利用RAPD分子標(biāo)記鑒定甜瓜、苦瓜種子純度

1、利用rapd分子標(biāo)記鑒定甜瓜、苦瓜種子純度陳金體巫峽王曉峰摘要：甜瓜、苦瓜是華南地區(qū)兩種重要的水果蔬菜栽培品種，具冇較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。木 實(shí)驗(yàn)以甜瓜、苦瓜種了為材料，通過(guò)改進(jìn)種了 dna的ctab提取方法和優(yōu)化rapd-pcr各因了(模板 dna濃度、引物濃度、dntps濃度、m尹濃度、退火溫度、反應(yīng)循壞數(shù))，為實(shí)驗(yàn)室建立了較為穩(wěn)定快 速可靠的水果蔬菜種子純度rapd檢測(cè)方法，為今后水果蔬菜rapd指紋建立打下基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：甜瓜苦瓜rapd分子標(biāo)記種了純度中國(guó)圖書資料分類號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼甜瓜(cucumis melo l.)是葫蘆科cucurbitaceae)甜瓜屬中幼果無(wú)刺的栽培種，一

2、年生蔓性草 木植物，染色體數(shù)2n二2x=24,果實(shí)香甜，分為網(wǎng)紋甜j var. reticulatus naud.)、硬皮甜瓜 (raz; cantalupensis naud.)、冬甜瓜(var. in odor us naud.)、觀賞甜瓜(拠 z: dudain naud.)、檸檬 瓜(var. chi to naud.)、菜瓜(var. flexuosus naud.)、香瓜(var. makuwa maki no)、和越瓜(回:conomon maki no)等8個(gè)變利苦瓜o伽】ord i ca c haran t i a) 乂名涼瓜，一年牛.蔓性蔬菜，染色體數(shù)2n=2x=22, 含

3、糖首量高，按果實(shí)形狀和表面特征分為長(zhǎng)圓錐形和短圓錐形兩類。前者如廣東滑身苦瓜、長(zhǎng)身苦瓜 和長(zhǎng)江流域的口苦瓜，后者如廣東人頂苦瓜，均是優(yōu)良的栽培品種。種了純度(genetic purity of seeds)檢測(cè)是指鑒定提供檢樣品屮木品種的種了數(shù)占提供檢樣 品總數(shù)的百分比。鑒定-批種子所屬品種、利或?qū)倥c標(biāo)簽上的標(biāo)明是否相同，是否名副其實(shí)稱為品種 真實(shí)性(genuineness of variety)鑒定。低純度、真實(shí)性差的種子將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)極大的損失。 為了防止假種子事件發(fā)生，保護(hù)廣大農(nóng)民的利益，提高和控制我國(guó)種子公司的種子質(zhì)量，建立簡(jiǎn)便、 快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的種子純度檢測(cè)方法已勢(shì)在必行。199

4、0年來(lái)，rapd (random amplified polymorphic dna)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna標(biāo)記，已被證明是 植物系統(tǒng)學(xué)、分類與鑒定研究的一個(gè)有川而簡(jiǎn)便的工具九役它是利用人工合成的隨機(jī)寡聚核昔酸片斷 (910bp)作為引物,用未知序列的基因組dna為模板,通過(guò)pcr擴(kuò)增后,得到具有多態(tài)性的dna1 一作者簡(jiǎn)介：陳金體(1983-12),女，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院02級(jí)生物技術(shù)專業(yè)，本科在讀。 片斷。rapd標(biāo)記數(shù)量多，可以覆蓋基因組中所冇位點(diǎn)，rapd標(biāo)記是顯性的，不能區(qū)別生物個(gè)體基因 型是純合型述是雜合型的。該方法的優(yōu)點(diǎn)主要是快速簡(jiǎn)便，無(wú)放射性污染，成本較低，分辨率高，靈 皺

5、度強(qiáng)，但由于其涉及到多種微量成分參加反應(yīng)，會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性差等一些問(wèn)題。我們對(duì)pcr-rapd 中各關(guān)鍵因子進(jìn)行了研究，根據(jù)自身實(shí)際，建立了一種比較簡(jiǎn)便快速，穩(wěn)定準(zhǔn)確的蔬菜種子純度和品 種真實(shí)性的檢測(cè)方法。1.實(shí)驗(yàn)材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)材料本文所試11個(gè)甜瓜品種、12個(gè)苦瓜品種,皆購(gòu)自種子市場(chǎng),詳細(xì)信息如表1、表2：表1 11個(gè)甜瓜品種信息tab. 1 profiles for 11 cucumis melo l. types in the research品種品種特性果實(shí)近圓形，成熟時(shí)果皮成黃白色；果肉白綠色、肉厚、質(zhì)細(xì)而脆果味醇香，汁多 運(yùn)蜜一號(hào)適口；長(zhǎng)勢(shì)健壯，綜合抗性好。一代交配，耐濕、耐熱

