第八章-層析PPT

1、1第八章第八章層析層析8.1 8.1 概述概述8.2 8.2 層析的基本原理與基本概念層析的基本原理與基本概念8.3 8.3 層析分離方法介紹層析分離方法介紹 凝膠過濾，離子交換，疏水，羥基磷灰石，凝膠過濾，離子交換，疏水，羥基磷灰石，共價，反相及親和層析等。共價，反相及親和層析等。2l層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進(jìn)行分離的方法的不同而進(jìn)行分離的方法l又稱色譜法，層離法，層析法又稱色譜法，層離法，層析法; ; l可用于生產(chǎn)規(guī)模，也可作為分析檢測，控可用于生產(chǎn)規(guī)模，也可作為

2、分析檢測，控制產(chǎn)品的質(zhì)量。制產(chǎn)品的質(zhì)量。 層析的概念層析的概念8.1 8.1 概概 述述3l19031903年，俄國植物學(xué)家年，俄國植物學(xué)家TswettTswett提出色層分離提出色層分離法的概念法的概念l19311931年，年，KuhnKuhn和和LederrLederr在氧化鋁和碳酸鈣柱在氧化鋁和碳酸鈣柱體上，以制備規(guī)模分離胡羅卜素和葉黃素。體上，以制備規(guī)模分離胡羅卜素和葉黃素。l19381938年，適用范圍擴(kuò)展到無色物質(zhì)。年，適用范圍擴(kuò)展到無色物質(zhì)。l1940194019431943年間，年間，TswettTswett提出了前流分析和提出了前流分析和置換分析法。置換分析法。l5050年代

3、，氣相色譜年代，氣相色譜Martin和和Synge，6060年代年代，液相色譜，液相色譜lDNADNA重組技術(shù)的發(fā)展，制備色譜研究成為熱點重組技術(shù)的發(fā)展，制備色譜研究成為熱點層析的發(fā)展歷程層析的發(fā)展歷程8.1 概概 述述4l英國生物學(xué)家英國生物學(xué)家MartinMartin和和Synge(Synge(19521952諾貝爾化學(xué)獎諾貝爾化學(xué)獎 l他們首先提出了他們首先提出了色譜塔板理論色譜塔板理論。以理論塔板來表。以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據(jù)液液逆流萃取的原理，發(fā)明了其次，他們根據(jù)液液逆流萃取的原理，發(fā)明了液液分配

4、色譜液液分配色譜。l特別是他們提出了遠(yuǎn)見卓識的預(yù)言：一、流動相特別是他們提出了遠(yuǎn)見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細(xì)力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細(xì)的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高到最小的理論塔板高( (即增加了理論塔板數(shù)即增加了理論塔板數(shù)) )，這，這將會大大提高分離效率。將會大大提高分離效率。 層析的發(fā)展歷程層析的發(fā)展歷程8.1 概概 述述5l分離效率高：分離效率高：每米柱可達(dá)幾千至幾十萬的塔每米柱

5、可達(dá)幾千至幾十萬的塔板數(shù)，適于極復(fù)雜混合物的分離。板數(shù)，適于極復(fù)雜混合物的分離。l應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣l選擇性強(qiáng)：選擇性強(qiáng)：通過操作方法，洗脫方式和操作通過操作方法，洗脫方式和操作條件來實現(xiàn)。條件來實現(xiàn)。l高靈敏度的在線檢測：高靈敏度的在線檢測：紫外、熒光、折光等紫外、熒光、折光等l快速分離：快速分離：高效層析劑和高壓液相色譜高效層析劑和高壓液相色譜l過程的自動化操作過程的自動化操作 層析的特點層析的特點8.1 概概 述述6l色譜分離的規(guī)模：色譜分離的規(guī)模：色譜分析：色譜分析：10mg20g/d20g/d 生物工業(yè)中的色譜分離生物工業(yè)中的色譜分離8.1 概概 述述7l分析色譜與制備及工業(yè)色譜的

6、比較：分析色譜與制備及工業(yè)色譜的比較：n應(yīng)用色譜技術(shù)范圍不同：分析（柱，紙和應(yīng)用色譜技術(shù)范圍不同：分析（柱，紙和薄板）；制備（柱）薄板）；制備（柱）n操作上不同：分析（進(jìn)樣量越小越好，檢操作上不同：分析（進(jìn)樣量越小越好，檢測靈敏度越高越佳；制備（進(jìn)樣量越大越測靈敏度越高越佳；制備（進(jìn)樣量越大越好，色譜柱適當(dāng)大）好，色譜柱適當(dāng)大）n色譜分離理論不同：色譜分離理論不同： 理論塔板數(shù)的不同；分配系數(shù)不同；樣品理論塔板數(shù)的不同；分配系數(shù)不同；樣品保留值與峰高的不同保留值與峰高的不同 生物工業(yè)中的色譜分離生物工業(yè)中的色譜分離8原理：原理：l層析是根據(jù)混合物中，溶質(zhì)在互不相溶的兩相之層析是根據(jù)混合物中，溶

