生物化學實驗技術操作指導(共享)

1、生物化學實驗技術操作指導天津科技大學生物化學課程組2006.12目錄生物化學實驗須知2實驗室一些常用知識介紹3實驗一：離子交換法分離氨基酸7實驗二：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)9實驗三：馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質(zhì)實驗13實驗四：堿性蛋白酶活力的測定 16實驗五：植物組織中dna和rna的提取和鑒定 19實驗六：糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定22實驗七：綜合設計實驗一蛋白質(zhì)的制備及其含量測定24實驗八:還原糖和總糖的測定（3, 5二硝基水楊酸法）35實驗十：氨基酸的分離鑒定一紙層析法39實驗十一：細菌血栓溶解酶活性測定41實驗十二：可溶性糖的硅膠g薄層層析43實驗十三：植物材料中總黃酮的提純與鑒定4

2、4實驗十四：ief/sds-page 雙向電泳分離鑒定蛋白質(zhì)45附錄49一、實驗室主要儀器使用操作規(guī)程與注意事項49二、常用緩沖溶液的配制5560三、硫酸錢飽和度的常用表生物化學實驗須知1. 實驗室規(guī)則(1) 實驗課必須提前5分鐘到實驗室，不遲到,不早退，應白覺遵守課堂紀律。(2) 使用儀器、藥品、試劑和各種物品必須注意節(jié)約，應特別注意保持藥品和試劑的純 凈，嚴防混雜污染。(3) 實驗臺、試劑藥品架必須保持整潔，儀器藥品擺放井然冇序。實驗完畢，需將藥品、 試劑排列整齊，儀器洗凈倒置放好，實驗臺面抹拭干凈，經(jīng)教師驗收儀器后，方可離開實驗 室。(4) 使用和洗滌儀器時，應小心謹慎，防止損壞儀器。使

3、用精密儀器時，應嚴格遵守操作 規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障應立即報告教師，不要自己動手檢修。(5) 在實驗過程中要聽從教師的指導，嚴肅認真地按操作規(guī)程進行實驗，并簡耍、準確 地將實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)記錄在實驗記錄木上。課示寫出實驗報告，由課代表收齊交給教師。(6) 儀器損壞時，應如實向教師報告，真填寫損壞儀器登記表，然后補償一定金額。(7) 每次實驗課安排同學車侖流值日，值日生耍負責當天實驗的衛(wèi)生和安全檢查。2. 實驗記錄實驗課前應認真預習實驗內(nèi)容，將實驗名稱、實驗原理、實驗內(nèi)容和步驟等簡單扼要寫 在記錄本上。實驗記錄本要標明頁碼，不能隨意撕掉任何一頁。實驗中使用的試劑純度和終濃度以及使用的儀器類型等都要記錄清楚

4、。實驗中觀察到的 現(xiàn)象、結(jié)果和得出的數(shù)據(jù)，應及時直接記在記錄本上，絕對不可以隨意記在單片紙上。原始 記錄必須準確、簡練、清楚。3. 實驗報告的書寫實驗結(jié)束后，應及時整理和總結(jié)實驗結(jié)果，寫出實驗報告。(1) 標題標題應包括實驗名稱、實驗時間、實驗室名稱、實驗組號、實驗者及同組者姓名、實驗 室條件。（2）實驗目的（3）實驗原理應簡述基本原理，不要完全照抄實驗指導書。（4）操作步驟操作步驟（或方法）可以采用流程圖的方式或h行設計的表格來表達。（5）實驗結(jié)果將實驗中的現(xiàn)彖、數(shù)據(jù)進行整理、分析，得出相應的結(jié)論。建議盡量使川圖表法來表示 實驗結(jié)果，這樣可以使實驗結(jié)果清楚明了。（6）討論包括對實驗結(jié)果及觀察

5、現(xiàn)彖的小結(jié)、對實驗中遇到的問題和思考題的探討以及對實驗的 改進意見等。4. 生物化學實驗課評分標準實驗預習情況（1（）%） 實驗操作情況（20%）實驗報告情況（30%） 實驗考試成績（40%）實驗室一些常用知識介紹一. 玻璃儀器的洗滌及一些常用的洗滌劑1. 玻璃儀器的洗滌（1）新購買的玻璃儀器，首先用白來水洗去表面灰垢，然后用洗衣粉刷洗，h來水沖凈后, 浸泡在1%2%鹽酸溶液中過棧以除去玻璃表血的堿性物質(zhì)。最后，用自來水沖洗干凈，并 用蒸憎水沖洗2次。（2）對于使用過的玻璃儀器，應先用h來水沖洗，再用毛刷蔭取洗衣粉刷洗。用h來水充分 沖洗后再用蒸僻水沖洗2次。凡洗凈的玻璃儀器壁上都不應帶有水珠

6、，否則表示尚未洗凈, 需重新洗滌。（3）比較臟的儀器或不便刷洗的儀器，使川前應丿ij流水沖洗，以除去粘附物，如果儀器上冇 凡士林或其他油污，應先用軟紙擦除，再用有機溶劑擦凈，最后用口來水沖洗。待儀器晾干 示，放入倂酸洗液屮浸泡過夜。取出后用自來水充分沖洗，再用蒸館水沖洗2次。（4）普通玻璃儀器可在烘箱內(nèi)烘干，但定量的玻璃儀器如吸管、滴定管、量筒、容量瓶等 不能加熱，應晾干備用。另外，分光光度計中的比色杯的四壁是用特殊膠水粘合而成，受熱 示會散架，所以也不能烘干。對疑有傳染性的樣品（如肝炎病人的血清），其容器應先消毒再清洗。盛過劇毒藥物或 放射性同位素物質(zhì)的容器，應先經(jīng)過專門處理后再清洗。2.

