ELISA實驗質(zhì)量控制問題

1、從1949年美國College of American Pathologists（簡稱CAP）首先開始研究臨床實驗室室內(nèi)質(zhì)量控制（簡稱質(zhì)控）問題，美國學(xué)者Levery和Jenning于1950年發(fā)表第一篇關(guān)于使用質(zhì)控圖的實驗室室內(nèi)質(zhì)控，臨床檢驗實驗室的室內(nèi)質(zhì)控工作正式拉序幕。到70年代，實驗室質(zhì)量控制進入一個新的階段-全面質(zhì)量管理，推行Good Laboratory Parctice（簡稱GLP）。進入80年代末期，GLP的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生了，發(fā)展到"認證實驗室"管理階段。全面質(zhì)量管理的宗旨在于預(yù)防差錯的產(chǎn)生。質(zhì)控圖的統(tǒng)計學(xué)質(zhì)控的目的是檢出差錯。統(tǒng)計學(xué)的實驗室室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量

2、管理中的一個重要環(huán)節(jié)。本章節(jié)主要介紹免疫學(xué)檢驗的統(tǒng)計學(xué)室內(nèi)質(zhì)控方法。因為ELISA是目前臨床上最常用的一種免疫學(xué)檢驗方法，就以ELISA檢驗為例，介紹一下有關(guān)問題。衛(wèi)生部臨床檢驗中心免疫質(zhì)控室從1988年開始在全國范圍內(nèi)開展乙肝標(biāo)志物檢驗的質(zhì)量評價活動，一直采用這一套質(zhì)量評價方法，并在實踐中不斷實踐、提高和完善，希望能找出一條適合中國國情的，行之有效的質(zhì)量管理的道路。5.1 基本概念5.1.1 質(zhì)量控制（Quaility Control,Q.C）質(zhì)量控制是監(jiān)視全過程，排除誤差，防止變化，維持標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的。1）確定控制的對象；2）規(guī)定控制對象的標(biāo)準(zhǔn)（

3、預(yù)期值）；3）制定或選擇控制方法和手段；3）測量實際數(shù)據(jù)；4）比較或較對實際數(shù)據(jù)與預(yù)期值之間的差異，并說明產(chǎn)生這一差異的原因。超出預(yù)定誤差范圍，報警系發(fā)出信號，反饋通道中斷。5）采取行動，解決差異?；謴?fù)原狀（原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)）的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進行。質(zhì)控圖是把某一檢驗的性能數(shù)據(jù)與所計算出來的預(yù)期的"控制限"進行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進行時，按時間順序而抽選出來的，其目的是檢測檢驗過程中變異的"可追查"性原因。"可追逆"性的誤差原因，是指除去隨機誤差以外的其他原因。"控制限"是通過統(tǒng)計計算

4、出來的，在后我們將詳細介紹（見5.3.室內(nèi)質(zhì)控程序）。5.1.2 誤差實驗誤差分為三種：系統(tǒng)誤差、隨機誤差和過失誤差。系統(tǒng)誤差是指一系列測定結(jié)果與真值或靶值存在有同一傾向的誤差，有明顯的規(guī)律性，可在一定條件下重復(fù)出現(xiàn)，是可以通過質(zhì)控預(yù)防和校正的。隨機誤差又稱偶然誤差，是一種偶然的、未能預(yù)料到的誤差，是難以避免和校正的誤差。檢驗工作中隨機誤差的分布符合正態(tài)分布規(guī)律。過失誤差是人為的責(zé)任誤差。通過加強實驗室管理和開展質(zhì)量控制工作是可以避免的。5.1.3 正態(tài)分布及標(biāo)準(zhǔn)差ELISA試驗中，檢驗同一樣本達20次以上時，就會發(fā)現(xiàn)這組數(shù)據(jù)（指測定結(jié)果的吸光值）分布在均值兩側(cè)，大部分集中在均值附近。如果以測