7、質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進(jìn)行間分配行為的差別，引起移動速度的不同而進(jìn)行分離的方法；分離的方法；l互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動相；互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動相；l料液中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間發(fā)生擴(kuò)散傳料液中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間發(fā)生擴(kuò)散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡，分配系數(shù)大的溶質(zhì)隨流動相質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡，分配系數(shù)大的溶質(zhì)隨流動相移動的速度小。移動的速度小。8.2 8.2 原理與基本概念原理與基本概念91011層層 析分析分 類類 l流動相與固定相流動相與固定相l(xiāng)固定相的形狀固定相的形狀 l壓力壓力 l流動相的流動方向流動相的流動方向l分離操作方式分

8、離操作方式 l分配機(jī)理分配機(jī)理 121. 1. 流動相與固定相流動相與固定相l(xiāng) 根據(jù)流動相的相狀態(tài)分氣相層析法、液相層根據(jù)流動相的相狀態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法析法和超臨界流體層析法 ；l 固定相為液體的分配層析法、固定相為固體固定相為液體的分配層析法、固定相為固體的吸附層析法以及固定相為固定于固體表面的吸附層析法以及固定相為固定于固體表面的液體薄層的液體薄層( (以固體為載體以固體為載體) )的分配層析法等的分配層析法等。 層層 析分析分 類類 132. 2. 固定相的形狀固定相的形狀l根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同，液相層根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同，液相層析法又分紙層

9、析法、薄層層析法和柱層析法析法又分紙層析法、薄層層析法和柱層析法l紙層析和薄層層析多用于分析目的，而柱層紙層析和薄層層析多用于分析目的，而柱層析易于放大，適用于大量制備分離，是主要析易于放大，適用于大量制備分離，是主要的層析分離手段。的層析分離手段。 層層 析分析分 類類 143.3. 壓力壓力l在以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操在以固體為固定相的液相柱層析中，根據(jù)操作壓力的不同，分為低壓作壓力的不同，分為低壓( (壓力一般小于壓力一般小于0.5MPa)0.5MPa)、中壓、中壓( (壓力為壓力為0.50.54.OMPa)4.OMPa)和高壓和高壓( (壓力為壓力為 4.04.040MPa

10、)40MPa)液相層析法；液相層析法； l高壓液相層析法中層析介質(zhì)高壓液相層析法中層析介質(zhì)( (固定相固定相) )微細(xì)，微細(xì)，分離精度高、速度快，主要用于成分分析。分離精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法。大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法。層層 析分析分 類類 154.4.流動相的流動方向流動相的流動方向l軸向流層析；軸向流層析；l徑向流層析：溶質(zhì)徑向流層析：溶質(zhì)在半徑方向上得到在半徑方向上得到分離，優(yōu)點是規(guī)模分離，優(yōu)點是規(guī)模放大時，半徑不變放大時，半徑不變，通過增加柱高提，通過增加柱高提高處理能力，且壓高處理能力，且壓降不會增加，適于降不會增加，適于大規(guī)

11、模；但造價高大規(guī)模；但造價高。層層 析分析分 類類 165.5.分離操作方式分離操作方式 l洗脫展開洗脫展開 (elution development) (elution development) l迎頭分析迎頭分析 (front analysis) (front analysis) l頂替展開頂替展開 (Elution chromatography)(Elution chromatography) 層層 析分析分 類類 17層層 析分析分 類類 5.5.分離操作方式分離操作方式 ：洗脫展開洗脫展開降樣品盡量濃縮，引入色譜柱上部，用溶劑洗降樣品盡量濃縮，引入色譜柱上部，用溶劑洗脫（溶劑與固定相

12、無親和力），依親和力的大脫（溶劑與固定相無親和力），依親和力的大小而速度不同，前進(jìn)靠溶劑的推動。小而速度不同，前進(jìn)靠溶劑的推動。18層層 析分析分 類類 5.5.分離操作方式分離操作方式 ：洗脫展開洗脫展開恒定洗脫法：不改變洗脫劑組成，優(yōu)點是操作簡單，恒定洗脫法：不改變洗脫劑組成，優(yōu)點是操作簡單，不需要較復(fù)雜的設(shè)備；但洗脫劑組成需實驗確定，不需要較復(fù)雜的設(shè)備；但洗脫劑組成需實驗確定，太弱的洗脫劑不能有效洗脫，太強(qiáng)的洗脫劑，分辨太弱的洗脫劑不能有效洗脫，太強(qiáng)的洗脫劑，分辨率較差。率較差。逐次洗脫法：洗脫劑組成至少改變一次，優(yōu)點是操作逐次洗脫法：洗脫劑組成至少改變一次，優(yōu)點是操作簡單，重現(xiàn)性好，但

