直接從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中簡(jiǎn)單高效固定胞外組氨酸標(biāo)記的酶作為有活性的

1、蛋白質(zhì)純化翻譯 姓名：楊峰 學(xué)號(hào)：102061413 班級(jí)：釀酒1401直接從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中簡(jiǎn)單高效固定胞外組氨酸標(biāo)記的酶作為有活性的,可回收的納米催化劑:高性能的從廢油脂中生產(chǎn)生物柴油 新加坡國(guó)立大學(xué)化學(xué)與生物分子工程 摘要:一種不需要酶的預(yù)純化的簡(jiǎn)單固定胞外酶方法取得了很大發(fā)展. 固定胞外His標(biāo)記的脂肪酶（His-TLL）的親和力是通過(guò)用巴氏畢赤酵母（h-TLL）的細(xì)胞培養(yǎng)上清液直接處理包含長(zhǎng)臂鎳 - 次氮基三乙酸表面基團(tuán)（Ni-NTA-MNP）的核 - 殼結(jié)構(gòu)的氧化鐵磁性納米顆粒.讓酶有高活性,專(zhuān)一性和高效的催化效率.用納米生物催化劑His-TLL-MNPs催化一罐廢油脂轉(zhuǎn)化為生物柴

2、油的轉(zhuǎn)化效率為94%,顯示出優(yōu)越的回收性能. Ni-NTA-MNPs容易從循環(huán)到生物催化劑中再生并且可以反復(fù)用于酶的固定.通過(guò)從P. pastoris (h-CALB)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中固定胞外His標(biāo)記的南極洲假絲酵母脂肪酶B(His-CALB)證明這種方法是通用的.關(guān)鍵詞:酶的固定 胞外酶 磁性納米顆粒 油脂 生物柴油 脂肪酶 酶催化作用以及成為可持續(xù)生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品和聚合物的重要綠色工具.固定化酶可以提高穩(wěn)定性并且通過(guò)酶的回收降低酶的成本.因此,越來(lái)越多的固定化技術(shù)發(fā)展起來(lái)了.其中,把酶固定在功能性的磁性納米顆粒上作為納米生物催化劑吸引了很多注意,因?yàn)榇判约{米顆粒獨(dú)一無(wú)二的性能,比如表面積與體

3、積比很大,高分散性且傳質(zhì)限制較小,容易進(jìn)行磁分離.目前,大多數(shù)固定化酶方法都要求預(yù)純化,但這個(gè)過(guò)程都很貴而且低效.對(duì)于胞外酶來(lái)說(shuō),這個(gè)操作更加困難,因?yàn)楸磉_(dá)的胞外酶在細(xì)胞培養(yǎng)液中的濃度很低.因此,開(kāi)發(fā)從細(xì)胞培養(yǎng)液上清液直接固定胞外酶而不進(jìn)行預(yù)純化的簡(jiǎn)單有效方法是十分必要的.因此,我們要報(bào)道的方法是,先用組氨酸標(biāo)記物標(biāo)記目標(biāo)胞外酶,然后用表面含有Ni-NTA的MNPs作為載體,通過(guò)親和力直接從細(xì)胞培養(yǎng)液上清液高度特異性的吸附組氨酸標(biāo)記過(guò)的胞外酶.所得到的納米生物催化劑是有活性和可回收的,并且Ni-NTA-MNPs可以直接從用過(guò)的納米生物催化劑中再生. TLL被選中作為目標(biāo)胞外酶去證實(shí)簡(jiǎn)單固定方法

4、和實(shí)際應(yīng)用中的固定化酶.已知TLL能催化植物油和甲醇的脂交換用于生產(chǎn)生物柴油,一種清潔的和可再生的取代石油的柴油.然而植物油是可以食用的而且貴.最近,廢油脂已經(jīng)成為生產(chǎn)生物柴油的有吸引力的原料,因?yàn)樗豢墒秤枚伊畠r(jià).由于廢油脂的高游離脂肪酸,常規(guī)的堿催化過(guò)程不再適用了.涉及FFA的酸催化脂化和隨后的甘油三脂的堿催化酯交換的兩步法失效了.為了高效的將廢油脂轉(zhuǎn)化成生物柴油,我們不斷努力的開(kāi)發(fā)一種一步式酯化和酯交換工藝.固定化的脂肪酶被證明是適合這個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程的.然而酶純化的要求已經(jīng)變成了一個(gè)阻礙發(fā)展合算的酶固定方法和廢油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油技術(shù)的瓶頸.圖像一: 從細(xì)胞培養(yǎng)液上清液直接固定胞外酶到納米磁