6、，適應(yīng)性強(qiáng)，抗蔓割病。果空豐滿整齊，果皮光滑，白綠微 新解甜瓜帶黃色，肉色淡白綠，肉質(zhì)松脆。一代交配梨甜瓜（美濃瓜），結(jié)果力強(qiáng)。果實(shí)豐正微扁球型，成熟時(shí)皮 銀輝色銀口，不易裂果，肉色淡口綠，肉質(zhì)松爽細(xì)嫩，香甜可口。一代交配，早生強(qiáng)健，耐濕、耐熱，結(jié)果力強(qiáng)，果皮銀白色稍帶黃色，肉質(zhì)松脆可 新玉甜瓜口，果梗不易脫落，不易裂果，抗蔓割病及病毒病。原種，早熟品種，果實(shí)圓形，大而周正，果皮白色，質(zhì)脆爽口，味香甜，抗逆性強(qiáng)， 白沙蜜耐貯運(yùn)。從白沙蜜屮歷經(jīng)三年套袋提純的白瓜。高抗病毒、霜霉、枯萎，早熟，果型人而均 白雪一號(hào)7 勻，雪白透亮，香甜可口。白雪一號(hào)與國(guó)外材料雜交定向選育，高抗病毒、霜霉、白粉、枯萎

7、，果圓型，籽、 賽雪皐后肉均口色，皮雪口透亮，果實(shí)清脆爽口，味香甜，耐貯運(yùn)。果肉脆，果皮韌，耐貯運(yùn)，植株長(zhǎng)勢(shì)旺，果皮白綠色，果面冇淺條紋，成熟后略變 津甜一號(hào)黃。肉色淺綠，口感酥脆，風(fēng)味好。一代交配，果實(shí)近圓球型，皮色白綠，果肉青翠，甜度高，肉質(zhì)松脆，座果高，不 一灣青玉易裂果霉?fàn)€，抗病力強(qiáng)。雜交一代，果實(shí)蘋果型，果皮綠白色微透黃亮，果肉清脆香甜，易座瓜，抗病強(qiáng)，傲雪碧玉不易裂果、爛瓜。果實(shí)近似圓球型，皮色口綠，果肉青翠，甜度高肉質(zhì)松脆，座果高，豐產(chǎn)，不易裂h本甜寶果霉?fàn)€，抗病力強(qiáng)。表2 13個(gè)苦瓜品種信息tab. 1 profiles for 13 momordica charantia t

8、ypes in the research品種品種特性旺優(yōu)大厚肉2號(hào)雜交一代，果實(shí)碩大，近圓柱狀，皮色淺綠，h有光澤，果肉豐厚致密，耐貯運(yùn)，ihi質(zhì)優(yōu)，產(chǎn)最最高的汕瓜新品種。南珠苦瓜雜交一代，瓜形大，皮色油綠冇光澤，柳條粗直，外觀美觀，肉厚、質(zhì)脆。雜交一代，屮熟，耐熱，豐產(chǎn)，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，瓜人，長(zhǎng)紡錘型，皮色淺綠，瓜形均勻綠華夏(668)一致，抗逆性強(qiáng)。代交配，長(zhǎng)身油瓜，條瘤粗直厚大，瓜肩稍平，瓜底較鈍，味濃郁，是目前最早綠中寶熟的汕瓜。雜交一代，油綠苦瓜，中早熟，瓜頭尾勻稱，形狀美觀，味林爽口，微苦，結(jié)瓜多，檳優(yōu)一號(hào)延收期長(zhǎng)。岀口型，早熟、耐寒、耐熱、耐濕、長(zhǎng)勢(shì)旺盛，高抗枯萎病、口粉病，箱霉病，抗

9、泰國(guó)大肉王逆性強(qiáng)，瓜長(zhǎng)棒形，頭尾均勻，高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。一代交配，原種從臺(tái)灣引進(jìn)，瓜長(zhǎng)棒形，具有早熟、高抗病、瓜碼密、肉厚、豐產(chǎn)臺(tái)灣翡翠等優(yōu)點(diǎn)，是目前蔬菜基地理想的首選品種z。早生長(zhǎng)身苦瓜，臺(tái)灣品種，機(jī)旱生，生長(zhǎng)強(qiáng)健，豐產(chǎn)，果實(shí)出長(zhǎng)形，果色玉白帶綠高華色，果面細(xì)吃刺瘤突起平滑，略有肋條。原種美國(guó)引進(jìn)的一代雜交種，抗低溫弱光能力強(qiáng)，極耐熱耐澇，喜大水大肥，掛長(zhǎng)美工綠劍圓棒型，瓜身堅(jiān)實(shí)，空心極小，周身不滿疙瘩，刺瘤豐滿可愛(ài)，微苦、lt脆。瓜圓林形，較粗實(shí)，色澤綠口亮凈，縱瘤明顯，表面麻子均勻，品質(zhì)優(yōu)良，能適應(yīng)長(zhǎng)白苦瓜全國(guó)各地春秋栽培。鼎豐大頂瓜圓錐形，翠綠有光澤，條紋粗直。具有高產(chǎn)，瓜形美，快人，肉厚不易

10、裂，翠綠。 雜交一代大頂苦瓜，耐熱，主側(cè)蔓均可結(jié)瓜，果實(shí)圓錐形，頂特大，肉特厚，瘤條翠綠一號(hào)粗直，皮色油綠且有光澤，最適宜出口。代交配，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，瓜短圓錐形，條瘤初有，瓜形美觀，皮綠有光澤，肩平人、 五山黑籽大頂肉厚且致密，耐貯運(yùn)。1.2主要儀器設(shè)備5415r型eppendorf高速冷凍高速離心機(jī)、渦旋器(scientific industries, tnc.)>電泳儀(大連 捷達(dá) jmx, scientific instruments)> pcr 儀(mj research ptctoo)、微波爐(national)> 數(shù)顯 恒溫水浴鍋(國(guó)華電器hh-l)、-20°