13、洗脫條件一次改變后，有些組簡單，重現(xiàn)性好，但洗脫條件一次改變后，有些組分會共同洗下，影響分離效果。分會共同洗下，影響分離效果。梯度洗脫：逐次改變洗脫劑的組成，優(yōu)點是消除重疊梯度洗脫：逐次改變洗脫劑的組成，優(yōu)點是消除重疊峰現(xiàn)象，但洗脫體積過大，組分濃度變稀。峰現(xiàn)象，但洗脫體積過大，組分濃度變稀。195.5.分離操作方式：迎頭分析分離操作方式：迎頭分析又稱前流，前沿分析法，將待分離的混合物不又稱前流，前沿分析法，將待分離的混合物不斷輸入柱中，讓它一直流下去，直到過程結(jié)斷輸入柱中，讓它一直流下去，直到過程結(jié)束。親和力小的先流出，一般不能達(dá)到組分束。親和力小的先流出，一般不能達(dá)到組分的分離，只有作用力

14、最弱的組分為純品。適的分離，只有作用力最弱的組分為純品。適于除痕量雜質(zhì)，組分濃度不會被稀釋。于除痕量雜質(zhì)，組分濃度不會被稀釋。層層 析分析分 類類 CABA+B205.5.分離操作方式分離操作方式 :頂替展開頂替展開又稱置換，排代展開，利用一種與固定相作用力又稱置換，排代展開，利用一種與固定相作用力極強(qiáng)的置換劑作流動相，去替代結(jié)合在固定相表極強(qiáng)的置換劑作流動相，去替代結(jié)合在固定相表面的溶質(zhì)分子。優(yōu)點是濃縮，單位柱長固定相的面的溶質(zhì)分子。優(yōu)點是濃縮，單位柱長固定相的利用率最高。但各組分一個連一個的流出，界線利用率最高。但各組分一個連一個的流出，界線不明，分離不理想；合適的置換劑不易找到。不明，分

15、離不理想；合適的置換劑不易找到。層層 析分析分 類類 DABD：置換劑：置換劑216.6.分配機(jī)理分配機(jī)理 凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析；凝膠過濾層析、離子交換層析、反相層析；疏水性相互作用層析和親和層析等。疏水性相互作用層析和親和層析等。層層 析分析分 類類 22基本概念基本概念 1.1.分配系數(shù)：分配系數(shù)：k kd dq/cq/c2.2.阻滯因數(shù)阻滯因數(shù)R Rf f ：溶質(zhì)的遷移速率與一理想標(biāo)準(zhǔn)物：溶質(zhì)的遷移速率與一理想標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（既不吸附也不溶解）的移動速率之比，移動質(zhì)（既不吸附也不溶解）的移動速率之比，移動長度一樣時：長度一樣時：smmRmftttttRtm， ts ：理想物質(zhì)和

16、溶質(zhì)的消耗時間：理想物質(zhì)和溶質(zhì)的消耗時間tR ：保留時間：保留時間23基本概念基本概念 2.2.阻滯因數(shù)阻滯因數(shù)R Rf f ：sdfsdfAkRAkR流動相的遷移距離積能進(jìn)行分配的有效截面溶質(zhì)的遷移距離距離同一時間流動相的遷移溶質(zhì)的遷移距離流動相的遷移速率溶質(zhì)的遷移速率mmmmAAAVAVV24基本概念基本概念 3.3.洗脫體積洗脫體積V VR R ：溶質(zhì)達(dá)最大濃度時，已流出的：溶質(zhì)達(dá)最大濃度時，已流出的流動相體積，流動相體積， V VR RV Vm mk kd dV Vs s 滯留時間：溶質(zhì)流出色譜柱所需的時間滯留時間：溶質(zhì)流出色譜柱所需的時間 t tR RV VR R/Q/Qe e t

17、t0 0V Vm m/Q/Qe e Q Qe e: :洗脫劑的流量洗脫劑的流量 t t0 0：死時間：死時間25基本概念基本概念 4.4.容量因子容量因子k k ：是固定相和流動相溶質(zhì)數(shù)量之比：是固定相和流動相溶質(zhì)數(shù)量之比0000)1 (1tkkttVVkQVtQVkVQVtkcVqVkmsdemesdmeRRdms容量因子是吸附劑對溶質(zhì)親和力的量度，容量因子是吸附劑對溶質(zhì)親和力的量度，k k越越低，從柱中流出的越早低，從柱中流出的越早26基本概念基本概念 5.5.選擇性選擇性： k kd1d1/k/kd2d26.6.分離度（分辨率）分離度（分辨率）R Rs s：表達(dá)兩種洗脫曲線相：表達(dá)兩種洗