5、性顆粒上, 用納米生物催化劑的生物轉(zhuǎn)化和再循環(huán)以及從使用的催化劑再生Ni-NTA-MNP。圖像二:a細(xì)胞生長(zhǎng)，蛋白質(zhì)分泌和酶活性.補(bǔ)料分批培養(yǎng)期間巴氏畢赤酵母（h-TLL）在生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度（），體積活性（）和蛋白質(zhì)濃度（）。箭頭表示用于蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的甲醇的連續(xù)進(jìn)料的起始時(shí)間點(diǎn)。 （b，c）使用Ni-NTA-MNP以不同比例（w / w）的MNP與總蛋白（His-TLL：60）從室溫和pH 5.5的培養(yǎng)物上清液同時(shí)純化和固定His-TLL的關(guān)鍵性能參數(shù): （b）特異性酶負(fù)載量（）和酶加載效率（），（c）比活性（）和總活性回收率（）。數(shù)據(jù)是來(lái)著三分實(shí)驗(yàn)的具有偏差的平均值. （d）His-TL

6、LMNPs的FESEM圖像。 為了證明固定化方法,通過(guò)方案1中所示的途徑合成Ni-NTA-MNPs.根據(jù)公開(kāi)的方法,合成含有氧化鐵核和甲基丙烯酸縮水甘油酯殼的PGMAMNP,然后用長(zhǎng)鏈二胺官能化得到TDA_MNP.將長(zhǎng)臂引入MNP的表面上是為了提供更多的空間和靈活性.以讓酶被附著時(shí)仍能保持活性,然后引入醛基形成GA_MNPS,與N-雙（羧甲基）-L-賴(lài)氨酸水合物和隨后的氯化鎳的進(jìn)一步反應(yīng)把PGMAMNP變成Ni-NTA-MNP, 產(chǎn)率為83%.通過(guò)TEM,FESEM和DLS表征得到在每個(gè)步驟中合成的MNP的尺寸和形態(tài).所有MNPs顯示球殼結(jié)構(gòu)和窄分散性。通過(guò)工程化包含pPICZA-His-TL

7、L質(zhì)粒的巴斯德畢赤酵母（h-TLL）和在生物反應(yīng)器中高細(xì)胞密度培養(yǎng)產(chǎn)生胞外His標(biāo)記的脂肪酶（His-TLL）.如圖2a所示, 細(xì)胞在第一個(gè)13.5小時(shí)處于滯后期，之后達(dá)到對(duì)數(shù)期，在23小時(shí)細(xì)胞密度到達(dá)25g cdw / L. 在該點(diǎn)，觀(guān)察到DO值的突然升高, 這意味著作為碳源的甘油受到了限制. 通過(guò)在23小時(shí)加入甲醇開(kāi)始蛋白質(zhì)誘導(dǎo), 導(dǎo)致蛋白質(zhì)濃度和培養(yǎng)上清液活性逐漸增加。誘導(dǎo)13小時(shí)后,單位體積的活性開(kāi)始以一個(gè)恒定且很大的比列增加. 在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（67h）,單位體積的活性達(dá)到2.47 U/mL, 蛋白質(zhì)濃度為0.6 mg/mL,細(xì)胞密度為73.3 gcdw/L. 在不同時(shí)間點(diǎn)取得的細(xì)胞培養(yǎng)

