圓二色光譜_CD_

1、主要內容預備知識預備知識1圓二色光譜圓二色光譜2圓二色光譜儀的基本構造圓二色光譜儀的基本構造3CD光譜在蛋白質結構研究中的應用光譜在蛋白質結構研究中的應用4蛋白質蛋白質CD光譜圖的分析光譜圖的分析5CD樣品制備及條件選擇樣品制備及條件選擇6預備知識預備知識平面偏振光平面偏振光:振動方向保持不變（只振動方向保持不變（只在一個平面上振動）在一個平面上振動）振幅發(fā)生周期性變化振幅發(fā)生周期性變化起偏器起偏器電場矢量電場矢量傳播方向傳播方向平面偏振光的產生平面偏振光的產生:自然光通過起偏器（偏振自然光通過起偏器（偏振片或片或Nicol棱鏡）。棱鏡）。預備知識預備知識圓偏振光圓偏振光: 振幅保持不變，而方

2、向周期性變化，電場矢量繞傳播方向振幅保持不變，而方向周期性變化，電場矢量繞傳播方向螺旋前進。螺旋前進。左右旋圓偏振光：圓二色性圓二色性 當光通過光學活性物質時，介質對左右旋圓當光通過光學活性物質時，介質對左右旋圓偏振光的吸收率不同，二者的差稱為該物質偏振光的吸收率不同，二者的差稱為該物質的的圓二色性（圓二色性（circular dichroism，簡寫為，簡寫為CD）。預備知識預備知識光學活性物質光學活性物質 能使射入物質的平能使射入物質的平面偏振光的偏振面旋面偏振光的偏振面旋轉的物質稱為旋光性轉的物質稱為旋光性物質或光學活性物質。物質或光學活性物質。具有手性結構的分子具有手性結構的分子才有光

3、學活性。才有光學活性。圓二色光譜圓二色光譜v光學活性物質對左右旋圓偏振光的吸收率之差 是隨入射偏振光的波長變化而變化的。以 或有關量為縱坐標，波長為橫坐標，得到的圖譜。v由于 絕對值很小，常用摩爾橢圓度 來代替，二者的關系是：圓二色光譜圓二色光譜v當光學活性化合物對光沒有特征吸收時，在譜圖中僅為一條近似水平的直線。v當光學活性化合物對光存在特征吸收時，通常有兩種情況：當 時，得到一個正性的圓二色光譜曲線；當 時，得到一個負性的圓二色光譜曲線。圓二色光譜儀的基本構造圓二色光譜儀的基本構造美國美國Aviv公司公司Model400型圓二色光譜儀型圓二色光譜儀圓二色光譜在蛋白質結構研究中的應用圓二色光

4、譜在蛋白質結構研究中的應用v蛋白質的圓二色性 (1)由氨基酸通過肽鍵連接而成； (2)光學活性基團：肽鍵、芳香氨基酸殘基、二硫橋鍵； (3)蛋白質有多個結構層次，相同的氨基酸序列，因蛋白質的折疊結構不同，基團的光學活性受到影響。v蛋白質的圓二色特征 (1)光學活性基團及折疊結構； (2)250nm以下的光譜區(qū)，肽鍵的電子躍遷引起； (3)250300nm光譜區(qū)，側鏈芳香基團的電子躍遷引起； (4)300700nm光譜區(qū)，蛋白質輔基等外在生色基團引起。蛋白質蛋白質CDCD光譜分析光譜分析定性分析定性分析分子構象分子構象電子躍遷電子躍遷形式形式極值的波長極值的波長*103Deg.cm2/dmol-

5、螺旋螺旋（-helix）n221222nm(-)207210nm(-)191nm(+)-38-40-36-407286-折疊折疊（-sheet）n217218nm(-)195197nm(+)-19-212842-轉角轉角（-turn）n227nm(-) 弱弱200205nm(+)192.5(-)強強 無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲(random coil)230nm(-)215218nm（+）195202nm(-)強強-1.612-25-50螺旋螺旋折疊折疊轉角轉角P2結構結構蛋白質蛋白質CD光譜的波長范圍：遠紫外區(qū)（光譜的波長范圍：遠紫外區(qū)（185-245nm)、近紫外區(qū)（、近紫外區(qū)（245-320nm)

6、蛋白質蛋白質CD光譜分析光譜分析定性分析定性分析蛋白質蛋白質CDCD光譜分析光譜分析定性分析定性分析無無規(guī)規(guī)卷卷曲曲向向折折疊疊轉轉化化蛋白質蛋白質CDCD光譜分析光譜分析定量分析定量分析v 基本原理：基本原理： 假設蛋白質在波長在波長處的處的CD信號是蛋白質中各種二信號是蛋白質中各種二級結構組分的線性加和，級結構組分的線性加和，則有等式：iiCfC 假設溶液態(tài)蛋白質與晶體中的二級結構相同，則可假設溶液態(tài)蛋白質與晶體中的二級結構相同，則可利用已知二級結構利用已知二級結構的蛋白質或多肽的的蛋白質或多肽的CD光譜作為參考數(shù)據(jù)光譜作為參考數(shù)據(jù)，對，對未知蛋白質的未知蛋白質的二級結構進二級結構進行行擬