18、脫曲線相鄰的溶質(zhì)相互分離的程度。鄰的溶質(zhì)相互分離的程度。為提高溶質(zhì)之間的為提高溶質(zhì)之間的分離度，可以采用增大峰間距離或降低峰寬的方法分離度，可以采用增大峰間距離或降低峰寬的方法。21122WWRRRs27分分 離離 度度 28層析過程理論基礎(chǔ)層析過程理論基礎(chǔ) l平衡模型平衡模型：假定不存在傳質(zhì)阻力，分配平衡瞬間完假定不存在傳質(zhì)阻力，分配平衡瞬間完成。成。l理論板模型：認(rèn)為分配平衡不能瞬間完成，需一定理論板模型：認(rèn)為分配平衡不能瞬間完成，需一定柱高，即一個理論板。適合低濃度料液，不能確定柱高，即一個理論板。適合低濃度料液，不能確定層析柱分離性能的影響因素。層析柱分離性能的影響因素。l軸向擴(kuò)散模型

19、：假定每一截面有均勻徑向濃度；每軸向擴(kuò)散模型：假定每一截面有均勻徑向濃度；每一截面及流動方向上，流體速率與軸向擴(kuò)散系數(shù)均一截面及流動方向上，流體速率與軸向擴(kuò)散系數(shù)均為定值；溶質(zhì)濃度為流動距離的連續(xù)函數(shù)。為定值；溶質(zhì)濃度為流動距離的連續(xù)函數(shù)。 29F原理與操作原理與操作 F凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì) F影響分離特性的因素影響分離特性的因素 F應(yīng)用應(yīng)用 F特點特點 8.3 8.3 層析方法介紹層析方法介紹 凝膠過濾凝膠過濾層析層析30l凝膠層析（凝膠層析（gel chromatographygel chromatography）又）又稱為凝膠排阻層析（稱為凝膠排阻層析（gel exclusion g

20、el exclusion chromatographychromatography）、分子篩層析（）、分子篩層析（molecular sieve chromatographymolecular sieve chromatography）、凝膠過濾（、凝膠過濾（gel filtrationgel filtration）、凝）、凝膠滲透層析（膠滲透層析（gel permeation gel permeation chromatographychromatography）等。）等。 8.3 8.3 層析方法介紹層析方法介紹 凝膠過濾凝膠過濾層析層析31原理與操作原理與操作l凝膠過濾層析凝膠過濾層析(

21、GFC)(GFC)利用凝膠粒子為固定相利用凝膠粒子為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進(jìn)行，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析法；分離的液相層析法；l GFCGFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)m m只是溶質(zhì)相對只是溶質(zhì)相對分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)( (孔徑分布孔徑分布) )的函數(shù)，與所用洗脫液的的函數(shù)，與所用洗脫液的pHpH值和離子強(qiáng)度等值和離子強(qiáng)度等物性無關(guān)。物性無關(guān)。3233原理與操作原理與操作l 限定條件下，限定條件下，V Vt t，V V0 0一定，一定，VeVe隨分離物質(zhì)分子隨分離物質(zhì)分子量變化而變化，分子量增加，分配

22、系數(shù)降低量變化而變化，分子量增加，分配系數(shù)降低。兩種溶質(zhì)，。兩種溶質(zhì)，k kavav差異大，分離效果好。差異大，分離效果好。洗脫，床，外水體積000,VVVVVVVkteteavgitVVVV034凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)l凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：凝膠過濾介質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：n親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不親水性高，表面惰性，即介質(zhì)與溶質(zhì)之間不發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；發(fā)生任何化學(xué)或物理相互作用；n穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的穩(wěn)定性強(qiáng)，在較寬的pHpH和離子強(qiáng)度范圍以及和離子強(qiáng)度范圍以及化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長；化學(xué)試劑中保持穩(wěn)定，使用壽命長； n具有一定的孔徑分布范圍；具有一定的孔

23、徑分布范圍； n機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力機(jī)械強(qiáng)度高，允許較高的操作壓力( (流速流速) ) 。35凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)l常用的凝膠過濾介質(zhì)常用的凝膠過濾介質(zhì) 36凝膠過濾介質(zhì)凝膠過濾介質(zhì)l凝膠特性參數(shù)凝膠特性參數(shù)n 排阻極限排阻極限(exclusion limit) (exclusion limit) n 分級范圍分級范圍(fractionation range) (fractionation range) n 溶脹率：每溶脹率：每g g干凝膠吸收水分的百分?jǐn)?shù)干凝膠吸收水分的百分?jǐn)?shù) n 凝膠粒徑凝膠粒徑 n 床體積：床體積：1g1g干凝膠溶脹后占的體積干凝膠溶脹后占的體積n 空隙體積