11、;c低溫冷柜(sanyo)、磁力攪拌器(六一儀器廠)、培養(yǎng)皿、恒溫 培養(yǎng)箱、烘箱、研缽、通風(fēng)櫥。1.3主要試劑三疑甲基氨棊甲烷(tris)、乙二胺四乙酸(edta)、十六烷基三甲基滉化鞍(ctab)、硼酸、聚乙 烯毗咯烷酮(pvp)、p一疏基乙醇、氯化鈉(nacl)、鹽酸、氫氧化鈉(naoh)為國(guó)產(chǎn)分析純；瓊脂糖 為sigma公司產(chǎn)品;dl2000 dna maker> taq酶、dntp> mg2+為日本takara寶生物工程(大連)有限 公司產(chǎn)品，taq酶北京天為時(shí)代科技有限公司的。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4. 1 d7a提取緩沖液的配制dna 提取緩沖液配制：稱取 ctab 4 g

12、, tris 2. 42 g, edta 1. 169 g, nacl 16. 38 g, pvp 4g 溶 于160 ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)ph值到8.0,并用雙蒸水定容到200 ml,裝入棕色瓶中，11公斤/ 平方厘米滅菌20分鐘。4°c保存。使用前，預(yù)熱至65°c,取出適當(dāng)體積，加入1%體積比的b疏基乙醇。1.4.2 dna的提取宙叫以苦瓜種了為參考，甜瓜種了稍小，加樣蜃略少)選取一粒種子，剝売，在研缽上先用液氮迅速磨至粉狀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml滅菌離心管屮，加入500)11 預(yù)熱至65°c的種子dna提取緩沖液洗滌研缽，離心管中混勻。混合溶液于65°

13、;c水浴孵育15 niirio向上述反應(yīng)體系中加入0.25倍體積(即125gl)酚/氯仿/異戊醇(25/24/1),混勻，12000 rpm, 室溫離心10 mine取上清液再按相同方法用酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)抽提一次。將上清液轉(zhuǎn)移至新的1. 5 ml滅菌離心管中,加0. 6倍體積冷的異丙醇,混勻,12000 rpm 4°c離心 6 min。加70%乙醇1 ml,洗滌沉淀2次，12000 rpm離心1 min。棄上清,風(fēng)干總dna。加滅菌的lxte20pl溶解，在4°c下貯藏備用，或在-20°c下長(zhǎng)時(shí)間保存。（提取時(shí)間約為40 min）1.4.3 pc

14、r反應(yīng)條件的優(yōu)化1.4.3. 1初始擴(kuò)增反應(yīng)pcr反應(yīng)液的總體積為25卩1,其組成如下表表3 pcr-rapd初始反應(yīng)體系tab.3 pcr-rapd initial systempcr反應(yīng)液的組成反應(yīng)液中的用量dna template (約 30 ng)1 mtaq dna polymerase (5 u/l)o.2 mloxreaction buffer (mg)2.5 mdntp mixture (2. 5 mm)1.5 mprimer (1 pm)1 mmgcl2 (25 pm)2.o mddh.0add to 25 alpcr反應(yīng)條件如下：94°c預(yù)變性3 min；94&#

15、176;c變性 1 min, 37°c復(fù)性 1 min, 72°c延伸 2 min, 40 個(gè)循環(huán);72°c延伸 10 min；4°c保存。1.4. 3.2反應(yīng)混合物中各組分濃度搭配的篩選1.4. 3. 2.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法（苦瓜）1.4. 3. 2. 1. 1退火溫度優(yōu)化在初始擴(kuò)增體系下，嘗試變化退火溫度，以求獲得最大數(shù)量和最清晰的多態(tài)dna。嘗試的追火溫度：34°c, 35°c, 36°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40°c, 41°c, 45°c

16、, 48°c。1.4. 3. 2. 1.2 引物濃度的優(yōu)化在最優(yōu)退火溫度下，嘗試變化引物濃度，其它反應(yīng)條件不變。嘗試的引物濃度：6 網(wǎng)/1, 8 mm/1,10 m1/1,12 網(wǎng)/1, 14 pm/lo1.4. 3. 2. 1.3 dntps 濃度的優(yōu)化在最優(yōu)退火溫度、引物濃度條件下，嘗試變化dtps濃度，其它反應(yīng)條件不變。嘗試的 dntps 濃度:100 pm/1, 150 m/1,200 mm/1,250 剛/1, 300 網(wǎng)/1。1.4. 3. 2. 1.4 模板濃度的優(yōu)化確定了最優(yōu)退火溫度、引物濃度、dntps濃度后，嘗試變化加入的模板量，其它反應(yīng)條件不變。 根據(jù)與mark