8、物上清液的SDS-PAGE（圖S7）顯示誘導(dǎo)后His-TLL（在35kDa處）的表達(dá)水平的明顯上升,在67小時(shí)時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中形成了很多His-TLL.從一小部分67小時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化出來(lái)的His-TLL,可推導(dǎo)出His-TLL的表達(dá)水平占總細(xì)胞外蛋白的60.方案一: 合成Ni-NTA-MNPs和制備納米催化劑His-TLL-MNPs的路線(xiàn) 在無(wú)法通過(guò)His標(biāo)簽和Ni-NTA功能之間的親和性來(lái)選擇性固定His-TLL之后，將Ni-NTA-MNP加入到培養(yǎng)了67小時(shí)的培養(yǎng)物上清液中. 在不同條件下進(jìn)行固定，并通過(guò)固定前后上清液中的His-TLL含量計(jì)算酶負(fù)載效率。讓培養(yǎng)物上清液中的MN

9、Ps與總蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為12：1,然后觀(guān)查 2-8小時(shí), 沒(méi)有觀(guān)察到對(duì)固定存在顯著影響。顯然，由于高親和力,2小時(shí)的孵育時(shí)間足以完成固定.我們也研究了溫度的影響. 當(dāng)溫度從4升至25時(shí)，特異性酶負(fù)載從27.9mg / g至43.5mg / g,酶負(fù)載效率從53增加至89（圖S4）。當(dāng)溫度從25進(jìn)一步增加到35,兩種性能參數(shù)的增加程度小了很多. 因此，我們選擇室溫來(lái)進(jìn)行后面的固定實(shí)驗(yàn)。在室溫下,在2小時(shí)內(nèi)觀(guān)察不同質(zhì)量比的MNPs和總蛋白質(zhì)對(duì)固定化的影響。如圖2b，c所示，當(dāng)MNPs和總蛋白質(zhì)的比例從8:1增加至14:1時(shí),特定酶負(fù)載幾乎線(xiàn)性地從54降低至38mg / g MNP，而酶負(fù)載效率從7

10、5線(xiàn)性增加至95. 因?yàn)楦嗟念w粒被使用了。當(dāng)比率從8:1至12:1的增加,通過(guò)用p-NPB測(cè)定5分鐘固定化酶的活性,發(fā)現(xiàn)酶活從6.8 U / mg幾乎線(xiàn)性地增加至8.3 U / mg. 而且總酶活性的回收率從71提高至106. 略高于100的活性回收率可能是由于固定后酶活性的輕微增加。MNPs與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比從12:1至14:1的進(jìn)一步增加沒(méi)有進(jìn)一步提高酶活性回收率和酶的活性。由兩個(gè)關(guān)鍵性能的參數(shù)表現(xiàn)。MNPs與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比為12：1似乎是合適的. 這些固定化實(shí)驗(yàn)在pH5.5下進(jìn)行，并在該pH下培養(yǎng)細(xì)胞。檢查其它pH值下固定化表現(xiàn).。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液調(diào)節(jié)至pH8.0，讓MNPs與蛋白質(zhì)的比

11、例為8：1在室溫下固定2小時(shí). 在這種條件下特定酶負(fù)載達(dá)到了61mg / g MNP，酶負(fù)載效率為84，His-TLL的酶活性為8.3U / mg和酶活性回收率是百分之百（表S1）. 與pH 5.5相比，這些關(guān)鍵性能參數(shù)更好。考慮在較少M(fèi)NP和中性pH條件下的優(yōu)點(diǎn)，選擇質(zhì)量比為8：1（w / w）的MNP與蛋白質(zhì)和8.0的pH作為酶固定的最佳條件.培養(yǎng)物上清液從1毫升放大至10毫升. 結(jié)果62mg / g特定酶負(fù)載為 MNP，酶負(fù)載效率85，His-TLL,比活性為8.2U / mg和活性回收率為100（表S1）。這些關(guān)鍵性能指標(biāo)幾乎與1 mL規(guī)模中獲得的相同，這證明了使用該方法進(jìn)行大規(guī)模酶固

12、定化的適用性。通過(guò)FESEM來(lái)分析His-TLL-MNPs納米載體。如圖2d所示，His-TLL-MNP是直徑為80nm的均勻球形顆粒，其略大于Ni-NTA-MNP（63nm，通過(guò)TEM）。在His-TLL-MNPs和Ni-NTA-MNP（圖S5）的FTIR光譜中，表面上的NTA基團(tuán)在3400cm -1（OH）處具有特征寬吸收，在1725cm -1 C=O有強(qiáng)吸收帶）.用SDS-PAGE（圖S7）來(lái)確認(rèn)Ni-NTA-MNP是否選擇性固定His-TLL。固定化后，上清液在35kDa處的蛋白條帶顯著降低。用10mM咪唑洗滌納米生物催化劑His-TLL-MNP，沒(méi)有洗掉蛋白質(zhì)。用250mM咪唑進(jìn)一步