24、：凝膠之間空隙所占的體積，空隙體積：凝膠之間空隙所占的體積，用用2000kD2000kD的藍(lán)色葡聚糖測定。的藍(lán)色葡聚糖測定。3738凝膠過濾操作凝膠過濾操作l凝膠用量計算和處理：床體積凝膠用量計算和處理：床體積/ /膨脹度；膨脹度；5 51010倍蒸餾水浸泡倍蒸餾水浸泡 懸浮除小顆粒懸浮除小顆粒 0.5M NaOH 0.5M NaCl室溫浸泡室溫浸泡0.5h 0.5h 洗至中洗至中性性l層析柱選擇：層析柱選擇：1 1：25251 1：100100，夾套控溫，夾套控溫l裝柱，凝膠柱鑒定（藍(lán)，紅葡聚糖）裝柱，凝膠柱鑒定（藍(lán)，紅葡聚糖）l上樣：（少，分辨率高），洗脫：（單一緩上樣：（少，分辨率高），

25、洗脫：（單一緩沖液），再生：沖液），再生：( (水反復(fù)逆相沖洗，緩沖液水反復(fù)逆相沖洗，緩沖液平衡）平衡）l保存：洗凈，適量防酶劑，酒精，冰箱。保存：洗凈，適量防酶劑，酒精，冰箱。 39影響分離特性的因素影響分離特性的因素l線速度線速度 l料液體積料液體積 l料液濃度料液濃度 ：過高，洗脫曲線不規(guī)則，粘度：過高，洗脫曲線不規(guī)則，粘度l分子量與分配系數(shù)的關(guān)系分子量與分配系數(shù)的關(guān)系l凝膠粒徑凝膠粒徑 40l線速度線速度影響分離特性的因素影響分離特性的因素41影響分離特性的因素影響分離特性的因素l料液體積料液體積42影響分離特性的因素影響分離特性的因素l分子量與分配系分子量與分配系數(shù)的關(guān)系：數(shù)的關(guān)系：

26、wMbamlgl選擇分級范圍選擇分級范圍小的介質(zhì)，利小的介質(zhì)，利于提高分離度于提高分離度43應(yīng)應(yīng) 用用l分離純化分離純化 l脫鹽脫鹽 l相對分子質(zhì)量的測定相對分子質(zhì)量的測定 44凝膠過濾特點凝膠過濾特點lGFCGFC的優(yōu)點如下：的優(yōu)點如下：n溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近件溫和，產(chǎn)品收率可接近100100； n每批分離操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清每批分離操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)洗或再生，故容易實施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；

27、品純度； n作為脫鹽手段，作為脫鹽手段，GFCGFC比透析法速度快，精度比透析法速度快，精度高；質(zhì)活性收率高；高；質(zhì)活性收率高； n分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放分離機(jī)理簡單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。大。 45l GFCGFC的不足之處在于的不足之處在于 ：n僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進(jìn)行分離，僅根據(jù)溶質(zhì)之間分子量的差別進(jìn)行分離，選擇性低，料液處理量小；選擇性低，料液處理量小； n經(jīng)經(jīng)GFCGFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋，因此需要洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋，因此需要在具有濃縮作用的單元操作在具有濃縮作用的單元操作( (如超濾、離如超濾、離子交換和親和層析等子交換和親和層析等) )后使用。后使用。

28、 凝膠過濾特點凝膠過濾特點46l原理與操作原理與操作 lIECIEC的應(yīng)用的應(yīng)用 l特點特點 離子交換層析離子交換層析 8.3 8.3 層析方法介紹層析方法介紹47原理與操作原理與操作l離子交換層析離子交換層析(Ion exchange (Ion exchange chromatographychromatography，IEC)IEC)利用離子交換劑利用離子交換劑為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換為固定相，是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析法；分離的洗脫層析法；l陰離子交換基有陰離子交換基有DEAEDEAE，QAEQAE

29、；陽離子交換；陽離子交換基為基為CMCM，P P和和SPSP。常用于制備離子交換劑。常用于制備離子交換劑的介質(zhì)有的介質(zhì)有SephadexSephadex、SepharoseSepharose、TSKgel TSKgel PWPW、BioGelBioGel和纖維素等和纖維素等。 離子交換層析離子交換層析 48l洗脫時采用流動相離子強(qiáng)度線性增大的洗脫時采用流動相離子強(qiáng)度線性增大的線性梯度洗脫法線性梯度洗脫法(linear gradient (linear gradient e1ution)e1ution)或離子強(qiáng)度階躍增大的逐次洗或離子強(qiáng)度階躍增大的逐次洗脫法脫法(stepwise elution

