高效液相色譜固定相和流動相

1、高壓液相色譜 HPLC培訓教程（六）IV 固定相和流動相 在色譜分析中，如何選擇最佳的色譜條件以實現(xiàn)最理想分離，是色譜工作者的重要工作，也是用計算機實 現(xiàn)HPLC分析方法建立和優(yōu)化的任務之一。本章著重討論填料基質(zhì)、化學鍵合固定相和流動相的性質(zhì)及其選擇。一、基質(zhì)（擔體）HPLC 填料可以是陶瓷性質(zhì)的無機物基質(zhì)，也可以是有機聚合物基質(zhì)。無機物基質(zhì)主要是硅膠和氧化鋁。無 機物基質(zhì)剛性大， 在溶劑中不容易膨脹。 有機聚合物基質(zhì)主要有交聯(lián)苯乙烯 - 二乙烯苯、 聚甲基丙烯酸酯。 有機 聚合物基質(zhì)剛性小、易壓縮，溶劑或溶質(zhì)容易滲入有機基質(zhì)中，導致填料顆粒膨脹，結(jié)果減少傳質(zhì)，最終使柱 效降低。1基質(zhì)的種類1

2、）硅膠硅膠是HPLC填料中最普遍的基質(zhì)。除具有高強度外，還提供一個表面，可以通過成熟的硅烷化技術(shù)鍵合上 各種配基，制成反相、離子交換、疏水作用、親水作用或分子排阻色譜用填料。硅膠基質(zhì)填料適用于廣泛的極 性和非極性溶劑。缺點是在堿性水溶性流動相中不穩(wěn)定。通常，硅膠基質(zhì)的填料推薦的常規(guī)分析pH范圍為28。硅膠的主要性能參數(shù)有： 平均粒度及其分布。 平均孔徑及其分布。與比表面積成反比。 比表面積。在液固吸附色譜法中，硅膠的比表面積越大，溶質(zhì)的k值越大。 含碳量及表面覆蓋度（率）。在反相色譜法中，含碳量越大，溶質(zhì)的k值越大。 含水量及表面活性。在液固吸附色譜法中，硅膠的含水量越小，其表面硅醇基的活性越

3、強，對溶質(zhì)的吸附作 用越大。 端基圭寸尾。在反相色譜法中，主要影響堿性化合物的峰形。 幾何形狀。硅膠可分為無定形全多孔硅膠和球形全多孔硅膠，前者價格較便宜，缺點是渦流擴散項及柱滲透 性差；后者無此缺點。 硅膠純度。對稱柱填料使用高純度硅膠，柱效高，壽命長，堿性成份不拖尾。2）氧化鋁具有與硅膠相同的良好物理性質(zhì)，也能耐較大的pH范圍。它也是剛性的，不會在溶劑中收縮或膨脹。但與硅膠不同的是，氧化鋁鍵合相在水性流動相中不穩(wěn)定。不過現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了在水相中穩(wěn)定的氧化鋁鍵合相，并 顯示出優(yōu)秀的pH穩(wěn)定性。3）聚合物以高交聯(lián)度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的填料是用于普通壓力下的HPLC它們的壓力

4、限度比無機填料低。苯乙烯-二乙烯苯基質(zhì)疏水性強。使用任何流動相，在整個pH范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以用NaOH或強 堿來清洗色譜柱。 甲基丙烯酸酯基質(zhì)本質(zhì)上比苯乙烯 -二乙烯苯疏水性更強， 但它可以通過適當?shù)墓δ芑揎椬?成親水性的。這種基質(zhì)不如苯乙烯 -二乙烯苯那樣耐酸堿，但也可以承受在pH13下反復沖洗。所有聚合物基質(zhì)在流動相發(fā)生變化時都會出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因為小分子在聚合物基質(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢， 所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性 基質(zhì)。因

5、此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。2基質(zhì)的選擇硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來制成分子排阻和離子交換柱。二、化學鍵合固定相將有機官能團通過化學反應共價鍵合到硅膠表面的游離羥基上而形成的固定相稱為化學鍵合相。這類固定 相的突出特點是耐溶劑沖洗，并且可以通過改變鍵合相有機官能團的類型來改變分離的選擇性。1鍵合相的性質(zhì)目前，化學鍵合相廣泛采用微粒多孔硅膠為基體，用烷烴二甲基氯硅烷或烷氧基硅烷與硅膠表面的游離硅醇基反應，形成 Si-O-Si-C 鍵形的單分子膜而制得。硅膠表面的硅醇基密度約為5個/nm2,由于空間位阻效