5、定值為橫坐標(biāo)，以出現(xiàn)的頻率為縱坐標(biāo)作圖，就可繪出一個呈鐘形的曲線圖。如圖5-1，鐘頂處為均值，其他值以均值為中心對稱分布，這就是正態(tài)分布。 正態(tài)曲線以下的面積稱概率，常用樣本的均數(shù)（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）來表示，其計算方法如下：均值、標(biāo)準(zhǔn)差和概率的關(guān)系如下：X±1SD，概率0.68X±2SD，概率0.95X±3SD，概率0.99換言之，當(dāng)ELSIA檢測同一樣本達一定次數(shù)后所得的一組數(shù)據(jù)，其中靠近均值（X）的±1SD范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)，占該組數(shù)據(jù)的68%，在X±2SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的95%，在X±3SD范圍內(nèi)分布的數(shù)據(jù)占總體的

6、99%。當(dāng)我們要求檢驗結(jié)果在X±2SD范圍內(nèi)為合格時，將有95%的數(shù)據(jù)可能合格。5.1.4 真值用確切的、最理想的決定性方法測得的值，稱為真值。真值一般是測不到的。通過可靠的決定性方法測出的值，稱為靶值，通常用靶值來表示真值的大小。5.1.5 準(zhǔn)確度（accuracy）是指測定結(jié)果與真值（或靶值）接近的程度。準(zhǔn)確度不能以數(shù)字表示，往往用不準(zhǔn)確度來衡量。測定結(jié)果與靶值的偏離程度稱為偏差，它表示該項檢驗的不準(zhǔn)確度。絕對偏差=檢驗的均值-真值（或靶值）相對偏差=絕對偏差真值÷（或靶值）×100%5.1.6 精密度（Precision）是指對同一樣本重復(fù)測定時，每次測定結(jié)

7、果與平均值的接近程度，即重復(fù)測定值之間的符合程度。5.1.7 標(biāo)準(zhǔn)品1、國際標(biāo)準(zhǔn)品 由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的，用肯定的、公認的、準(zhǔn)確的物理或化學(xué)方法測定的定值材料。2、國際生物學(xué)活性標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)由WHO或相應(yīng)組織標(biāo)定的國際活性單位的材料。3、參考標(biāo)準(zhǔn)血清 國家標(biāo)準(zhǔn)化組織根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的法定材料?？捎糜阼b定儀器和鑒定方法準(zhǔn)確性。 5.1.8 臨床決定性水平（clinical decision leuel）當(dāng)某個被測物的濃度達到某一水平時，臨床醫(yī)師必須采用醫(yī)療措施。被測物的這濃度稱為臨床決定性水平。5.2質(zhì)量控制血清質(zhì)控血清是已有靶值的血清，在每次的常規(guī)檢驗中加入一份或數(shù)份，通過所得結(jié)

8、果來了解本次檢驗的情況。質(zhì)控血清檢驗的結(jié)果如能控制其誤差在一定范圍內(nèi)，就說明該檢驗沒有發(fā)生不允許的誤差。如果出現(xiàn)超過允許誤差范圍的異常結(jié)果，提示該檢驗不合格，應(yīng)尋找原因，糾正后，重檢待測標(biāo)本。因此質(zhì)控血清在質(zhì)控工作中起重要作用。5.2.1 質(zhì)控血清的使用衛(wèi)生部臨床檢驗中心制備的乙肝標(biāo)志物質(zhì)控血清，可以在-20保持半年定值不變。冰凍狀態(tài)融化使用時，應(yīng)先混勻，未用完部分可在4保存5天。不宜反復(fù)冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內(nèi)質(zhì)控工作需要的質(zhì)控血清，一般按3-6個月用量準(zhǔn)備。自制的不定值質(zhì)控血清，在一批質(zhì)控血清將用完之前，需準(zhǔn)備下一批質(zhì)控血清。質(zhì)控血清要求性能穩(wěn)定，較長期內(nèi)效價不變，其理化性質(zhì)應(yīng)與

9、病人樣本相近，這樣才能有效地起到監(jiān)測作用。5.2.2 臨界值質(zhì)控血清質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽性的標(biāo)準(zhǔn)。 臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應(yīng)的標(biāo)本不漏檢。5.2.3 質(zhì)控血清的制備每個實驗室可以根據(jù)自己的條件，選用臨床中心提供的質(zhì)控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質(zhì)控血清（以乙肝質(zhì)控血清為例）。1） 收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細菌污染的陽性血