30、)(stepwise elution)。l小型層析柱的實驗數(shù)據(jù)一般不能直接用小型層析柱的實驗數(shù)據(jù)一般不能直接用于規(guī)模放大，而必須實施必要的探索性于規(guī)模放大，而必須實施必要的探索性實驗。實驗。 離子交換層析離子交換層析 49 荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的荷電溶質(zhì)在離子交換劑上的分配系數(shù)分配系數(shù)可用可用下式表示：下式表示：其中其中I I為流動相的離子強(qiáng)度，為流動相的離子強(qiáng)度，A A和和B B為常數(shù)，為常數(shù)，m m為離子強(qiáng)度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是為離子強(qiáng)度無限大時溶質(zhì)的分配系數(shù)，是靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶靜電相互作用以外的非特異性吸附引起的溶質(zhì)在離子交換劑上的分配。對于不同的溶質(zhì)，質(zhì)在

31、離子交換劑上的分配。對于不同的溶質(zhì)，式中的常數(shù)式中的常數(shù)A A和和B B不同，即在離子交換劑上的不同，即在離子交換劑上的分配行為不同，因此在洗脫過程中彼此之間分配行為不同，因此在洗脫過程中彼此之間得到分離。得到分離。mIAImB)( 離子交換層析離子交換層析 50 線性梯度洗脫過程中，流動相的離子線性梯度洗脫過程中，流動相的離子強(qiáng)度線性增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)強(qiáng)度線性增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)連續(xù)降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條降低，移動速度逐漸增大，使恒定洗脫條件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流動相體積件下難于洗脫的溶質(zhì)在較小的流動相體積下洗脫。顯然，通過改變流動相離子強(qiáng)度下洗脫。顯然，通過

32、改變流動相離子強(qiáng)度的增大速度的增大速度( (即濃度梯度即濃度梯度) )，可調(diào)整溶質(zhì)的，可調(diào)整溶質(zhì)的洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰之間的距離，在洗脫體積，即溶質(zhì)洗脫峰之間的距離，在改善分離度的同時縮短洗脫時間改善分離度的同時縮短洗脫時間。 離子交換層析離子交換層析 5152 逐次洗脫過程中，流動相的離子強(qiáng)度逐次洗脫過程中，流動相的離子強(qiáng)度階躍增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低階躍增大，因此溶質(zhì)的分配系數(shù)的降低和移動速度的增大也是階段式的。如果和移動速度的增大也是階段式的。如果流動相離子強(qiáng)度的階躍速度很快，逐次流動相離子強(qiáng)度的階躍速度很快，逐次洗脫就接近了線性梯度洗脫；反之則接洗脫就接近了線性梯度洗脫；反之則

33、接近恒定洗脫。因此逐次洗脫是介于恒定近恒定洗脫。因此逐次洗脫是介于恒定洗脫與線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。洗脫與線性梯度洗脫之間的一種洗脫法。 離子交換層析離子交換層析 53 在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程，在線性梯度洗脫和逐次洗脫過程，IECIEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)因此區(qū)帶后部的移動速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過程中得到濃縮。層析操作多采用在洗脫過程中得到濃縮。層析操作多采用線性梯度洗脫法或逐次沉脫法，只是流動線性梯度洗脫法或逐次沉脫法，只是流動相組成的變化情況各不相同。相組成的變化情況各不相同。 離子交換層

34、析離子交換層析 54IECIEC的應(yīng)用的應(yīng)用 IECIEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。這主要是由于要純化手段。這主要是由于IECIEC基于離子基于離子交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具有通用性，而且選擇性遠(yuǎn)高于有通用性，而且選擇性遠(yuǎn)高于GFCGFC。 離子交換層析離子交換層析 55特特 點點l料液處理量大，具有濃縮作用，可在較料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；高流速下操作；l應(yīng)用范圍廣泛，通過優(yōu)化操作條件可大應(yīng)用范圍廣泛，通過優(yōu)化操作條件可大幅提高分離的選擇性，所需柱長較短；幅提高分離的選擇性，所需

35、柱長較短；l產(chǎn)品回收率高產(chǎn)品回收率高 ；l商品化的離子交換劑種類多，選擇余地商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑大，價格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑 。 離子交換層析離子交換層析 56l原理原理 l疏水性吸附劑疏水性吸附劑 l操作操作 l特點特點 疏水層析疏水層析 8.3 8.3 層析方法介紹層析方法介紹57原原 理理l硫水性相互作用層析硫水性相互作用層析(HIC)(HIC)利用表面偶聯(lián)利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)弱疏水性基團(tuán)( (疏水性配基疏水性配基) )的疏水性吸附的疏水性吸附劑為固定相，是根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑為固定相，是根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)