7、一些常用的洗滌劑a. 肥皂水或洗衣粉溶液這是最常用的洗滌劑，主要是利用其乳化作用以除去污垢，-般玻璃儀器均可用其刷洗。b. 鉆酸洗液（重鉆酸鉀一硫酸洗液）餡酸洗液廣泛用于玻璃儀器的洗滌，其清潔效力來占于它的強氧化性(6價洛)和強酸性。 餡酸洗液具有強腐蝕性，使用時應注意安全。洛酸洗液可反復使用多次，如洗液由紅棕色變 為綠色或過于稀釋則不宜再用。c. 5%-10%乙二胺四乙酸二鈉(edta-na2)溶液:加熱煮沸,利用ed-ta和金屬離子的 強配位效應，可去除玻璃器1111內(nèi)部鈣鎂鹽類的口色沉淀和不易溶解的重金屬鹽類。d. 45%的尿素洗液：是蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌盛蛋白質(zhì)制劑血樣的容器。

8、e. 乙醉一硝酸混合液用于清洗一般方法難于洗凈的冇機物，最適合于洗滌滴定管。二. 生物化學常用緩沖液1. 磷酸鹽緩沖液磷酸鹽是生物化學研究中使用最廣泛的一種緩沖劑，由于它們是二級解離，有2個pka值, 所以用它們配制的緩沖液,ph范圍最寬：nabpoq： pka)=2.12, pka2=7.21na2hp04： pkai=7.2l pka2= 12.32配酸性緩沖液：用nah2p04, ph值為14。配中性緩沖液：用混合的兩種磷酸鹽,ph值為6-8o配堿性緩沖液：用na2hp04, ph值為1()12 。磷酸鹽緩沖液的優(yōu)點為： 容易配制成各種濃度的緩沖液； 適用的ph范圍寬； ph受溫度的影響

9、?。?緩沖液稀釋后ph變化小，如稀釋1()倍后ph的變化小于().1。其缺點為： 易與常見的ca2 mg2+以及重金屬離子締合生成沉淀； 會抑制某些生物化學過程，如對某些酶的催化作用會產(chǎn)生某種程度的抑制作用。2tris緩沖液(三輕甲基氨基甲烷)tris緩沖液在生物化學研究中使用的越來越多，冇超過磷酸鹽緩沖液的趨勢，如在sds- 聚內(nèi)烯酷膠凝膠電泳中己都使用tris緩沖液，而很少再用磷酸鹽。tris緩沖液的常用有效ph范圍是在“小性”范圍，例如tris-hcl 緩沖液 ph 值為 7.58.5tris-磷酸鹽緩沖液ph值為5.09.0tris-hcl緩沖液的優(yōu)點是: 因為tris堿的堿性較強，所

10、以可以只用這一種緩沖體系，配制ph范圍由酸性到堿性 的大范圍ph值的緩沖液； 對生物化學過程t擾很小，不與鈣離子及重金屬離子發(fā)半沉淀。其缺點是： 緩沖液的ph值受溶液濃度影響較人，緩沖液稀釋10倍,ph值的變化人于0.1; 溫度效應大，溫度變化対緩沖液ph值的影響很大，例如4°c時緩沖液的ph值為8.4, 則37 °c時的ph值為7.4,所以一定要在使用溫度下進行配制，室溫下配制的tris-hcl 緩沖液不能用于04°c; 易吸收空氣屮的co2,所以配制的緩沖液要蓋嚴密封； 此緩沖液對某些ph電極發(fā)生一定的t擾作用，所以要使用與tris溶液具有兼容性的電 極。3硼

11、酸鹽緩沖液常用的有效ph范圍是：ph值為8.510.0,因而它是堿性范圍內(nèi)最常用的緩沖液，其優(yōu)點 是配制方便，只使用-種試劑，缺點是能與很多代謝產(chǎn)物形成絡合物，尤其是能與糖類的短 基反應生成穩(wěn)定的復合物而使緩沖液受到干擾。4.氨基酸緩沖液此緩沖液使用的范圍寬，可用于ph值為2.011.0,例如最常用的有：甘氨酸-hc1緩沖液：ph值為2.05.0 o甘氨酸-naoh緩沖液：ph值為8.011.0 。甘氨酸-tris緩沖液：ph值為&0-11.0(此緩沖液用于廣泛使用的sds聚丙烯酰胺凝膠 電泳的電極緩沖液)。紐氨酸緩沖液：ph值為5.56.5 o甘氨酰胺(glycine amide)緩

12、沖液：ph值為7.8-s.8。甘氨酰甘氨酸(glycylglycine緩沖液：ph值為8.0-9.0 。此類緩沖體系的優(yōu)點是：為細胞組分和各種提取液提供更接近的天然環(huán)境。其缺點是：與竣酸鹽和磷酸鹽緩沖體系相似，也會干擾某些牛物化學反應過程，如代謝過 程等；試劑的價格鮫高。三. ph值的測定測定溶液ph值通常有兩種方法，最簡便但較粗略的方法是用ph試紙，分為廣泛和 精密ph試紙兩種。精確測定溶液ph值要使用ph計，其精確度可達0.005個ph單位，關鍵是要正確 選用和校對ph電極。過去是使用兩個電極，即玻璃電極和參比電極，現(xiàn)在它們己淘汰，被 兩種電極合一的復合電極所代替。玻璃電極對溶液中的氫離子

13、濃度敏感，其頭部為一薄玻璃泡，內(nèi)裝冇0.1mol/l hc1,上 部由銀-氯化銀電極與伯金絲聯(lián)結(jié)。當玻璃電極浸入樣品溶液時，薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)的電位 差取決于溶液的ph值，即玻璃電極的電極電位隨樣品溶液中氫離子濃度(活度)的變 化而變化。參比電極的功能是提供一個怛定的電位，作為測最玻璃電極薄玻璃泡內(nèi)外兩側(cè)電位差 的參照。常用的參比電極是廿汞電極(hg/hgcl)或銀氯化銀電極(ag/agcl) o參比電極 電位是氯離子濃度的函數(shù)，因而電極內(nèi)充以4mol/l kc1或飽和kc1,以保持恒定的氯離 子濃度和恒定的電極電位。使用飽和kc1是為使電極內(nèi)沉積有部分kc1結(jié)品，以使kc1 的飽和濃度不受溫度