10、清。2） 56加熱10小時來活。3） 離心或過濾除去沉淀。4） 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS緩沖液）將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標(biāo)本。5） 抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿，封口，20保存?zhèn)溆?。不可反?fù)凍融。被檢物要求檢出的水平常被認為是質(zhì)控血清應(yīng)選擇的水平。如果該試驗還有其它要求，則應(yīng)加所要求濃度的質(zhì)控物。6） 標(biāo)定含量。20-30次測定結(jié)果刪除>±2SD數(shù)據(jù)的均值作為靶值，并與已知定值血清對比測定。5.3 室內(nèi)質(zhì)量控制程序臨床檢驗的檢測結(jié)果，每次或每天之間不可能沒有誤差。決定允許的誤差范圍，以臨床上不造成誤診與漏

11、診為準(zhǔn)，通過以下步驟來確定質(zhì)控范圍。1） 最佳條件下的測定誤差。2） 已知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。3） 未知值的血清在常規(guī)檢驗條件下的誤差。4） 臨床應(yīng)用的要求。對任何一個試驗都應(yīng)確定一個允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規(guī)定卻要花費很大人力、物力和時間。相反，如果將允許誤差定得過大，將使監(jiān)測系統(tǒng)察覺不到臨床上要求檢出的誤差，失去質(zhì)控的意義。5.3.1 最佳條件下已知值質(zhì)控血清變異（optimal conditions variance,簡稱OCV）的測定在本實驗室最佳條件下（包括操作者、試劑、儀器等）檢測質(zhì)控血清20-30次，

12、測得結(jié)果計算，求出該組數(shù)據(jù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示該實驗室的最佳工作質(zhì)量?，F(xiàn)舉例說明HBsAg ELISA法檢測時OCV的測定。使用的質(zhì)控制血清為臨界血清，HBsAg濃度為5ng/ml。在該實驗室中選擇素質(zhì)最好、操作最熟練的技術(shù)員進行認真地專門測定，選用最佳的試劑盒，檢測之前，將恒箱、加樣器等認真校正、調(diào)校正、調(diào)試，使用新的加樣吸頭等，即在最佳、最理想的條件下進行檢測。除質(zhì)控血清外同時測定陰性對照品和陽性對照品。并作雙份測定，得出2個吸光值（A值），求出X。連續(xù)作20次，求出20個X，即X1X20。從這20個數(shù)據(jù)中，求出OCV的X和SD。5.3.2常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清變異（routine

13、 conditions variance-known value,簡稱RCVK）的測定。做常規(guī)檢驗的技術(shù)人員，在常規(guī)檢驗的條件下，將質(zhì)控血清放在常規(guī)檢測樣本中，進行20次檢驗，結(jié)果計算同OCV法。一般認為RCV的SD在OCV的SD兩倍范圍內(nèi)可以接受。若太大應(yīng)該查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改進實驗室條件后（例如較正加樣器，糾正洗板操作，調(diào)正溫育溫度等），重新進行RCVK的測定。如果RCVK的SD值更小，說明OCV不是最佳條件下測定的，應(yīng)重新再測OCV。常規(guī)條件下，RCVK肯定要比OCV大。通過質(zhì)控控制各項條件，使RCVK的數(shù)據(jù)盡可能接近OCV值。RCVK的數(shù)據(jù)反映該實驗室日常工作的質(zhì)量

14、，用于作質(zhì)控圖，對室內(nèi)檢驗的結(jié)果進行控制，每日檢驗的結(jié)果，報告能否發(fā)出。5.3.3常規(guī)條件下,未知值質(zhì)控血清變異(routine conditions variancl-unknown value 簡稱RCVU)的測定有時為了避免主觀性,再作RCVU測定。測定步驟同RCVK，但檢測的操作者不知質(zhì)控血清的定值，或在操作者不知哪份是質(zhì)控血汪清的條件下進行常規(guī)檢驗，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說明。5.3.4質(zhì)控圖通過以上三步驟，可以開始作室內(nèi)質(zhì)控圖，根據(jù)RCVK的和SD作質(zhì)控框圖。利用質(zhì)控圖可以對每次檢驗的結(jié)果進行監(jiān)測，當(dāng)沒有更換另一批號試劑盒和另一批號質(zhì)控血清時，該質(zhì)控圖可以連續(xù)作下去。