36、行蛋劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法l蛋白質(zhì)的吸附蛋白質(zhì)的吸附( (進(jìn)料進(jìn)料) )需在高濃度鹽溶液中需在高濃度鹽溶液中進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動相離子強(qiáng)進(jìn)行，洗脫則主要采用降低流動相離子強(qiáng)度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。度的線性梯度洗脫法或逐次洗脫法。 疏水層析疏水層析 58疏水性吸附劑疏水性吸附劑l疏水性吸附作用與配基的硫水性疏水性吸附作用與配基的硫水性( (疏水鏈長疏水鏈長度度) )和配基密度成正比；和配基密度成正比；l配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異；配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異；l疏水性配基與親水性固

37、定相粒子之間的偶疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用介于氨苯的結(jié)合或醚鍵結(jié)合，聯(lián)主要利用介于氨苯的結(jié)合或醚鍵結(jié)合，形成各種疏水性吸附劑。形成各種疏水性吸附劑。 疏水層析疏水層析 59常用商品化疏水吸附劑常用商品化疏水吸附劑60常用疏水吸附劑結(jié)構(gòu)常用疏水吸附劑結(jié)構(gòu)61 HIC HIC操作操作 l影響疏水性吸附的因素影響疏水性吸附的因素 n離子強(qiáng)度及種類離子強(qiáng)度及種類 n破壞水化作用的物質(zhì)破壞水化作用的物質(zhì) n表面活性劑表面活性劑n溫度溫度 疏水層析疏水層析 62l蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)的分離 HICHIC不僅是一種有效的分離純化手不僅是一種有效的分離純化手段，而且還可與段，而且還可與IEC

38、IEC互補(bǔ)短長，分互補(bǔ)短長，分離純化利用離純化利用IECIEC難于分離的蛋白質(zhì)難于分離的蛋白質(zhì)。在利用。在利用HICHIC分離蛋白質(zhì)的混合物分離蛋白質(zhì)的混合物時，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進(jìn)時，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進(jìn)行吸附與洗脫實驗，確定最佳吸附行吸附與洗脫實驗，確定最佳吸附劑和洗脫分離溶劑。劑和洗脫分離溶劑。 疏水層析疏水層析 63HICHIC的特點的特點l由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此用較大，因此HICHIC可直接分離鹽析后可直接分離鹽析后的蛋白質(zhì)溶液；的蛋白質(zhì)溶液； l可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)可通過調(diào)節(jié)疏水配基鏈長和密度調(diào)節(jié)吸附力，

39、并根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇吸附力，并根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑；適宜的吸附劑； l疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價格與離子交換劑相當(dāng)價格與離子交換劑相當(dāng) 。 疏水層析疏水層析 64l反相層析反相層析(Reversed-phase (Reversed-phase chromatographychromatography，RPC)RPC)利用非極性的反利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動相，是根據(jù)溶質(zhì)極性為流動相，是根據(jù)溶質(zhì)極性( (疏水性疏水性) )的差的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離純化的洗脫層析法；別進(jìn)行溶質(zhì)分

40、離純化的洗脫層析法；l用于相對分子質(zhì)量低于用于相對分子質(zhì)量低于50005000，特別是，特別是l000l000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化?；?反相層析反相層析 8.3 8.3 層析方法介紹層析方法介紹65l溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系質(zhì)的疏水性，一般疏水性越大，分配系數(shù)越大；數(shù)越大；l當(dāng)固定相一定時，可通過調(diào)節(jié)流動相的當(dāng)固定相一定時，可通過調(diào)節(jié)流動相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)、流動相的極組成調(diào)整溶質(zhì)的分

41、配系數(shù)、流動相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大；性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大； l可采用降低流動相極性可采用降低流動相極性( (水含量水含量) )的線性的線性梯度洗脫法。梯度洗脫法。 反相層析反相層析 66l反相介質(zhì)中最具代表性的是以硅膠為載反相介質(zhì)中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵合非體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵合非極性分子層制備。極性分子層制備。 反相層析反相層析 67l超臨界流體層析超臨界流體層析(Supercritical fluid (Supercritical fluid chromatographychromatography，SFC)SFC)是利用超臨界流是

42、利用超臨界流體為流動相的洗脫層析法；體為流動相的洗脫層析法；l利用超臨界流體作為流動相參與溶質(zhì)在利用超臨界流體作為流動相參與溶質(zhì)在固定相上的分配，可提高溶質(zhì)在固定相固定相上的分配，可提高溶質(zhì)在固定相中的擴(kuò)散速率，提高分離速度和柱效；中的擴(kuò)散速率，提高分離速度和柱效；lSFCSFC常采用增大壓力的壓力梯度洗脫法常采用增大壓力的壓力梯度洗脫法，也可采用改變?nèi)軇舛龋O性）的濃，也可采用改變?nèi)軇舛龋O性）的濃度梯度洗脫法。度梯度洗脫法。 超臨界流體層析超臨界流體層析 686970l 羥基磷灰石羥基磷灰石(hydroxyapatite(hydroxyapatite，HAP)HAP)是是一種磷酸鈣晶體