14、和濕度的影響?，F(xiàn)在ph值測定已都改用玻璃電極與參比電極合一的復合電極，即將它們共同組裝在 -根玻璃管使用時應注意： 經(jīng)常檢査電極內(nèi)的4mol/lkcl溶液的液面，如液而過低則應補充4mol/lkc 1溶液。(2) 玻璃泡極易破碎，使用時必須極為小心。復合電極長期不用，可浸泡在2mol/l kc1溶液屮，平時可浸泡在無離子水或緩沖溶液 中，使用時取出，用洗并沖洗玻璃泡部分，然后用吸水紙吸干余水，將電極浸入待測溶液中， 稍加攪拌，讀數(shù)時電極應靜止不動，以免數(shù)字跳動不穩(wěn)定。(4)使川時復合電極的玻璃泡和半透膜小孔耍浸入到溶液屮。使用前要用標準緩沖液校正電極，其數(shù)據(jù)見書后附錄，常用的3種標準緩沖液ph

15、值 4.00、6.88和9.23(20 °c ),精度為土 0.002ph單位。校正時先將電極放入6.88的標準 緩沖液中，用ph計上的”標準”旋鈕校正ph讀數(shù)，然后取出電極洗凈，再放入ph 值為4.00或9.23的標準緩沖液屮，用”斜率”旋鈕校正ph讀數(shù)，如此反復多次，h 至二點校正正確，再用第三種標準緩沖液檢查。標準緩沖液不用時應冷藏。(6)電極的玻璃泡容易被污染。若測定濃蛋白質(zhì)溶液的ph值吋，玻矚泡表面會覆蓋一層 蛋白質(zhì)膜，不易洗凈而干擾測定，此時可用o.lmol/l hc1的llnurnl胃蛋白酶溶液浸泡過 夜。若被油脂污染，可用丙酣浸泡。若電極保存時間過長，校正數(shù)值不準時，

16、可將電極放入 2mol/lkc1溶液中,40 °c加熱lh以上,進行電極活化。ph測定時會有幾方面的謀差：鈉離子的干擾：多數(shù)復合電極對na+和h+都非常敏感，尤其是高ph值的堿性溶 液，na的t擾更加明顯。例如,當na+濃度為0.1 mol/l時，可使ph值偏低0.40.5個 單位。為減少na+對ph測定的干擾，每個復合電極都應附有-條校正na+干擾的標準 曲線，有的新式的復合電極具有na+不透過性能，如不具備以上兩個條件，則可以將電極 內(nèi)的kc1換成nacl。(2濃度效應:溶液的ph值與溶液屮緩沖離了濃度和其他鹽離了濃度有關，因為溶液ph 值取決于溶液中的離子活度而不是濃度，只有在

17、很稀的溶液中，離子的活度才與其濃度相 等。生化實驗中經(jīng)常配制比使用濃度高10倍的”貯液”，使用時再稀釋到所需濃度，由 于濃度變化很人，溶液ph會有變化，因此稀釋后仍需對其ph進行調(diào)整。(3) 溫度效應：有的緩沖液的ph受溫度影響很大，如tris緩沖液，因此配制和使用都要在 同一溫度下進行。實驗離子交換法分離氨基酸一、實驗目的學習用陽離子交換樹脂柱分離氨基酸的操作方法和基木原理。二、實驗原理離子交換層析(ion exchange chromatography,簡稱ice)是分析和制備樣品混合物的液 固相層析方法，是基于待測物質(zhì)的陽離了或陰離了和相對應的離了交換劑間的靜電結(jié)合， 即根據(jù)物質(zhì)的酸堿性

18、、極性等差界，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質(zhì)溶液各紐分分 開。它是從復朵混合物體系中分離性質(zhì)極為相似的生物分子的有效手段0。由于帶電荷不 同的各種物質(zhì)對離了交換劑有不同親和力，通過改變洗脫液的離了強度和ph值，控制這種 親和力，即可使這些物質(zhì)依據(jù)親和力人小順序依次從層析柱屮洗脫下來。氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的ph值，各種氨 基酸分子結(jié)構(gòu)不同，在同一 ph值時所帶電荷的性質(zhì)（正、負）和多少不同，與離了交換樹 脂的親和力有差異，因此可根據(jù)親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫卜來，達到分離的 效果。三、儀器與試劑（一）實驗器材（1）玻璃層析柱（2）試管（3）

19、移液管（4）恒圧洗脫瓶（5）部分收集器（6）水浴鍋（7）分光光度計（8）電爐（二）材料與試劑（1）苯乙烯磺酸鈉型樹脂（100200目）（2）2mol/l鹽酸溶液（3）2mol/l氫氧化鈉溶液（4）標準氨基酸溶液：將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/ml的0.1mol/l鹽酸溶液。（5）混合氨基酸溶液：將上述天門冬氨酸和賴氨酸溶液按1： 4比例混合。（6）檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸溶液（ph5.8,鈉離子濃度0.45mol/l）：取檸檬酸14.25克、氫 氧化鈉9.30克分別溶于水后混合，加入濃鹽酸5.25毫升，定容至500毫升；4c冰箱保存。（7）顯色劑：2克水合苗三酮溶于95%乙醇中,加水至10

20、0毫升。四、操作步聚（1）層析柱的準備：將強酸性陽離了交換樹脂用氫氧化鈉處理成na*型后洗至中性，攪拌1 小時后裝入層析柱，使之白然降沉到一定高度，用緩沖液平衡。（2）平衡：用ph5.8的檸檬酸緩沖液沖洗平衡離子交換柱，調(diào)節(jié)流速，收集洗脫液至4倍 床體積即可上樣。（3）加樣分離：將液面緩慢放至貼近層析柱表曲，由柱上端仔細加入氨基酸混侖液0.250.5 亳升，同時開始收集流出液。當樣品液彎月血靠近樹脂頂端時，立即加入0.5毫升檸檬酸緩 沖液。待緩沖液彎月血靠近樹脂頂端時，再加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。如此重復兩次，然 后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液（切勿攪動床面）。川試管收集洗脫液，每管收集1毫升