17、er dl2000電泳條帶比較,可估算加入每管反應(yīng)的模板梯度量為為：10 ng, 20 ng, 40 ng, 80 ng, 160 ng, 320 ng。1. 4. 3. 2. 1. 5 taq dna polymerase 濃度的優(yōu)化建立了最優(yōu)退火溫度、引物濃度、dntps濃度、模板濃度后，還需:要對(duì)taq dna polymerase濃 度進(jìn)行調(diào)整，其它反應(yīng)條件不變。嘗試對(duì)每個(gè)不同的反應(yīng)管加入不同taq dna polymerase量:0.25 u, 0. 5 u, 1 u, 1. 5 u。1.4. 3. 2. 1.6 mg"濃度優(yōu)化在以上最優(yōu)條件下，対濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其它反應(yīng)條件

18、不變，嘗試以下的濃度梯度：1.5mm/l, 2. 0 mm/1, 2. 5 mm/1, 3.0 mm/1, 3. 5 mm/1, 4.0 mm/lo1. 4. 3. 2. 1. 7 pcr-rapd擴(kuò)增循環(huán)數(shù)優(yōu)化基本確定了最優(yōu)pcr擴(kuò)增體系后，還需要對(duì)擴(kuò)增循壞數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，嘗試了一下兒個(gè)循環(huán)數(shù)：30, 35, 40, 45, 50o1.4. 3. 2. 2. 1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法(甜瓜)采用u (34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)dtp mixture濃度、引物濃度、mg"濃度、taq dna聚合酶濃度進(jìn)行了篩選，找出最佳組合。試驗(yàn)屮設(shè)兩個(gè)重復(fù)，還有一個(gè)空白對(duì)照。方案如卜i表4各組分濃度水平tab.

19、4 concentration of every reaction elements水dntp mixture(mi)primer(mm)(mm )taq dna polymerase(u)1500.21.51.021000. 32.01.531500.42.52.0表5各組分正交設(shè)計(jì)方案tab.5 design of orthogonal experiment表頭設(shè)計(jì)dntp mixtureprimermg*taq dna polymerase號(hào)處理1 (mm)2 (ml)3 (mm)4(u)11 (50)1 (0.2)1 (1.5)1 (1.0)21 (50)2 (0.3)2 (2.0)2

20、 (1.5)31 (50)3 (0.4)3 (2.5)3 (2.0)42 (100)1 (0.2)2 (2.0)3 (2. 0)52 (100)2 (0.3)3 (2.5)1 (1.0)62 (100)3 (0.4)1 (1.5)2 (1.5)73 (150)1 (0.2)3 (2.5)2 (1.5)83 (150)2 (0. 3)1 (1.5)3 (2. 0)93 (150)3 (0.4)2 (2.0)1 (1.0)1.4. 3. 2.2模板dna濃度優(yōu)化還通過(guò)瓊脂糖電泳檢測(cè)dna濃度，對(duì)pcr體系中dna濃度進(jìn)行了優(yōu)化，dna濃度分別為10 ng,約 15 ng,約 30 ng,約 60

21、ng,約 120 ng。1.4. 3.2.3退火溫度優(yōu)化再次進(jìn)行了退火溫度的優(yōu)化，所用溫度為35°c, 36°c, 37°c, 38°c, 39°c, 40°c。1.4.4 pcr反應(yīng)引物的篩選在敲優(yōu)的擴(kuò)增條件下，對(duì)pcr反應(yīng)引物進(jìn)行篩選。引物由上海生工生物公司合成。木文所篩選的引物如下表：表6 rapd分子標(biāo)記所用的引物tab.6 primers in the researchsan gon編號(hào)序列(5'to 3')w97107ggt ccc tga cw97284cat ccc cot gw97286tgc gcc

22、 ctt cw97287tgc tct gcc cw97288ggt gac gca gw97290tgg ggg act cw97291ctg ctg gga cw97294cat ccc cgc tw97295ttcc gct ctg gw97302ccc aag gtc cw97303ggt gcg gga aw97224cag agg tcc cw97225cac ccc ctt gw97230tcc tgg tcc cw97232agt cgg gtg gw97237agg ggg ttc cw97238tgg gga cca cw97255ccc ctc acg aw97246tc

23、c gag agg gw97247acg ccc agg tw97248gaa gcc agc cw97249gga cgg cgt tw97251gga cct gct gw97253acc ccc cac tw97255aga tcc cgc cw97256cag tgc cgg tw97260ggg tgt gca gw97263cat cgc cgc aw97266ggc tgc gac aw97270agc agc gca cw97274ggg tot cgg tw97276agt cgc cct tw97280tga ggg tcc c1.4.5種子純度和真實(shí)性檢測(cè)木實(shí)驗(yàn)的最終h的

24、是找到快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠的種了純度和真實(shí)性檢測(cè)。建立在良好的反應(yīng)體系, 特異的多態(tài)性引物基礎(chǔ)上，pcr-rapd將是一個(gè)很好的選擇。方法是，按照本實(shí)驗(yàn)摸索的種子dna提取法，pcr-rapd擴(kuò)增條件，特異引物對(duì)某一假設(shè)蔬菜品種 進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)首先対某一甜瓜品種進(jìn)行了檢測(cè)。這一過(guò)程在數(shù)小時(shí)內(nèi)即可完成。今后如果建立了足夠大的rapd分子文庫(kù)，這樣的檢測(cè)手段將會(huì)變得更加全面和高效。1.4.6瓊脂糖凝膠電泳取5a1pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1 w 6x loading buffer,點(diǎn)樣板上混勻,進(jìn)行點(diǎn)樣。膠濃度為14%。電泳時(shí)，先把電壓調(diào)至140 v左右，待樣品跑出點(diǎn)樣孔后，再調(diào)節(jié)電壓至100 v （約