13、洗滌納米生物催化劑.His-TLL在洗脫的SDSPAGE中產(chǎn)生35kDa的蛋白質(zhì)單條帶。這表明只有His-TLL連接在Ni-NTA-MNP上圖3.（a）通過(guò)使用納米生物催化劑His-TLL-MNP來(lái)實(shí)現(xiàn)FFA的同時(shí)酯化和TG與甲醇的酯交換將廢油脂轉(zhuǎn)化為生物柴油. （b）在重量%比3（），4（）和5（×）負(fù)載下使用納米生物催化劑His-TLL-MNP，將廢油脂（1g）生物轉(zhuǎn)化成生物柴油的時(shí)程, 分別在50逐步加入甲醇（在0,2和6小時(shí)，每次用63L）。（c）在5重量催化劑負(fù)載和50條件下，通過(guò)逐步添加甲醇（參見(jiàn)部分b）在24小時(shí)用His-TLL-MNPs將廢油脂（1g）生物轉(zhuǎn)化成生物柴

14、油的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的His-TLL-MNPs的回收和再利用. 在b和c中的所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行了三次，數(shù)據(jù)是具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值.用His-TLL-MNP通過(guò)FFA的同時(shí)酯化和甘油三酯與甲醇的酯交換從含有24重量FFA的廢油脂生產(chǎn)生物柴油（圖3a）。研究溫度和甲醇添加以進(jìn)行有效的生物轉(zhuǎn)化。在30-50下使用1g廢廢油脂和50mgHis-TLL-MNP,逐步（63L×3）或一次（189L）添加甲醇反應(yīng)24小時(shí). 在反應(yīng)系統(tǒng)中加入硅膠微珠（20重量）以通過(guò)吸收水提高FAME產(chǎn)率. 通過(guò)GC分析（圖S6）確定FAME產(chǎn)率，結(jié)果在表1中給出.一次加入甲醇（條目3,40）得到74FAME產(chǎn)率，而逐步

15、加入甲醇（條目2,40）得到81FAME產(chǎn)率. 產(chǎn)量增加是由于通過(guò)逐步添加甲醇降低了對(duì)酶的毒性. 在逐步加入甲醇時(shí)，F(xiàn)AME產(chǎn)率從40（條目2）的81增加至50（條目4）的94.顯然，50對(duì)于該反應(yīng)是更好的. 在50下,在相同的酶負(fù)載下和相同的轉(zhuǎn)化率下檢測(cè)游離TLL，同時(shí)逐步加入甲醇，得到92FAME產(chǎn)率. 因此，在脂肪的生物轉(zhuǎn)中,His-TLL-MNP甚至顯示出比游離TLL稍微更高的產(chǎn)率. 在50下檢查不同的催化劑負(fù)載; 生物轉(zhuǎn)化的時(shí)間進(jìn)程在圖3b中給出。在5重量催化劑負(fù)載下實(shí)現(xiàn)最高的FAME產(chǎn)率（94）; 在3和4重量催化劑負(fù)載下，也分別以87和89產(chǎn)率獲得FAME. 在3重量催化劑負(fù)載下

16、將油脂轉(zhuǎn)化為FAME的前20分鐘內(nèi)的平均比活性測(cè)定為10.5U / mg His-TLL或0.6U / mg His-TLLMNPs. 在這些生物轉(zhuǎn)化中，通過(guò)滴定測(cè)定，沒(méi)有FFA保留在最終反應(yīng)混合物中. 通過(guò)1g廢油脂和甲醇（63L×3）與50mg His-TLL-MNP和0.2g硅膠微珠在50下反應(yīng)24小時(shí)來(lái)檢查納米生物催化劑His-TLL-MNPs的可回收性. 每批后，通過(guò)使用磁體從反應(yīng)混合物和硅膠中分離納米生物催化劑His-TLL-MNP. 洗滌催化劑并將其重新用于在相同條件下的下一批油脂生物轉(zhuǎn)化為生物柴油. 如圖3c所示，納米生物催化劑的可回收性是優(yōu)異的，在第七個(gè)循環(huán)中保持9