21、， 直至無氨基酸流出為止。（4）氨基酸的鑒定：向各管收集液中加入1毫升水合苗三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中加 熱15分鐘，冷至室溫測定光密度值。以收集的管數(shù)為橫坐標，以吸光度值a為縱坐標，繪 制洗脫曲線。（用以已知兩種氨基酸的純?nèi)芤簽闃悠?，按上述方法和條件分別操作，將得到 的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照，即可確定兩個峰為何種氨基酸。）五、思考題1. 何謂氨基酸的離子交換？本實驗采用的離子交換劑屬于哪一種？2. 離子交換樹脂用緩沖液平衡，為何乂用緩沖液沖洗？實驗屮為什么要用ph5.8的檸檬酸緩 沖液？可不可以用其它ph值的緩沖液？如果可以，應選用的ph為多少？并闡述原理。3. 苗三酮顯色劑在

22、與氨基酸顯色時，是為氨基酸的什么基團反應？反應條件是什么？顯色吋 為什么要沸水浴加熱？顯色原理是什么？4. 木實驗分離的兩種氨基酸，是否可以采用陰離了交換樹脂分離，如果使用陰離了樹脂，條 件和結(jié)果如何？請說明原理。5. 除氨基酸外，用離子交換柱層析法還適合分離哪些物質(zhì)？為什么？實驗二:垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)一、實驗目的學習sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sds-page）測定蛋口質(zhì)的分子量的原理和基本 操作技術。二、實驗原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在一定的ph條件下解離而帶電荷。當溶液的ph大于蛋白 質(zhì)的等電點（pl）時，蛋白質(zhì)本身帶負電，在電場屮將向正極移動：當溶液的ph小于蛋 白質(zhì)的

23、等電點時，蛋白質(zhì)帶正電，在電場中將向負極移動；蛋白質(zhì)在特定電場中移動 的速度取決于其木身所帶的凈電荷的多少、蛋白質(zhì)顆粒的大小和分了形狀、電場強度 等。聚丙烯酰胺凝膠是由一定量的內(nèi)烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合而成的三維網(wǎng)狀孔結(jié) 構(gòu)。本實驗采用不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，調(diào)整雙內(nèi)烯酰胺用量的多少，對制成不同孔徑的 兩層凝膠；這樣，當含有不同分子量的蛋口質(zhì)溶液通過這兩層凝膠時，受阻滯的程 度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。由于上層膠的孔徑較人，不同大小的蛋白質(zhì)分子在 通過大孔膠時，受到的阻滯基本相同，因此以相同的速率移動；當進入小孔膠時， 分了量人的蛋白質(zhì)移動速度減慢，因而在兩層凝膠的界面處，樣品被壓縮成很窄的 區(qū)帶。這就

24、是常說的濃縮效應和分子篩效應。同時，在制備上層膠（濃縮膠）和下層 膠（分離膠）吋，采用兩種緩沖體系；上層膠ph二6. 76. 8,下層膠ph = 8. 9； tris hci緩沖液中的tris用于維持溶液的電中性及ph,是緩沖配對離了； ci是前導 離子。在ph6.8時，緩沖液中的gly為尾隨離子，而在ph = 8.9吋，gly的解離度 增加；這樣濃縮膠和分離膠之間ph的不連續(xù)性，控制了慢離子的解離度，進而達到 控制其冇效遷移率的。不同蛋白質(zhì)具冇不同的等電點，在進入分離膠后，各種 蛋口質(zhì)由于所帶的靜電荷不同，而有不同的遷移率。由于在聚丙烯酰胺凝膠電泳屮 存在的濃縮效應，分子篩效應及電荷效應，使

25、不同的蛋口質(zhì)在同一電場屮達到有效 的分離。如果在聚內(nèi)烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉(sds),由于sds帶 有人量的負電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是在強還原劑如 疏基乙醇存在下，蛋口質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鏈完全伸展，使蛋口質(zhì)分子與 sds充分結(jié)合，形成帶負電性的蛋白質(zhì)一sds復合物；此吋，蛋白質(zhì)分子上所帶的負 電荷量遠遠超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷最，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷上的差異。 蛋白質(zhì)分子量愈小，在電場中移動得愈快；反之，愈慢。蛋白質(zhì)的分子最與電泳遷 移率之間的關系是：mr=k(10-b，b) logmr=logkb r”式中mr蛋白質(zhì)的分子量；logk

26、截距；b斜率；乩相対遷移率。實驗證明，蛋白質(zhì)分了量在15,000200,000的范圍內(nèi)，電泳遷移率與分了量 的對數(shù)之間呈線性關系。蛋口質(zhì)的相對遷移率監(jiān)=蛋口質(zhì)樣品的遷移距離/染料(漠 酚藍)遷移距離。這樣，在同一電場中進行電泳，把標準蛋白質(zhì)的相對遷移率與相應 的蛋白質(zhì)分了量對數(shù)作圖，由未知蛋白的相對遷移率可從標準曲線上求出它的分了 量。sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)法測定蛋口質(zhì)的分子量具有簡便、快速、重 復性好的優(yōu)點，是h前一般實驗室常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。三、試劑及主要器材1. 主耍試劑1) 標準蛋白混合液內(nèi)含：磷酸化酶(mw 94, 000),牛血清蛋白(mw 67,

27、 000),肌動蛋白(mw 43, 000)，磷酸肝 酶(mw 30, 000)和溶菌酶(mw 14,000)2) 30%凝膠貯備液：acr 30g, bis 0. 8g,加蒸錦水至100ml3) 分離膠緩沖液(1. 5mol / l) : tris 18. 15g,加水溶解,6mol/l hc1 調(diào) ph8. 9,定容 100ml4) 濃縮膠緩沖液(0. 5mol / l): tris 6g,加水溶解,6mol/l hc1調(diào)ph6. 8,并定容 到 looml5) 電極緩沖液(ph8. 3)： sds lg, tris 6g, gly 28. 8g,加水溶解并定容到loooml。用 時稀釋五