15、質(zhì)控血清的S/CO值低于-2SD的范圍,屬"告警"，應(yīng)尋找原因并在質(zhì)控圖上記錄查出的原因。ELISA試驗中，各種檢驗項目的誤差允許范圍均有待在實踐中得出結(jié)論，以上只是舉例說明質(zhì)控方法，不是定論。2SD是一般公認的允許誤差限度。每批測定放一份質(zhì)控血清時，一次超過2SD應(yīng)作為"告警"，二次超出2SD為"失控"。當(dāng)質(zhì)控過程中，出現(xiàn)失控時，出現(xiàn)失控時，應(yīng)查找原因，通常是試劑盒或質(zhì)控血清失效造成。更換試劑盒或更換質(zhì)控血清，找出原因糾正后重新檢驗。如果檢驗結(jié)果仍達不到要求或找不到原 因時，應(yīng)重復(fù)進行OCV的檢驗。如果OCV檢驗的結(jié)果仍是好的，說明

16、常規(guī)操作出現(xiàn)問題。一般認為：一次超出3SD；連續(xù)二次超出2SD；3-5次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)；57次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。第、種情況，單獨依靠記錄往往是不易察覺的，但在質(zhì)控圖上可以清晰地發(fā)現(xiàn)這種失控。5.3.5統(tǒng)計學(xué)計算方法-"即刻性"質(zhì)控以上介紹的質(zhì)控方法基本上與臨床化學(xué)測定的質(zhì)控方法相同，但ELISA有其特殊性，最合適的質(zhì)控方法尚待研究建立。有些實驗室不是每天進行ELISA項目的檢驗，而ELSIA試劑盒效期短，用一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測20次，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計方法，只需連續(xù)測3次，即可對第3次檢驗結(jié)果進行質(zhì)控。"即

17、刻法"的建立具體計算方法如下：1)先將測定值從小到大排列2)計算X和SD。3)計算SDI上限和SDI下限值。4)將SDI上限、SDI下限值與SDI值中的數(shù)字比較。當(dāng)SDI上限值和SDI下限值n2SD時，表示處于控制范圍內(nèi)，可以繼續(xù)往下測定，繼續(xù)重復(fù)以上各項計算；當(dāng)SDI上限和SDI下限有 一值處于n2SD和n2SD值之間時，說明該值在2SD3SD范圍，處于"告警"狀態(tài)；當(dāng)SDI上限和SDI下限有一值n2SD時，說明該值已在3SD范圍之外，屬"失控"。數(shù)值處于"告警"和"失控"狀態(tài)應(yīng)舍去，重新測定該項質(zhì)控血

18、清和病人樣本。舍去的只是失控的這次數(shù)值，其他次測定值仍可繼續(xù)使用。即刻性質(zhì)控統(tǒng)計方法，適于ELISA測定的質(zhì)控。當(dāng)檢測的數(shù)值超過20次以后，不必再使用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計計算，可以轉(zhuǎn)入常規(guī)的質(zhì)控圖的質(zhì)控。將前20次的數(shù)值求出的和SD作質(zhì)控框架圖，第21次的數(shù)值，依次點入即可。5.4室間質(zhì)量評價（external quality assessment,簡稱EQA）室間質(zhì)量評價簡稱室間質(zhì)評，是由質(zhì)控中心采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價各實驗室的試驗結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性，了解各實驗室之間結(jié)果的差異，并幫助校正，使具有可比性。各實驗室試驗結(jié)果報到質(zhì)控中心，經(jīng)過統(tǒng)計分析，得出相互比較的結(jié)果。這種評價不能控制各實驗室每天發(fā)出的檢驗報告，而是一種回顧性評價。室內(nèi)質(zhì)控主要監(jiān)測試驗結(jié)果的精密度，而室間質(zhì)評主要控制試驗結(jié)果的準(zhǔn)確度，不能互相替代。參與質(zhì)評的實驗室應(yīng)先做好室內(nèi)質(zhì)控。 5.4.1室間質(zhì)評的方法1、 發(fā)質(zhì)控物進行調(diào)查這是國內(nèi)外室間質(zhì)評的常用形式。部臨檢中心對乙肝標(biāo)志物ELISA檢驗的室間質(zhì)評采用定期發(fā)放質(zhì)控物至各實驗室，各實驗室在規(guī)定的日期進行檢驗，并將檢驗結(jié)果報至部臨檢