25、35v/cm）, 電泳40 min左右即可取出凝膠，在bi0-rad凝膠成像系統(tǒng)上打描成像并保存。2結(jié)果與分析2.1甜瓜種子的外觀形態(tài)圖1 11個(gè)胡種甜瓜的種子圖fig. 1 11 cucumis melo l. seed appearance圖2 13個(gè)品種苦瓜的種子圖fig. 2 13 momordica charantia seed appearance從圖不難看到，11個(gè)甜瓜品種的種子在形狀上很相似，皆為橢圓形，在種子大小和顏色上有一定 的差別，但差別不明顯。因此，利用甜瓜種子的外觀形態(tài)特征不可能將11個(gè)品種區(qū)別開(kāi)?？喙戏N子的 外觀形態(tài)區(qū)別稍大，但亦難直接通過(guò)形態(tài)標(biāo)記來(lái)區(qū)分每一種類和種

26、內(nèi)的純度。分子標(biāo)記能反映生物 個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的dna片段，它直接反映基因組dna間的差異。pcr-rapd 分子標(biāo)記是檢測(cè)的一個(gè)重要手段。2.2提取的苦瓜dna圖取提取的1.5 m dna、3.5 m蒸憾水、1 m 6xloading buffer,點(diǎn)樣板上混勻，進(jìn)行點(diǎn)樣。提取的dna質(zhì)量如下圖所示：圖3提取的苦瓜dna圖（ex代表提取的苦瓜dna, m為dl2000 marker）fig.3 dna extraction from momordica charantia(ex: extracted dna from momordica charantia m: dl2000

27、 marker)2.3 pcr反應(yīng)體系的優(yōu)化2. 3. 1 pcr反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化退火溫度低，引物和模板結(jié)合特界性較差，出現(xiàn)的條帶可能增多；退火溫度高，引物和模板結(jié)合特異性增加。在pcr-rapd屮，退火溫度尤為重耍，因此本實(shí)驗(yàn)対退火溫度做了大量的研究。一灣青玉新玉甜瓜圖4不同的退火溫度対兩個(gè)甜瓜品種rapd結(jié)果的影響(甜瓜)引物:w97291；模板：灣青玉,新玉甜瓜；m： dl2000 dna markerfig4 rapd results of different annealing temp. (cucumis melo l.)primer: w97291; template: yid

28、aiqingyu, xinyu; m: dl2000 dna markerm 34t 35t 36c 37t 38t 39c 妣 41t 45t 48t 圖5不同的退火溫度對(duì)rapd結(jié)果的影響(苦瓜)引物:w97107；模板：五山黑籽大頂；m： dl2000 dna markerfig.5 rapd results of different annealing temp. (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker圖4、5中可以看到不同的退火溫度的條件卜，擴(kuò)增帶區(qū)別明顯。對(duì)于甜

29、瓜,39°c、40°c的兩個(gè)處 理在兩個(gè)甜瓜品種中能擴(kuò)增出5條帶，條帶的量大，穩(wěn)定性好。這兩個(gè)都可以作為較佳退火溫度，接 下來(lái)的甜瓜實(shí)驗(yàn)選用39°c為退火溫度。對(duì)于苦瓜，36°c、40£、41°0都是較好的選擇，結(jié)合甜瓜實(shí)驗(yàn) 和其它引物的擴(kuò)增情況，最后選取/ 40為以后實(shí)驗(yàn)的退火溫度。2.3.2引物濃度的優(yōu)化m 6810 12 14 ck圖6不同的引物濃度對(duì)rapd結(jié)果的影響（苦瓜）引物:w97107；模板：五山黑籽大頂；m： dl2000 dna markerfig. 6 rapd results of different prim

30、er concentration （momordica charantia）primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker引物濃度對(duì)rapd擴(kuò)增質(zhì)量的影響還是比較明顯的。引物如果濃度過(guò)低，則無(wú)法與所冇模板dna結(jié) 合，影響擴(kuò)增質(zhì)量；如果濃度過(guò)高，則引物二聚體的形成會(huì)降低擴(kuò)增的有效性從圖6看到，從 10mi/l后出現(xiàn)了一條特異擴(kuò)増帶，結(jié)合條帶清晰和成本考慮，故選擇10m 引物濃度為以后苦瓜rapd 的主要濃度。2. 3. 3 dntps濃度的優(yōu)化圖7不同的dntps濃度對(duì)rapd結(jié)果的影響(苦瓜)引物：w97107 ；模板：

31、五山黑籽大頂;m： dl2000 dna markerfig. 7 rapd results of different dntps concentration (momordica charantia)primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker作為pcr反應(yīng)的原料，dntps的濃度直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的牛成。隨著dntps濃度的升高，擴(kuò)增產(chǎn) 物亦增加;但是濃度過(guò)高時(shí),dntps容易與mh結(jié)合,降低taq酶活和產(chǎn)物的生產(chǎn)。因此，必須選擇合適的dntps的濃度。如圖7, 200 mm/l擴(kuò)增帶最多尺清晰，所以木實(shí)驗(yàn)的苦瓜部分選

