6 cow：ai lincl圖7.cat轉(zhuǎn)基因表征（行4, 6，和7）楨物接種y1h2y3。a,壞死延遲col-cat轉(zhuǎn)基閔植物與野生型col-0中（wt） 10 dpi的比較。b,檢測(cè)過(guò)氣化氫在控制和col-cat植物接種yih2y3運(yùn)用h2dcfda。葉收獲往10dpi的拍照無(wú)論是明視光學(xué)顯微鏡（bf）,或通過(guò)熒光顯微鏡（h2o）。c，在控制壞死的癥狀發(fā)展和col-cat轉(zhuǎn)基因（行4, 6,和7）的植物。癥狀的植物的百分?jǐn)?shù)用10株為每個(gè)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行丫計(jì)算。cat3過(guò)表達(dá)増強(qiáng)耐cmv感染抗性我們發(fā)現(xiàn)，病毒蛋白（2b）與體內(nèi)宿主蛋白（cat3）的相互作用，我們

29、研 究cat3的表達(dá)是否不僅影響cmv2b （如癥狀外觀）在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。為 了獲得過(guò)表達(dá)cat3基因的擬南芥植物，我們使用ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化col-0植物， 其中cat3基因的控制之下插入35s啟動(dòng)子。最終選擇了三個(gè)正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因 （4，6和7）,做接種實(shí)驗(yàn)（參考圖。s3）。通過(guò)western印跡分析，我們證實(shí) 了 cat3在這些轉(zhuǎn)基因植物里有所增強(qiáng)。相同水平的三個(gè)cat3下，過(guò)氧化氫酶的活性也有所增加（參考圖s3）。當(dāng)這些轉(zhuǎn)基因株系接種y1h2y3后，在10 dpi, 轉(zhuǎn)基因植物并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)壞死，相反非轉(zhuǎn)基因植物與h2o2相關(guān)聯(lián)的有明顯壞死gfp cat3 cat3gfp cat3 ca

30、t3閣8.cat3和hl2b對(duì)細(xì)胞之間的相互作用的效應(yīng)死亡的擬南芥col-0屮原生質(zhì)體。對(duì)于a，比例細(xì)胞死亡轉(zhuǎn)染col-0原生質(zhì)體在20小時(shí)轉(zhuǎn)染gfp后（對(duì)照，10亳克），hl2b （5毫克）+ gfp （5亳克），綠色熒光蛋白（5毫克）+ cat3 （5毫克），或hl2b （5毫克）+ cat3 （5毫克）。由evans藍(lán)染色的細(xì)胞記為死亡。數(shù)據(jù)是細(xì)胞死亡后的百分比控制百分?jǐn)?shù)減去背蟥。誤差棒represemse的三次重復(fù)的裝置。在裝置的不同進(jìn)行了評(píng)價(jià)用t檢驗(yàn);在1%的水平上敁茗。b，過(guò)氧化氫酶在col-0中原生質(zhì)體的活動(dòng)轉(zhuǎn)gfp （對(duì)照組），hl2b+綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白+cat3,或

31、hl2b+cat3在轉(zhuǎn)染后2（）小時(shí)。活動(dòng)用分光光度法測(cè)定。誤差線representse的裝置的三個(gè)熏復(fù)。組間差異手段是采用t檢驗(yàn)評(píng)估；*在5°%的水平上顯著。癥狀（圖7中的a和b）。另外，相比統(tǒng)計(jì)分析的非轉(zhuǎn)基因梢物壞死顯著延遲，但所有植物最終都出現(xiàn)壞死，結(jié)果顯示cat3水平升高只延遲壞死的發(fā)作（圖7c）。在原生質(zhì)體里cat3表達(dá)折中2b所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 為了確定hl2b細(xì)胞表達(dá)水平是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，我們使用了擬南芥原生質(zhì)體系統(tǒng)驗(yàn)證，這是我們以前開(kāi)發(fā)分析誘導(dǎo)蕪菁花葉病毒過(guò)敏反應(yīng)樣細(xì)胞死亡 （kim等人，2010）。當(dāng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染的ti質(zhì)粒表達(dá)hl2b，細(xì)胞死亡的百分比 顯著增加。然

32、而，加入ti質(zhì)粒表達(dá)cat3否定細(xì)胞死亡由hl2b （圖8a）誘導(dǎo)引起。hl2b的共表達(dá)和cat3導(dǎo)致過(guò)氧化氫酶的活性降低（圖8b）。因此，這 些結(jié)果表明，通過(guò)清除cat3, hl2b可以誘導(dǎo)結(jié)合cat3和損害的過(guò)氧化氫酶 使細(xì)胞死亡，而il該hl2b-cat3相互作用部分損害了 h2o2。cat3對(duì)2b的沉默抑制活性和cmv在原生質(zhì)體的積累水平圖9a示出了增強(qiáng)cat3水平至少耍等到7 dpi使轉(zhuǎn)基因株系抑制cmv增殖。 然而，在14 dpi，非轉(zhuǎn)基因控制植物達(dá)到cmv水平。這些結(jié)果表明cat3在病 毒感染的初始階段過(guò)度表達(dá)可能會(huì)賦予部分耐受。我們假設(shè)cat3可通過(guò)滅活 2b的rss活性與2b