7、合計算擬合計算，能得出，能得出-螺旋、螺旋、-折疊、折疊、-轉角、無規(guī)線團等結構所占的轉角、無規(guī)線團等結構所占的比例。比例。 用于擬合的參考蛋白質用于擬合的參考蛋白質共有共有48種種，包括有，包括有Johnson等報道的等報道的29種，種， Keiderling等報道的等報道的5種，種， Yang等報道的等報道的6種及種及Sreerama等最近報道的等最近報道的3種種球蛋白和球蛋白和5種失活蛋白質。種失活蛋白質。蛋白質蛋白質CDCD光譜分析光譜分析定量分析定量分析v計算方法和擬合程序：計算方法和擬合程序： 已報道的計算方法和擬合程序較多，按先后分別有：已報道的計算方法和擬合程序較多，按先后分別

8、有： 多級線性回歸：多級線性回歸：擬合程序為擬合程序為G&F，LINCOMB，MLR； 峰回歸：峰回歸：擬合程序為擬合程序為CONTIN； 單值分解：單值分解：擬合程序為擬合程序為SVD； 凸面限制：凸面限制：擬合程序為擬合程序為CCA； 神經(jīng)網(wǎng)絡：神經(jīng)網(wǎng)絡：擬合程序為擬合程序為K2D； 自洽方法：自洽方法：擬合程序為擬合程序為SELCON；以及最近發(fā)展的一種聯(lián)用方；以及最近發(fā)展的一種聯(lián)用方 法，擬合程序為法，擬合程序為CDSSR 。蛋白質蛋白質CDCD光譜分析光譜分析定量分析定量分析 SELCON：Sreermna和Woody在原有的一些算法上進行改進得到，其新的計算程序為SELCO

9、N3 程序采用自洽自洽算法算法，假設待測蛋白質的二級結構與某種已準確測定結構的參考蛋白質相同，用測量的CD譜取代參考蛋白質的CD譜，用單值分解算法(SVD)和多種局部線性化模型，反復計算取代后的收斂性。CONTIN：由Provencher和Glokner提出，最新的擬合程序是CONTINLL。該方法采用峰回歸算法峰回歸算法，假設待測蛋白質的CD光譜是N個已知構象的參考蛋白質CD光譜的線性組合，進行擬合計算，使下面函數(shù)的值最小。NjjnobscalcNCC121221)()(蛋白質蛋白質CDCD光譜分析光譜分析定量分析定量分析CDSSTR： Johnson綜合了幾種方法的特點，發(fā)展起來的綜合了幾

10、種方法的特點，發(fā)展起來的一種新的計算擬合方法。其特點是只需要最少量的參考蛋一種新的計算擬合方法。其特點是只需要最少量的參考蛋白質，就能得到較好的分析結果。擬合計算時，先從已知白質，就能得到較好的分析結果。擬合計算時，先從已知精確構象的蛋白質中任意挑選，組成參考蛋白質。每次組精確構象的蛋白質中任意挑選，組成參考蛋白質。每次組合結果應滿足合結果應滿足3個基本選擇條件：個基本選擇條件： (1)各二級結構分量之和應在各二級結構分量之和應在0.951.05之間；之間； (2)各二級結構的分量應大于各二級結構的分量應大于-0.03； (3)實驗光譜與計算光譜間的均方根應小于實驗光譜與計算光譜間的均方根應小

11、于0.25。 最后的擬合結果是能滿足以上最后的擬合結果是能滿足以上3個規(guī)則所有結果的平個規(guī)則所有結果的平均值。均值。CDCD測量的樣品準備及條件選擇測量的樣品準備及條件選擇v 測試用的蛋白質樣品中應測試用的蛋白質樣品中應避免含有光吸收的雜質避免含有光吸收的雜質，緩沖，緩沖劑和溶劑在配制溶液前最好做單獨的檢查，透明性極好劑和溶劑在配制溶液前最好做單獨的檢查，透明性極好的磷酸鹽可用作為緩沖體系。的磷酸鹽可用作為緩沖體系。v CD光譜的測量一般光譜的測量一般在蛋白質含量相對低在蛋白質含量相對低(0.010.2g/L)的的稀溶液中進行，稀溶液中進行，溶液最大的吸收不超過溶液最大的吸收不超過2。 v 溶液濃度的測定：溶液濃度的測定：紫外光譜法、定量氨基酸分析；縮二紫外光譜法、定量氨基酸分析；縮二脲方法、測氮元素的濃度、考馬斯亮藍染料結合比色法、脲方法、測氮元素的濃度、考馬斯亮藍染料結合比色法、在完全變性條件下測芳香氨基酸殘基的吸收。在完全變性條件下測芳香氨基酸殘基的吸收。（蛋白蛋白質分子基礎質分子基礎高等教育出版社）高等教育出版社）v 測試條件：測試條件：環(huán)境溫度環(huán)境溫度 25， 相對濕度相對濕度60%。 CDCD測量的樣品準備及條件選擇測量的樣品準備及條件選擇v例例: 掃描波長范圍