28、倍。6) 10%sds7) 10%過硫酸鞍(新鮮配制)8) 1%temed9) 上樣緩沖液:0. 5mol / l tris-hcl ph6. 81. 25ml, 50% 甘油 4ml, 10%sds 2ml,疏基乙醇0. 4ml, 0.1%漠酚藍0. 4ml,加蒸餡水定溶至10ml<>10) 0.25%考馬斯亮藍r-250染色液：考馬斯亮藍r - 250 1.25g, 50%卬醇454譏， 冰乙酸46mlo11）脫色液：冰乙酸35ml,蒸錨水465 ml012）未知分子量的蛋口質(zhì)樣品（lmg/ml ）2. 實驗器材1）dycz-24d垂直板電泳槽（北京市六一儀器廠）2）電泳儀3）

29、長滴管及微量加樣器4）燒杯（250ml八 500ml）、量筒（500ml> 250ml）、培養(yǎng)皿（15cmx 1 5cm）5）注射器等 四、實驗操作1. 裝板將密封用硅膠框放在平玻璃上，然后將凹型玻璃與平玻璃重疊，將兩塊玻璃立 起來使底端接觸桌面，用手將兩塊玻璃夾住放入電泳槽內(nèi)，然后插入斜插板到適屮 程度，即可灌膠。2. 凝膠的聚合分離膠和濃縮膠的制備：按卜-表屮溶液的順序及比例，配h 10%的分離膠和4.8%的濃縮膠。試劑名稱10%的分離膠/ml4. 8%的濃縮膠/mlacr/bis 30%51.6分離膠緩沖液（兇89）3. 750濃縮膠緩沖液（兇68）01.2510%sds0. 15

30、0. 110%過硫酸謖0. 10. 1水54. 95temed11按上表各液加入混勻后配制成分離膠后，將凝膠液沿凝膠腔的長玻璃板的內(nèi)而緩 緩用滴管滴入，小心不要產(chǎn)生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿2cm處為止，約5n±。 然后用細滴管或注射器仔細注入少量水，約0. 5-lmlo室溫放置聚合30-40mino待分離膠聚合后，用濾紙條輕輕吸去分離膠表而的水分，按上表制備濃縮膠。用 長滴管小心加到分離膠的上面，插入樣品模子（梳子）；待濃縮膠聚合后，小心拔出樣 品模子。3. 蛋白質(zhì)樣品的處理若標準蛋口質(zhì)或欲分離的蛋口質(zhì)樣品是固體，稱取lmg的樣品溶解于lnil 0. 5mol /l ph6.8

31、tris-鹽酸緩沖液或蒸憎水中；若樣品是液體，要測定蛋白質(zhì)濃度，按1.0 1.5mg/ml溶液比例，取蛋白質(zhì)樣液與樣品處理液等體積混勻。本實驗所用樣詁為15 20pg的標準蛋白樣品溶液，放置在0. 5ml的離心管中，加入1520pil的樣品處理液。 在100°c水浴中處理2min,冷卻至室溫后備用。吸取未知分子量的蛋口質(zhì)樣品20卩1,按照標準蛋口的處理方法進行處理。4. 加樣sds聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法用手夾住兩塊玻璃板，上提斜插板使其松開，然后取下玻璃膠室去掉密封用硅膠 框，注意在上述過程小手始終給玻璃膠室一個夾緊力，再將玻璃膠室凹而朝里置入電 泳槽，插入斜板，將緩沖

32、液加至內(nèi)槽玻璃凹面以上，外槽緩沖液加到距平板玻矚上沿 3nun處即可，注意避免在電泳槽內(nèi)出現(xiàn)氣泡。加樣時可用加樣器斜靠在提手邊緣的凹槽內(nèi)，以準確定位加樣位置，或用微量 注射器依次在各樣品槽內(nèi)加樣，各加1015卩1（含蛋白質(zhì)1015|ig）,稀溶液可加 2030承（還要根據(jù)膠的厚度靈活掌握）。5. 電泳加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關后，樣品進膠前電流控制 在1520ma,人約1520min；樣品屮的澳酚藍指示劑到達分離膠之后，電流升到 3045ma,電泳過程保持電流穩(wěn)定。當漠酚藍指示劑遷移到距前沿12cm處即停止 電泳，約12小時。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。6.

33、染色、脫色電泳結(jié)束后，關掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕 輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入 銅絲作為標志，放入人培養(yǎng)1111屮染色，使用0.25%的考馬斯亮藍染液，染色24h, 必要時可過夜。棄去染色液，用蒸憎水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經(jīng) 常換脫色液，直至蛋口質(zhì)帶清晰為止。7. 結(jié)果處理1）測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質(zhì)樣品移動距離（即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔 的距離），測蜃指示染料遷移的距離。2）按以下公式計算蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率（rm）相對遷移率=樣品遷移距離（cm） /染料遷移距離（cm）3）標準曲線的

34、制作：以各標準蛋白質(zhì)相對遷移率為橫坐標，蛋片質(zhì)分了量的對數(shù)為 縱坐標在半對數(shù)坐標紙上做圖，得到一條標準曲線。4）測定蛋白質(zhì)樣品的分了量：根據(jù)待測蛋白質(zhì)樣品的相對遷移率，從標準曲線上查 得該蛋口質(zhì)的分子量。五、思考題1. 聚內(nèi)烯酰胺盤狀凝膠電泳的兒個不連續(xù)性是什么？2. 電泳時的三個物理效應是什么？是怎樣造成的？3. 電泳后上下槽緩沖液可否混合后再使用？為什么？4 上樣緩沖液中加入廿油的作用是什么？5. 貯液配制及貯存應注意什么？6. 過硫酸鞍、7%乙酸和考馬斯亮藍在實驗中有什么作用？實驗三：馬鈴薯多酚氧化酶制備及性質(zhì)實驗一、實驗目的1. 學習從組織細胞中制備酶的方法。2. 掌握多酚氧化酶的作用