32、擇200 mm/l為主要的dxtps反丿應(yīng)濃度。2. 3. 4 dna模板濃度的優(yōu)化>10 15 30 60 120 m圖8模板濃度（單位：ng）対rapd的影響（甜瓜）引物:w97291；模板：日本甜寶；m： dl2000 dna markerfig8 rapd results of di fferent template conccntration （cucumi s me io l.）primer: w97291; template: rriben tianbao; m: dl2000 dna markerm 10 20 40 80 160 320m 10 20 40 80 160

33、 320 ck圖10模板濃度（單位：ng）對(duì)rapd的影響（苦瓜）圖9加入的模板濃度梯度（單位：ng）（苦瓜）引物：w97107；模板：五山黑籽大頂；m： dl2000 dna markerfig.9 template concentration in ng （momordica charantia）fig 10 rapd results of differont template conccntration （momordica charantia）primer: w97107; template: wushanheizi; m: dl2000 dna marker述采用曰木甜寶品種對(duì)模板d

34、na濃度進(jìn)行了優(yōu)化（圖9）。對(duì)于rapd擴(kuò)增進(jìn)行了不同dna濃度的 試驗(yàn)，過(guò)低或過(guò)高的dna濃度均導(dǎo)致沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，只有理想的dna濃度才能產(chǎn)生可重復(fù)性的rapd 指紋。從結(jié)果中可以看到dna濃度小于10 ng時(shí)，沒(méi)有擴(kuò)增的帶;dna濃度約為15 ng時(shí)擴(kuò)增的帶比 較模糊不清;dna濃度約為30 ng、60 ng. 120 ng時(shí),擴(kuò)增出來(lái)的帶都比清晰。但考慮到dna的用量, 最佳的選擇就是30 ng。苦瓜相似的實(shí)驗(yàn)在五山黑籽人頂中進(jìn)行，從10ng160ng,均有比較漂亮的擴(kuò)增帶。320ng開(kāi)始, 擴(kuò)增特弄性變化。所以，認(rèn)為40ng左右的模板dna量是較好的選擇。m 0.25 0.50 1.0

35、0 1.502. 3. 5 taq dna polymerase 濃度的優(yōu)化丄單位（u）圖11酶量對(duì)rapd的影響（苦瓜）引物:w97107；模板：五山黑籽大頂;m： dna marker （dl2000）fig. 11 rapd results of different taq polymerase concentration （momordi ca charant id）primer: w97107; template: wushanheizi, xinyu; m: dl2000 dna markertaq dna polymerase可以認(rèn)為是整個(gè)pcr-rapd屮最為重要的因子，其活性

36、與川量決定著擴(kuò)增質(zhì)量的根本。圖11中0.25u, 1.0u, 1.5u四個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度均有擴(kuò)增帶，0.5u沒(méi)有岀現(xiàn)擴(kuò)增帶很可能是實(shí)驗(yàn)錯(cuò)謀操作所致，與酶最無(wú)關(guān)。但考慮到成木及穩(wěn)定性，選用1.0u的酶量，這與許多其它文獻(xiàn)的報(bào)導(dǎo)一致。2. 3. 5 mg"濃度的優(yōu)化m 1.5 22.5 10 3.5 4單位(mm/l)圖12 mg?濃度對(duì)rapd的影響(苦瓜)弓i物：w97107；模板：五山黑籽大頂;m： dna marker (dl2000)fig.11 rapd results of different mg" concentration (momordica charantia

37、)primer: w97107; template: wushanheizi, xinyu; m: dl2000 dna marker雖然在pcr屮主要的功能是與taq酶結(jié)合，促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。但是，過(guò)高濃度的mg'也會(huì)與 其它反應(yīng)成分作用，如dntps、dna模板等，影響反應(yīng)的順利進(jìn)行。所以，合適的卜濃度很重要。圖 12中陸離子實(shí)驗(yàn)濃度區(qū)別不大，最后選擇1.5 mm/l的。2.3.6 pcr-rapd擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的優(yōu)化當(dāng)實(shí)驗(yàn)各組分的反丿應(yīng)濃度基木確定示，減少所需的反應(yīng)擴(kuò)增時(shí)間是提高rapd檢測(cè)有效性的一個(gè) 重要手段。到目前為止，此部分實(shí)驗(yàn)還在進(jìn)行當(dāng)屮。2.3.7對(duì)dntps mixtur

38、e、引物、mg2 taq dna聚合酶的濃度的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用l9 (34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以一灣青玉品種研究了不同dntp mixture、引物、mg"和taq dna 聚合酚的濃度對(duì)pcr結(jié)果的影響。ck是用雙蒸水代替dna,檢驗(yàn)各成分中有沒(méi)有被dna污染的。處理 號(hào)參照本文表5。正交表中的處理號(hào)112233445566778899 ckm圖13不同的濃度組合對(duì)rapd的影響引物：w97291；模板：一灣青玉;ck：空白對(duì)照；m： dna marker (dl2000)fig.13 results in the orthogonal experimentsprimer: w9729