6、應（不可能將較大的有機官能團鍵合到全部硅醇基上）和其它因素的影響，使得大約有4050%的硅醇基未反應。殘余的硅醇基對鍵合相的性能有很大影響，特別是對非極性鍵合相，它可以減小鍵合相表面的疏水性，對 極性溶質(zhì) （特別是堿性化合物） 產(chǎn)生次級化學吸附， 從而使保留機制復雜化 （使溶質(zhì)在兩相間的平衡速度減慢， 降低了鍵合相填料的穩(wěn)定性。結(jié)果使堿性組分的峰形拖尾）。為盡量減少殘余硅醇基，一般在鍵合反應后，要 用三甲基氯硅烷（TMCS）等進行鈍化處理，稱封端（或稱封尾、封頂，end-capping ），以提高鍵合相的穩(wěn)定性。另一方面，也有些 ODS填料是不封尾的，以使其與水系流動相有更好的”濕潤"

7、;性能。由于不同生產(chǎn)廠家所用的硅膠、硅烷化試劑和反應條件不同，因此具有相同鍵合基團的鍵合相，其表面有機官能團的鍵合量往往差別很大，使其產(chǎn)品性能有很大的不同。鍵合相的鍵合量常用含碳量（C%）來表示，也可以用覆蓋度來表示。所謂覆蓋度是指參與反應的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。pH 值對以硅膠為基質(zhì)的鍵合相的穩(wěn)定性有很大的影響，一般來說，硅膠鍵合相應在 pH=28的介質(zhì)中使用。2鍵合相的種類化學鍵合相按鍵合官能團的極性分為極性和非極性鍵合相兩種。常用的極性鍵合相主要有氰基 (-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)鍵合相。極性鍵合相常用作正相色譜，混合物在極性鍵合相上的分離主要是基于極

8、性鍵合基團與溶質(zhì)分子間的氫鍵作用，極性強的組分保留值較大。極 性鍵合相有時也可作反相色譜的固定相。常用的非極性鍵合相主要有各種烷基(C1C18)和苯基、苯甲基等，以 C18應用最廣。非極性鍵合相的烷基鏈長對樣品容量、溶質(zhì)的保留值和分離選擇性都有影響，一般來說，樣品容量隨烷基鏈長增加而增大，且長鏈 烷基可使溶質(zhì)的保留值增大，并常?？筛纳品蛛x的選擇性；但短鏈烷基鍵合相具有較高的覆蓋度，分離極性化 合物時可得到對稱性較好的色譜峰。苯基鍵合相與短鏈烷基鍵合相的性質(zhì)相似。另外C18柱穩(wěn)定性較高，這是由于長的烷基鏈保護了硅膠基質(zhì)的緣故，但C18基團空間體積較大，使有效孔徑變小，分離大分子化合物時柱效較低。

9、3固定相的選擇分離中等極性和極性較強的化合物可選擇極性鍵合相。氰基鍵合相對雙鍵異構(gòu)體或含雙鍵數(shù)不等的環(huán)狀化 合物的分離有較好的選擇性。氨基鍵合相具有較強的氫鍵結(jié)合能力，對某些多官能團化合物如甾體、強心甙等 有較好的分離能力；氨基鍵合相上的氨基能與糖類分子中的羥基產(chǎn)生選擇性相互作用，故被廣泛用于糖類的分 析，但它不能用于分離羰基化合物，如甾酮、還原糖等，因為它們之間會發(fā)生反應生成Schiff 堿。二醇基鍵合相適用于分離有機酸、甾體和蛋白質(zhì)。分離非極性和極性較弱的化合物可選擇非極性鍵合相。利用特殊的反相色譜技術(shù)，例如反相離子抑制技術(shù) 和反相離子對色譜法等， 非極性鍵合相也可用于分離離子型或可離子化

10、的化合物。ODS(octadecyl silane) 是應用最為廣泛的非極性鍵合相，它對各種類型的化合物都有很強的適應能力。短鏈烷基鍵合相能用于極性化合物 的分離，而苯基鍵合相適用于分離芳香化合物。 另外，美國藥典對色譜法規(guī)定較嚴，它規(guī)定了柱的長度，填料的種類和粒度，填料分類也較詳細，這樣使色譜 圖易于重現(xiàn)；而中國藥典僅規(guī)定填料種類，未規(guī)定柱的長度和粒度，這使檢驗人員難于重現(xiàn)實驗，在某些情況 下還浪費時間和試劑。三、流動相1流動相的性質(zhì)要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。 選好填料(固定相)后，強溶劑使溶質(zhì)在填料表面的吸附減少，相應的容量