33、結(jié)合，從而抑制cmv增殖。研究2b中cat3對(duì)rss活性 的影響，我們使用了我們先前原牛.質(zhì)體法以衡量在細(xì)胞病毒rss活動(dòng)（志村等 人，2008）。如圖9b所示，cat3表達(dá)rss活動(dòng)實(shí)際減少由30%至40°%，但它 并不影響男一病毒rss, p19o與此相反，cmv感染沒(méi)有下調(diào)cat3;當(dāng)非轉(zhuǎn)基因 植物上接種cmv,病毒感染無(wú)論是在mrna或蛋白質(zhì)水平都沒(méi)有影響cat3（圖 4）。2b與cat3的結(jié)合是非常重要的對(duì)于細(xì)胞死亡，但是cat3核易位并不如 此最后，為了回答這個(gè)問(wèn)題，其中重要的是2b誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，所述2b與 cat3的結(jié)合或cat3隨后易位到核，我們創(chuàng)建了一個(gè)突變hl2

34、b （hl2bdnls） 的缺乏其核定位信號(hào)（nls1和nls2;圖10a）。然后，我們進(jìn)行原生質(zhì)體實(shí)驗(yàn)， 觀察細(xì)胞死亡和cat3和hl2bdnls的定位。原位pla揭示了，無(wú)論是 hl2bdnls或者cat3是定位于細(xì)胞核，兩種蛋白質(zhì)相互結(jié)合（圖10，b-d）。 如圖10e, hl2bdnls仍然可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作為有效作為地道的hl2b。因此， 這些結(jié)果表明，2b與cat3結(jié)合是很重要的，可以抑制過(guò)氧化氫酶的活性。討論病毒因子和主機(jī)之間的直接互動(dòng)因子癥狀感應(yīng)許多試圖尋找必要的病毒復(fù)制和移動(dòng)的宿主因素，這實(shí)際行為病毒蛋白，己 經(jīng)作出澄清的分子機(jī)制用于病毒致病性。例如，石橋等人的審查。（201

35、0）， 更超過(guò)10宿主因子的煙草花葉病毒的增殖己經(jīng)確定了。2.5 21.5 10.50 col.0 col cat iine4col cat lineb icol cat iine7714(i mg) (3 gg)ca13 cats (1 hg) (3 mg)圖9.增強(qiáng)抗cmv由cat3表達(dá)原生質(zhì)體和col-cat轉(zhuǎn)®因植物。cat3表達(dá)的，效果上y1h2y3在col-cat植物的積累。定覺(jué)rt-pcr力*法檢測(cè)cmv的col-cat的積累轉(zhuǎn)基因植物接種y1h2y3。值進(jìn)行歸使用將b微管蛋白基因的mrna水平。對(duì)于價(jià)值非轉(zhuǎn)col-0屮的梢物在4 dpi的設(shè)定為1.（）。的值代表焚置w

36、ithse三次熏復(fù)獲得。在手段的差異組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)；*在5%的水平上顯著。b，cat3過(guò)表達(dá)對(duì)hl2b的rss活性。n.木塞姆氏的原生質(zhì)體共轉(zhuǎn)染的pbi-fluc （0.3毫克），pe-與rluc （0.03毫 克），dsfluc （0.03毫克），和病毒抑制（hl2b或p19;質(zhì)粒的3毫克）與cat3 （0，1 一起，和3mg質(zhì)粒）。gfp （3毫兌）用作對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后20小吋，flue活動(dòng)處理過(guò)的原生質(zhì)體進(jìn)行測(cè)定。fkic活性則分通過(guò)與rluc活性，以及用于模擬處理的值設(shè)定為1.0。該值表示的手段withsdfrom三次ffi復(fù)。需耍注意的是此外cat3下降hl2b的rss活動(dòng)，

37、但并沒(méi)有影響該p19的。這些因素在病毒的致病性作用以及病毒乘法，用作宿主范圍或癥狀決定因素 是確定的。也有許多報(bào)道描述在細(xì)胞生理學(xué)的擾動(dòng)期間癥狀間接變型的植物，如 相互作用宿主因素的病毒rss對(duì)主機(jī)rna沉默機(jī)械，不僅用于防御病毒也用于 植物發(fā)育。例如，cmv2b蛋白可以干擾ago1蛋白沉默rna結(jié)合到宿主，從anf 1 iv ty?餅subcellular localization of f3 f1.ag hl2banlsk：at3-flagbf uv 1x2 mergesubcellular localization of hi,2bam .s hl2banlsk?atvflagrf i

38、iv i y mpropqsop 118 c332us.kl而導(dǎo)致干擾微rna定向生理cmv組感染植物（zhang等人，2006）。但是，也 有少數(shù)報(bào)告病毒與宿主之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制，病毒蛋白的直接作 用和特定宿主的內(nèi)部函數(shù)干擾因子都由癥狀表型不同來(lái)表現(xiàn)。zhu等人（2005） 研究中，證明p2蛋白質(zhì)之間的水稻矮縮病毒（rdv）和水稻（oryza saliva） entkaurene氧化酶有直接互動(dòng)，它在生物合成中通過(guò)gas發(fā)揮作用;這種相互作 用導(dǎo)致激素降低，被感染的植物發(fā)育遲緩。更有趣的是，他們還提出一種可能性， 即互動(dòng)實(shí)際上可能會(huì)降低植物抗毒素的生物合成并使植物更加合適病毒復(fù)制，這 表明相互作用顯然對(duì)病毒有利。我們提供更interaction betweenhl2banls and cat3hl2hanlsk?at3-flag圖10.cat3fll細(xì)胞的細(xì)胞定位在原1:質(zhì)體轉(zhuǎn)染死亡誘導(dǎo)hl2bdnls。的，示意圖hl2bdnls。該突炎體的缺失2核定位信號(hào)（nls1和nls2）。氨基酸，氨基酸。b,在hl2bdnls和cat3之間原位協(xié)會(huì)在擬南芥細(xì)胞。從原生質(zhì)體屮分離col-0屮的植物轉(zhuǎn)染hl2bdnls+ cat3和20小時(shí)后收獲。在tx2信號(hào)只有理論上檢