39、1; template: yiwanqingyu; m: dl2000 dna marker圖13的結(jié)果表明，在9個(gè)處理中，主要的4大影響因索因濃度組合不同，擴(kuò)增效果差異比較明顯。 處理6、8岀現(xiàn)不能重復(fù)的現(xiàn)象。為避免偶然性，分別對(duì)其進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，兩個(gè)處理都沒(méi)有出現(xiàn)不能 擴(kuò)增的現(xiàn)彖。在所有組合中，各個(gè)組合多態(tài)性都比較好，都具有3條或以上的帶。但是考慮到實(shí)驗(yàn)的 重復(fù)性，帶型的清晰度等因素，還要考慮到taq dna聚合酶川量，授后決定選擇處理9。處理9的譜帶 清晰、重復(fù)性好、多態(tài)性高，是九個(gè)處理中最理想的濃度組合:即反應(yīng)總體積25其中含10x擴(kuò)增緩沖液 2. 5 m, mg2 + 2 mm/l,

40、 dntp mixture 150 mm/l,引物為 0.4 m-m/l, taq dna 聚合酶 1 u,模板 dna量為30 ng, -h他成分為無(wú)菌蒸餡水。2.4 pcr反應(yīng)引物的篩選隨機(jī)引物數(shù)量多，而且并不是所有的隨機(jī)引物都具有特-wo因此，必須進(jìn)行引物篩選，找到具冇特異性的隨機(jī)引物來(lái)進(jìn)行種了純度鑒定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)11種甜瓜品種進(jìn)行了篩選。圖14引物w97274的pcr擴(kuò)增結(jié)果圖15引物w97225的pcr擴(kuò)增結(jié)果fig.14 results with w97274 primerfig.15 results with w97225 primer圖16引物w97255的pcr擴(kuò)增結(jié)果圖17引

41、物w97295的pcr擴(kuò)增結(jié)果fig.16 results with w97255 primerfig.17 results with w97295 primer圖18引物w97276的pcr擴(kuò)增結(jié)果fig.18 results with w97276 primernote: al 1 markers above are dl2000 dna marker引物w97274在11個(gè)品種中可以擴(kuò)增出5條或以上的帶。在白沙蜜、白雪一號(hào)和賽雪皇后3個(gè)品 種屮可以明顯看到多了一條特征帶。因而，引物w97274將11個(gè)陽(yáng)種分成兩類：運(yùn)蜜一號(hào)、新輝甜瓜、 銀輝、新玉甜瓜、津甜一號(hào)、一灣青玉、傲雪碧玉和日本甜

42、寶一類，白沙蜜、白雪一號(hào)和賽雪皇后一 類。引物w97225可以將一大類分成了三小類：運(yùn)蜜一號(hào)和新輝甜瓜一類，銀輝、新玉甜瓜和日本甜寶 類，還冇津甜一號(hào)、一灣青玉和傲雪碧玉一類。再用引物w97255已經(jīng)可以將運(yùn)蜜一號(hào)和新輝甜瓜區(qū)分開(kāi)，將li木甜寶與銀輝、新玉甜瓜區(qū)分開(kāi), 將傲雪碧玉與津甜一號(hào)、一灣青玉區(qū)分開(kāi)，將白沙蜜與白雪一號(hào)、賽雪皇后區(qū)分開(kāi)。另外再用引物w97295可以將銀輝、新玉甜瓜區(qū)分開(kāi)，將白雪一號(hào)、賽雪皐后區(qū)分開(kāi)。用引物w97276將津甜一號(hào)、一灣青玉區(qū)分開(kāi)。就這樣，通過(guò)這5個(gè)具有特異性的引物就可以將 11個(gè)薄皮的甜瓜品種區(qū)分開(kāi)。因此,通過(guò)使用引物w97274、w97225、w97255

43、. w97295和w97276,我們可以將所試11個(gè)甜瓜品種逐一區(qū)分開(kāi)，具體見(jiàn)圖10所示呵:w97274w97225w97255w97295w97255運(yùn)蜜一號(hào)新輝甜瓜廠銀輝1新玉甜瓜日本甜寶w97276津甜一號(hào)w97255一灣青玉傲雪碧玉w97255白沙蜜w97295白毛1-賽雪皇后圖19 11個(gè)甜瓜品種的分析圖fig. 19 analysis process of 11 cucumis melo l.苦瓜這部分的實(shí)驗(yàn)也正在進(jìn)行當(dāng)小。2. 4甜瓜種子純度的檢測(cè)根據(jù)特界引物，我們可対某一甜瓜品種進(jìn)行純度和真實(shí)性檢測(cè)。j圖20甜瓜種了純度檢測(cè)引物:w97295；模板：銀輝;m： dna mark

44、er (dl2000)fig. 20 result of the cucumis melo【“seeds purity testingprimer: w97295; template: yinhui; m: dl2000 dna marker圖21甜瓜種子純度檢測(cè)引物：w97295；模板：銀輝；m： dna marker (dl2000)fig. 20 another result of the cucumis melo l. seeds purity testingprimer: w97295; template: yinhui; m: dl2000 dna marker通過(guò)rapd的快速檢