35、及各種因素對其作用的影響。二、實驗原理多酚氧化酶是一種含銅的酶，其最適ph值為67。由多酚氧化酶催化的反應，如以鄰 苯二酚為底物，可以被氧化形成鄰苯二釀。由多酚氧化酶催化的氧化還原反應可通過溶液的 顏色的變化鑒定，這個反應在口然界中是常見的，如玄皮的馬鈴薯和水果變成褐色就是由于 該陸作用的結(jié)果。多酚氧化酶的最適底物是鄰苯二酚（兒茶酚）。間苯二酚和對苯二酚與鄰苯二酚的結(jié)構(gòu) 相似，它們也可以被氧化為各種有色物質(zhì)。腮是牛物催化劑，其催化活性易受各種因素的影響，如溫度、ph、底物種類、底物濃度、 酶濃度以及抑制劑和蛋白質(zhì)變性劑等都會改變其生物催化活性。三、實驗器材1. 勻漿機2. 小刀，紗布，漏斗，其

36、它玻璃器皿3. 離心機4 冰箱5.恒溫水浴四、材料與試劑1. 馬鈴薯2. 0. lmol/l的naf溶液:將4. 2g氟化鈉溶于loooml水中。3. 0. 01mol/l的鄰苯二酚溶液:將1. lg鄰苯二酚溶解于loooml水中，用稀naoh調(diào)節(jié)溶液的 ph值為6.0,防止其口身的氧化作用。當溶液變成褐色時，應重新配制。新配制的溶液應貯存于棕色瓶中。4. ph6.8的磷酸鹽緩沖液5. 5%三氯乙酸溶液6. 硫腺7. 0. 01mol/l的間苯二酚溶液:將0. llg間苯二酚溶解于100ml水屮。8. 0. olmol/l的對苯二酚溶液:將0. llg對苯二酚溶解于100ml水中。9. 固體硫

37、酸¥安10. 0. 8%hc1： 19. 2ml 濃 hc1 加水稀釋到 looomlo11. 0.2%和0. 3% (v/v)的乳酸溶液。12. 0.5%的碳酸鈉溶液13. 0.01%的碳酸鈉溶液五、操作方法1. 多酚氧化酶的制備每三個小組一起，稱取150g馬鈴薯(新馬鈴薯口j以不去皮)，切塊后放入勻漿機，加 入150mlnaf溶液，勻漿后用四層紗布過濾。各組分別量取50ml濾液置離心管中，于3500轉(zhuǎn)/min離心510min,取上清夜，加入 固體硫酸錢16g,溶解，于4°c放置30min,于3500轉(zhuǎn)/min離心15min,倒掉上清液,沉淀 川15ml ph6. 8的磷

38、酸鹽緩沖液溶解，即為粗酶液，含有馬鈴薯多酚氧化酶。2. 多酚氧化酶的催化作用按表1加入各試劑，觀察反應現(xiàn)彖并記錄和分析原因。表1多酚氧化酶的催化作用試管號酶液鄰苯二酚水混勻后37°c保溫5lomin,觀察顏色變化115滴15滴215滴15滴315滴15滴3.多酚氧化酶的化學性質(zhì)按表2加入各試劑，觀察反應現(xiàn)彖并記錄和分析原因。表2多酚氧化酶的化學性質(zhì)試管號酶液5%三氯乙酸硫hr振蕩混勻后分別加入鄰苯二酚15滴，于37°c保溫lomin,觀察顏色變化115滴215滴15滴315滴少許4.底物專一性按表3加入各試劑，觀察反應現(xiàn)象并記錄和分析原因。表3多酚氧化酶的底物專一性試管號酶

39、液鄰苯1酚間苯1酚對苯二酚混勻后37°c保溫510min,觀察顏色變化115滴15滴215滴15滴315滴15滴5.底物濃度的影響按表4加入各試劑，觀察反應現(xiàn)象并記錄和分析原因。 表4底物濃度的影響試管號酶液鄰苯二酚水混勻后37°c保溫lmin,觀察顏色變化15滴1滴39滴25滴10滴30滴35滴40滴6.陸濃度的影響按表5加入各試劑，觀察反應現(xiàn)彖并記錄和分析原因。 表5酶濃度的影響試管號酶液鄰苯二酚水混勻后37°c保溫2min,觀察顏色變化115滴15滴21滴15滴14滴7.氫離子濃度的彩響按表6加入各試劑，觀察反應現(xiàn)彖并記錄和分析原因。管號123450. 8%

40、 hc140滴0. 3%乳酸10浦0. 2%乳酸40滴0.01%碳酸鈉40滴0. 5%碳酸鈉40滴鄰苯二酚7滴7滴7滴7滴7滴酶液7滴7滴7滴7滴7滴混合后ph值1357937 °c保溫 5min,觀察顏 色變化，確定 最適ph值六、思考題1. 在酶制備過程11 加入硫酸錢的日的是什么？2. 在多酚氧化iw性質(zhì)實驗中三氯乙酸和硫脈有什么作用？3. 該多酚氧化酶的授適pll值是多少？為什么？4. 通過實驗可知哪些因素會影響酶的催化活力？實驗四：堿性蛋白酶活力的測定(福林一酚試劑法)一、實驗目的 學習測定蛋口酶活力的方法。 掌握分光光度計的原理和使川方法。 學習繪制標淮曲線的方法。二、實