17、7的生產(chǎn)率. 我們發(fā)現(xiàn)納米生物催化劑的高可回收性可部分歸因于MNP容易恢復(fù)并幾乎可以完全恢復(fù). 另一個(gè)原因是酶對(duì)MNP的強(qiáng)親和力附著，在生物轉(zhuǎn)化和再循環(huán)實(shí)驗(yàn)期間沒(méi)有產(chǎn)生可檢測(cè)的酶滲漏. 此外，固定化酶是高度穩(wěn)定的，如在循環(huán)實(shí)驗(yàn)期間的7天的反應(yīng)中所證實(shí)的，沒(méi)有酶生產(chǎn)力的顯著損失. 納米生物催化劑的再循環(huán)和再利用可以顯著降低催化劑的成本，并因此降低生物柴油的生產(chǎn)成本.還檢查了從His-TLL-MNP再生Ni-NTA-MNP的可能性. 在7次總反應(yīng)時(shí)間為7天的生物轉(zhuǎn)化的7個(gè)循環(huán)后回收的納米生物催化劑首先用500mM咪唑洗滌以除去His-TLL. 在用EDTA進(jìn)一步處理以除去咪唑后，用水洗滌MNP并用

18、氯化鎳（II）處理，以100的產(chǎn)率得到Ni-NTA-MNP. 再次使用再生的MNP在確定的最佳條件下從巴斯德畢赤酵母（h-TLL）的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中固定His-TLL，觀(guān)察得到酶負(fù)載效率，活性回收率和特異性酶負(fù)載量為65，80 ，和49mg / g MNPS因此，再生的Ni-NTA-MNPs達(dá)到新合成的Ni-NTA-MNPs的這些關(guān)鍵酶固定性能參數(shù)的80. 由再生顆粒制備的納米生物催化劑的比活性達(dá)到對(duì)于p-NPB水解的8.4U / mg His-TLL，其與由新合成的顆粒制備的納米生物催化劑的比活性相同. Ni-NTAMNsP從使用的催化劑的有效再生和這些MNPs用于酶固定的再利用降低了納米載

19、體的成本.為了證明該固定化方法的一般性，還從細(xì)胞培養(yǎng)物直接固定了胞外His標(biāo)記的南極洲假絲酵母脂肪酶B（His-CALB）,通過(guò)使用與His-TLL相同的程序，用Ni-NTA-MNPs處理巴斯德畢赤酵母（h-CALB）的上清液. 固定化納米生物催化劑His-CALB-MNP具有70mg / g MNP的特異性酶負(fù)載，94酶負(fù)載效率，1.1U / mg His-CALB的特異性酶活性（p-NPB測(cè)定）和93活性恢復(fù)（表S1）. 由于CALB優(yōu)選酯化36，檢查了納米生物催化劑His-CALB-MNPs用于在4.5重量催化劑負(fù)載（基于油脂）和30下12小時(shí)的甲醇的廢油脂的FFA的酯化，提供98的轉(zhuǎn)化率FFA。 分離His-CALB-MNP，然后重新用于FFA的酯化的新循環(huán)，在第八個(gè)循環(huán)中保持98的生產(chǎn)率（圖S8）.總之，通過(guò)使用含有長(zhǎng)臂N 1 -NTA表面基團(tuán)的核 - 殼結(jié)構(gòu)的氧化鐵磁性納米顆粒Ni-NTA-MNP以同時(shí)純化和固定靶His標(biāo)記的酶來(lái)開(kāi)發(fā)用于固定細(xì)胞外酶而不進(jìn)行預(yù)純化的簡(jiǎn)單且有效的方法 既直接從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液通過(guò)親和附著來(lái)實(shí)現(xiàn)固定. 以高產(chǎn)率（83）合成Ni-NTA-MNP