11、因子k 降低；而較弱的溶劑使溶質(zhì)在填料表面吸附增加，相應的容量因子k升高。因此，k值是流動相組成的函數(shù)。塔板數(shù)N般與流動相的粘度成反比。所以選擇流動相時應考慮以下幾個方面： 流動相應不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到某些有機相會溶脹或收 縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸 附劑的柱系統(tǒng)。 純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關(guān)，特別是當溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時。 必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時，所用流動相在檢測波長下應沒有吸收，或吸收很小。當使用示差折光檢測器時，應選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶劑

12、作流動相，以提高靈敏度。 粘度要低(應<2cp)。高粘度溶劑會影響溶質(zhì)的擴散、傳質(zhì)，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延 長。最好選擇沸點在 100C以下的流動相。 對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。 樣品易于回收。應選用揮發(fā)性溶劑。2流動相的選擇在化學鍵合相色譜法中，溶劑的洗脫能力直接與它的極性相關(guān)。在正相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強 而增加；在反相色譜中，溶劑的強度隨極性的增強而減弱。正相色譜的流動相通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑。反相色譜的流動相通常以水作基礎溶劑，再加入一定量的能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇、乙腈、四氫

13、呋喃等。 極性調(diào)整劑的性質(zhì)及其所占比例對溶質(zhì)的保留值和分離選擇性有顯著影響。一般情況下， 甲醇- 水系統(tǒng)已能滿足多數(shù)樣品的分離要求， 且流動相粘度小、 價格低， 是反相色譜最常用的流動相。 但 Snyder 則推薦采用 乙腈-水系統(tǒng)做初始實驗， 因為與甲醇相比，乙腈的溶劑強度較高且粘度較小， 并可滿足在紫外185205nm處檢 測的要求，因此，綜合來看，乙腈 -水系統(tǒng)要優(yōu)于甲醇 -水系統(tǒng)。在分離含極性差別較大的多組分樣品時，為了使各組分均有合適的k 值并分離良好，也需采用梯度洗脫技術(shù)。反相色譜中，如果要在相同的時間內(nèi)分離同一組樣品，甲醇 / 水作為沖洗劑時其沖洗強度配比與乙腈 /水或 四氫呋喃

14、 / 水的沖洗強度配比有如下關(guān)系：C 乙腈=0.32C 2甲醇+ 0.57C甲醇C 四氫呋喃=0.66C甲醇C 為不同有機溶劑與水混合的體積百分含量。100%甲醇的沖洗強度相當于 89%的乙腈/水或66%的四氫呋喃 /水的沖洗強度。3 流動相的pH值采用反相色譜法分離弱酸(3< pKaW 7)或弱堿(7W pKaW 8)樣品時，通過調(diào)節(jié)流動相的 pH值，以抑制樣 品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對于弱酸，流動相的 pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小于弱酸的 pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相 反。分析弱酸樣品時，通常在

15、流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L 磷酸鹽緩沖液和 1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和 30mmol/L三乙胺溶液。注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在 這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。4流動相的脫氣HPLC 所用流動相必須預先脫氣， 否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡， 影響泵的工作。 氣泡還會影響柱的分離效率， 影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動）。此外，溶解在流 動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反

16、應。溶解氣體還會引起溶劑 pH 的變化，對分離或 分析結(jié)果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現(xiàn)象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況 下，熒光響應可降低達 95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣

17、或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮 發(fā)造成的組成變化。 超聲脫氣比較好， 1020分鐘的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑 /水混合液的脫氣是足 夠了（一般 500ml 溶液需超聲 2030min 方可） ，此法不影響溶劑組成。 超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部 或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開始回到溶劑中。在14 小時內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進行時，將惰性氣體噴 入溶劑中。嚴格來說，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的

18、惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出 來。此外還有在線脫氣機。一般說來有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這 種連續(xù)脫氣法在電化學檢測時經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。5流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經(jīng) 0.45&micro;m （或 0.22&micro;m ）濾過， 以除去雜質(zhì)微粒， 色譜純試劑也不例外 （除非在標簽上標明 "已濾過 " ）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾膜。有機相濾膜一般用于過濾 有機溶劑，過濾水溶液時流速低或濾不動。水相濾膜只能用于過濾水溶液，嚴禁用于有機

19、溶劑，否則濾膜會被 溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC對于混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合后濾過，首選有機相濾膜?，F(xiàn)在已有混合型濾膜出售。6流動相的貯存流動相一般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不銹鋼容器內(nèi)，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導致溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統(tǒng)，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發(fā)引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長霉，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內(nèi)冷藏，并在3 天內(nèi)使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質(zhì) 沉淀和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現(xiàn)象。7鹵代有機溶劑應特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質(zhì)，能與HPLC系統(tǒng)中的不銹鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCI4、CHC13等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四