41、驗原理福林一酚試劑是磷鉗酸鹽與磷鉤酸鹽的混合物。它在堿性條件下不穩(wěn)定，能被酪氨酸 中的酚基還原，生成鉗藍、餌藍的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后產(chǎn)生的酪氨酸可與福林 酚試劑反應，所生成的藍色化合物可用比色法測定。三、實驗器材 分光光度計 恒溫水浴鍋 冷凝器四、材料與試劑 市售的堿性蛋口酶制劑。 0.4mo/l碳酸鈉：42.4gna2co3用蒸鎘水溶解.定容到looomlo 4mol/l三氯醋酸：65.6g三氯酷酸用蒸鐳水溶解，定容到1000 ml。 2%酪蛋白：2.()g酪蛋片加4()ml蒸鎘水，加35滴濃氨水，于沸水浴上溶解。用phll的硼酸鈉氫氧化鈉緩沖溶液定容到looomlo phll的硼酸

42、鈉氫氧化鈉緩沖溶液：o.lmol/lnaoh與0.05mol/lna2b4o7等體積混合。 福林一酚試劑：5()g鈣酸鈉(na2w042h20), 12.5g的酸鈉(na2mo()42h20),350ml水，25ml 85%磷酸，50ml濃鹽酸放入1000ml圓底燒瓶中，文火回流(保持微沸)10 h,撤下冷凝器，加150g硫酸鏗(so，25ml水，混勻加漠水約5ml脫色。直至金黃色 為止，再微沸15min,驅(qū)除殘漠，冷卻,用45號耐酸細菌漏斗過濾,定容到500ml,盛 于洗干凈干燥的棕色瓶中,使用時以1： 2稀釋。五、操作方法(1) 樣品處理精確稱収粉制腮制劑loghjph 11的硼酸鈉一氫氧

43、化鈉緩沖液溶解并定容到200ml,于40°c浸取30min,濾紙過濾，収2ml濾液用ph11的硼酸鈉氫氧化納緩沖液定容到50mlo(2) 比色測定取10ml離心管4支分別加入稀釋筋液l.omlo平行試驗3支空白試驗1支白,于40°c反應lomin。溫 lomirio 加2.0nil0.4mol/l三氯酷酸反 加l.oml2%的酪蛋白，反應15min應15min過濾。過濾。 i 取過濾液l.oml放入盛有5mlna2c03溶液的試管屮。 加l.oml 1： 2稀釋的福林一酚試劑(此試劑應最后加入)于40°c水浴發(fā)色20 min。 ©7220型分光光度計在6

44、80nm比色，比色1111厚1cm。(3) 比色常數(shù)(k)的求法將dl酪奴酸于105°c烘2h,精確稱取o.looog,加少® 0.2mol/l鹽酸加熱溶解，川蒸憎水定容到1000ml(每毫升含dl酪氨酸100.0 pg),取5支試管，按下表加樣。編號12345酪氨酸/ml00.20.40.60.8h2o/ml1.00.80.60.40.2na2co3/ml55555福林酚/ml11111od680搖勻于40°c發(fā)色20min,以0號管為空白，在680nm進行比色。以吸光度od為縱坐標，以dl酪氨酸含量(跑)為橫坐標作一直線，可求出比色常數(shù)k 單位吸光度值相當dl

45、酪氨酸的臨數(shù)，見示意圖lo圖1 dl 酪氨酸標準曲線示意圖計算活力單位規(guī)定：在phll, 40°c, lmin內(nèi)產(chǎn)生酪氨酸的酶最(g)為一個活力單位。 _4_總活力(u/g)=kx 10 xodx稀釋倍數(shù)式中 k為比色常數(shù)，dl酪氨酸吃/吸光度；od吸光度；稀釋倍數(shù)200x 50/2；4酶活測定液的稀釋倍數(shù)；10酶促反應時間，min。六、思考題1.0.4mol/l碳酸鈉、0.4mol/l三氯醋酸溶液的作用是什么?2. 為什么要把反應條件控制在ph值為11、溫度為40°c?3. 稀釋的酶溶液是否可以長期使用?為什么？實驗五：植物組織中dna和rna的提取和鑒定一、實驗目的 學

46、習和學握從植物組織中分離核酸的原理和操作方法。 學習和學握測定核酸含雖的定糖法（苔黑酚法和二苯胺法）的原理及操作方法。二、實驗原理核酸是生物體內(nèi)的主要化學成分，核酸在生物體內(nèi)主要以核蛋白的形式存在。核酸分 為脫氧核糖核酸（dna）利核糖核酸（rna）。dna主要存在在細胞核小，rna主耍 存在于細胞質(zhì)中。用冰冷的稀三氯乙酸或高氯酸溶液在低溫下抽提菜花勻漿，以除去酸溶性小分子物 質(zhì)。再由冇機溶劑如乙醇、乙醯等抽提，去除脂溶性的磷脂等物質(zhì)。授后用濃鹽溶液（10% 氯化鈉溶液）和0.5mol/l高氯酸（70°c）分別提取dna和rna。山于核酸和脫氧核糖核酸有特殊的顏色反應，經(jīng)顯色后所呈現(xiàn)

47、的顏色深淺在一定范圍 內(nèi)和樣品中所含的核糖和脫氧核糖的量成正比。因此可用定糖法來定性定量測定核酸。 核糖的測定：測定核糖的常用方法是苔黑酚法（3, 5二梵基甲苯，即orcinol反應）。當含有核糖的rna與濃鹽酸及3, 5二耗基甲苯在沸水水浴屮加熱1020min后，有綠 色物產(chǎn)生，這是因為rna脫u票吟后的核糖打酸作用生成糠酶，后者再與3, 5二輕基甲 苯作用生成綠色物質(zhì)。ch3a需rna+濃硫酸+ oh七亠oh尸心3綠色化合物注意：dna、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。 脫氧核糖的測定：測定脫氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脫氧核糖的dna在酸 性條件下和二苯胺在沸水浴中共熱后，產(chǎn)牛