45、測(cè)，可知檢測(cè)的種子純度約為83. 3%o3討論由于rapd是胃接以基因纟fl dna為模板擴(kuò)增的產(chǎn)物，所以用rapd分了標(biāo)記方法鑒定的結(jié)果可 靠，不受環(huán)境的影響。rapd標(biāo)記涉及pcr反應(yīng)屮的變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間，以及反應(yīng)過(guò)程 循環(huán)數(shù)，反應(yīng)體系中的多種試劑來(lái)源、濃度,mg?+濃度、模板dna的量和純度等諸多因素的影響。因 此，有的學(xué)者認(rèn)為rapd靈敏度高，但可重復(fù)性差。但本研究表明：只耍反應(yīng)條件適當(dāng)，反應(yīng)體系中多 種試劑來(lái)源和濃度保證一致并嚴(yán)格控制反應(yīng)程序的各個(gè)環(huán)節(jié)及各個(gè)循環(huán)參數(shù)的穩(wěn)定性，重復(fù)結(jié)果是不 難得到的。在pcr反應(yīng)程序中，退火溫度的影響最為明顯。由于rapd是尋找特異性擴(kuò)增帶

46、的過(guò)程， 所以合適的退火溫度尤為重要。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況，39°c. 40°c是很好的選擇。其它程序像變性、復(fù)性和 擴(kuò)增的溫度、時(shí)間以及循環(huán)的次數(shù)，變性和延伸溫度等對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響相対退火溫度而言較少。至此， 本實(shí)驗(yàn)基本上以完成了對(duì)pcr-rapd反應(yīng)條件的摸索，建立在各最優(yōu)濃度和組合下的rapd反應(yīng)，有 效性和穩(wěn)泄性均有較好的保證。rapd 分析應(yīng)用于厚皮甜瓜 british queen> earps favouritecrenshaw> pak istan2981）卩習(xí)及 earl's favourite的3個(gè)品系（春系3號(hào)、磐田2號(hào)、夏系722）間的比較。劉

47、富中等利用rapd鑒定厚皮甜 瓜雜交種中蜜1號(hào)、中蜜2號(hào)、中蜜3號(hào)及其親本的遺傳純度，建立了快速鑒定甜瓜純度的技術(shù)體系, 構(gòu)建其特有指紋圖譜，為甜瓜品種保護(hù)和雜交制種屮純度和真實(shí)性的快速準(zhǔn)確鑒定提供了技術(shù)保證。 樂(lè)錦華等利用20個(gè)隨機(jī)引物對(duì)厚皮甜瓜8個(gè)親本與4個(gè)雜交種進(jìn)行了 rapd分析，結(jié)果表明，可以 利用rapd標(biāo)記在dna水平上進(jìn)行厚皮甜瓜親緣關(guān)系的鑒定。劉萬(wàn)勃說(shuō)利用rapd和issr兩種分子標(biāo) 記技術(shù)對(duì)37份甜瓜種質(zhì)進(jìn)行了多樣性研究。在供試材料屮篩選到具有多態(tài)性的rapd引物21個(gè)，issr 引物10個(gè)等等。本研究可以用5個(gè)特異引物將11個(gè)甜瓜品種(文獻(xiàn)上沒(méi)有被研究過(guò)的)區(qū)分開(kāi)來(lái)， 而

48、且可以用有特異性擴(kuò)增的引物檢測(cè)了其中一個(gè)品種，結(jié)果顯示rapd分了標(biāo)記在用在甜瓜種了檢測(cè)。 這種方法也町以對(duì)市面上銷售的甜瓜品種進(jìn)行種子純度鑒定。用rapd分子標(biāo)記鑒定種子純度，有兩種情況口7，詢：一是有父母本種子時(shí)是要尋找到至少一條 dna特征帶，通過(guò)対f1種子和父母本種子dna帶型的比較來(lái)鑒定珀種子純度。但是本研究是市場(chǎng)上 所銷售的種了，缺少父母木。二是rapd應(yīng)用于兒常規(guī)品種種了純度檢驗(yàn)時(shí)，要求選擇hl標(biāo)品種a的 rapd圖譜中出現(xiàn)而其他常規(guī)甜種中不出現(xiàn)的dna譜帶作為鑒定純度用的特界譜帶。為保證檢測(cè)結(jié)果 的真實(shí)性和町靠性，尋求特異譜帶的研究屮通常應(yīng)選川較多的其他非fi標(biāo)常規(guī)品種。為此，

49、本研究就 是通過(guò)pcr優(yōu)化條件卜篩選出一些引物能將11品種區(qū)分開(kāi)來(lái)。再用能區(qū)別不同品種的引物檢驗(yàn)其中 -種品種的種子純度。結(jié)果顯示該方法能應(yīng)用在甜瓜品種純度上。4.參考文獻(xiàn)1 王志敏、牛義、宋明等rapd技術(shù)在蔬菜研究中的應(yīng)用j西南園藝.2005, 33(5):21-22, 29.2 苗玉新、劉麗艷、包春蓮.pcr和rapd技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的應(yīng)用j.農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研 究.2005, 21(5) :231-234.3 辛景樹、郭景倫、張軟斌.兒種常用分了標(biāo)記技術(shù)在種了純度和品種真實(shí)性鑒定方面的比較與分析 j種子.2005, 24 (1)： 58-60.4 孫妮、胡開(kāi)林、張長(zhǎng)遠(yuǎn).rapd技術(shù)鑒

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