48、.藍色。這是因為dna嚟吟核芹酸上的脫氧核 糖遇酸生成疑棊6 酮基戊醛，再與二苯胺作用產(chǎn)生藍色物質(zhì)。dna+少量濃硫酸或冰乙酸+ cnho kxrc 藍色物質(zhì)注意：dna、蛋白質(zhì)和黏多糖等物質(zhì)對測定有干擾作用。此法易受多種糖類及其衍生物和蛋片質(zhì)的干擾。上述兩種定糖的方法準確性較差，但快速簡便，能鑒別dna和rna,是鑒定核酸、核 苴酸的常用方法。三、實驗器材 恒溫水浴 電爐 布氏漏斗裝置 移液管 燒杯 量筒 剪刀 研體四、材料和試劑 新鮮菜花 95%乙醇 丙酮 5%高氯酸溶液 0.5mol/l三氯酸溶液 10%氯化鈉溶液 標準rna溶液(5mg/100ml) 標準 dna (15mg/100m

49、l) 粗氯化鈉 海沙 二苯胺試劑：將陀二苯胺溶于100ml冰醋酸小，再加入2.75ml濃硫酸(置冰箱小可 保存6個月。使用后，在室溫下?lián)u勻)。 三氯化鐵濃鹽酸溶液：將2mll0%三氯化鐵溶液(用fecl3 - 6h20配制加入到)400ml 濃鹽酸中。五、操作方法1. 核酸的分離 取菜花的花冠20g,剪碎后置于研缽中。加入20ml95%乙醇和少量誨砂，研磨 成勻漿。然后用布氏漏斗抽濾，棄去濾液。 向濾渣中加入20ml丙酮，攪拌均勻,抽濾，棄去濾液。 再向濾渣中加人20ml丙酗，攪拌5min后抽濾(川力壓濾渣，盡量除去丙酗)。 在冰鹽浴屮，將濾渣懸浮在預冷的20ml5%高氯酸溶液屮攪拌抽濾棄去濾

50、液。 特濾渣懸浮于20ml 95%乙醇中，抽濾，棄去濾液。濾渣中加入2()ml內(nèi)酮，攪拌5mino抽濾至干.用力壓濾渣盡量除去丙酮。 將干燥的濾渣重新懸浮在40ml 10%氯化鈉溶液中，在沸水浴中加熱15mln,放置、 冷卻，抽濾至干，留濾液，并將此操作重復進行一次。將兩次濾液合并，為捉取物一。 將濾渣重新懸浮在20ml ().5mol兒高氯酸溶液中。加熱到70°c。保溫20 min (恒溫水浴)后抽濾。留濾液為提取物二。2. dna和rna的定性鑒定二苯胺反應：按表1加入各種試劑，反應后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)呆。表1二苯胺反應加入試劑管號12345蒸係水/ml1-dna溶液/ml-1-r

51、na溶液/ml-1-提取物一/ml-1-提取物二/ml-1二苯胺試劑/ml22222放沸水浴中l(wèi)omin后的現(xiàn)象苔黑酚反應：按表2加入各種試劑，反應后觀察現(xiàn)象井記錄結(jié)果。表2苔黑酚反應加入試劑管號12345蒸錨水/ml1-dna溶液/ml-1-rna溶液/ml-1-提取物一/ml-1-提取物二/ml-1三氯化鐵濃鹽酸溶液/ml22222苔黑酚乙醇溶液/ml0.20.20.20.20.2放沸水浴中1020min后的現(xiàn)象根據(jù)現(xiàn)象分析提取物一和提取物二中主要含有什么物質(zhì)?六、思考題1. 核酸分離時為什么要除去小分子物質(zhì)和脂類物質(zhì)？本實驗是怎樣除掉的?2. 運用本實驗方法是否可以提取到能夠進行其他生物

52、實驗用的核酸材料？3. 快速鑒別rna和dna的方法是什么？實驗六：糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定一、實驗目的了解糖酵解過程的某一屮間步驟及利用抑制劑來研究屮間代謝的方法。二、實驗原理利用碘乙酸對糖酵解過程中3磷酸昔油醛脫氫酣的抑制作用，使3磷酸營油醛不再向 前變化而積累。硫酸臍作為穩(wěn)定劑，用來保護3磷酸廿汕醛是不自發(fā)分解。然示用2, 4二 硝基苯臍與3-磷酸昔油醛在堿性條件下形成2, 4-二硝基苯臍-丙糖的棕色復合物，其棕色程 度與2-磷酸苜油醛含量成正比。三、儀器原料和試劑(1) 儀器:試管(1.5x 1.5cm)、吸量管(lml、2ml3ml)恒溫水浴、燒杯(50ml)。(2) 原料：新鮮酵母。(

53、3) 試劑： 2, 4二硝基苯臟：0.1g2, 4二俏基苯耕溶于水100ml 2mol/l鹽酸溶液中，貯于棕色瓶 中備用。 0.56mol/l硫酸腓溶液：稱取7.28g硫酸月井溶t 50ml水屮，這時不會全部溶解，當加入 naoh使ph達7.4時則完全溶解。此液也可川于水合腓溶液配制，可按其分子濃度稀釋至 0.56mol/l,此時溶液呈堿性，可用濃硫酸調(diào)ph至7.4即口j。 5%葡萄糖溶液。 10%三氯乙酸溶液。 ().75mol/lnaoh 溶液。 o.()()2mol/l碘乙酸溶液。四、操作步驟(1)収小燒杯3只，分別加入新鮮酵母0.3g,并按下表分別加入各試劑，混勻。杯5%葡萄糖加入10%二氯醋酸碘乙酸加入量硫酸腓加入量發(fā)酵時起泡多號量/ml加入量/ml/ml/ml少11()21121()1131()（2）將各杯混合物分別倒入編號相同的發(fā)酵罐內(nèi)，放入37°c保溫1.5h,觀察發(fā)酵管產(chǎn)生氣 泡的量有何不同。（3）把發(fā)酵管中發(fā)酵液傾倒入同號小燒杯屮并在2號和3號杯中按下表補加各試劑，搖勻 放lomin后和第一只燒杯中內(nèi)容物一起分別過濾，取濾液進行測定。杯號10%三氯乙酸/ml碘乙酸/ml硫酸月井/ml223211（4）収3個試管，分別加入上述濾液o.5m