43、，吸附主要基于鈣離子一種磷酸鈣晶體，吸附主要基于鈣離子和磷酸根離子的靜電引力；和磷酸根離子的靜電引力；l HAPHAP層析通常以磷酸鹽緩沖液為流動相層析通常以磷酸鹽緩沖液為流動相，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法；，采用提高鹽濃度的線性梯度脫法；l用于識別用于識別DNADNA及及RNARNA的單鏈和雙鏈，分離的單鏈和雙鏈，分離IECIEC和和HICHIC難于分離的蛋白質(zhì)等物系難于分離的蛋白質(zhì)等物系 ；l HAPHAP吸附劑價格便宜，遠(yuǎn)低于離子交換吸附劑價格便宜，遠(yuǎn)低于離子交換劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成劑，適用于大規(guī)模分離純化過程，已成為單克隆抗體的主要純化手段為單克隆抗體的主要純化手段 。

44、羥基磷灰石層析羥基磷灰石層析 71F 原理與操作原理與操作 F 親和吸附介質(zhì)親和吸附介質(zhì)F 親和層析過程親和層析過程F 應(yīng)用應(yīng)用 親和層析親和層析 72親和作用體系親和作用體系 特異性特異性親和體系親和體系高特異性高特異性 群特異性群特異性抗原抗原- -單克隆抗體單克隆抗體荷爾蒙荷爾蒙- -受體蛋白受體蛋白核酸核酸- -互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白酶酶底物、產(chǎn)物、抑制劑底物、產(chǎn)物、抑制劑免疫球蛋白免疫球蛋白AA蛋白、蛋白、G G蛋白蛋白酶酶輔酶輔酶凝集素凝集素糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)肝素肝素酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)活性

45、色素活性色素( (染料染料) )酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)過渡金屬離子過渡金屬離子(Cu(Cu2+2+，ZnZn2+2+等等) )酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)氨基酸氨基酸( (組氨酸等組氨酸等) ) 73親和作用體系親和作用體系l將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與固體將具有親和作用的兩種分子中的一種分子與固體粒子或可溶性物質(zhì)共價偶聯(lián)，可特異性吸附或結(jié)粒子或可溶性物質(zhì)共價偶聯(lián)，可特異性吸附或結(jié)合另一種分子，使另一種分子（通稱為目標(biāo)產(chǎn)物合另一種分子，使另一種分子（通稱為目標(biāo)產(chǎn)物）容易從混合物中得到選擇性分離純化）容易從混合物中得到選擇性分離純化; ;l在親和純化中，一般將親和作用分子對中被固定在親和純化中，

46、一般將親和作用分子對中被固定的分子稱為其親和結(jié)合對象的分子稱為其親和結(jié)合對象( (一般為蛋白質(zhì)一般為蛋白質(zhì)) )的配的配基基(ligand)(ligand)。 74用用 L L表示配基，表示配基，E E表示蛋白質(zhì)，可逆性親和結(jié)合作用可表表示蛋白質(zhì)，可逆性親和結(jié)合作用可表示為示為 ：其中，其中，ELEL為蛋白質(zhì)與配基形成的復(fù)合體。上述結(jié)合反應(yīng)為蛋白質(zhì)與配基形成的復(fù)合體。上述結(jié)合反應(yīng)的解離常數(shù)為：的解離常數(shù)為：結(jié)合常數(shù)為：結(jié)合常數(shù)為： LELE LELEKd LELEKeq75原理與操作原理與操作l親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸親和層析是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，

47、使附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法；目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法； l由于目標(biāo)產(chǎn)物基于生物親和作用吸附在由于目標(biāo)產(chǎn)物基于生物親和作用吸附在固定相上，具有高度的選擇性，因此，固定相上，具有高度的選擇性，因此，親和層析操作與一般的固定床吸附操作親和層析操作與一般的固定床吸附操作方式相同，多采用斷通式前端分析法。方式相同，多采用斷通式前端分析法。 7677親和吸附介質(zhì)親和吸附介質(zhì)l親和配基親和配基l親和吸附介質(zhì)親和吸附介質(zhì) l間隔臂間隔臂 78親和配基親和配基l 酶的抑制劑酶的抑制劑 l 抗體抗體 ：免疫親和層析：免疫親和層析lA A蛋白蛋白 （protein

48、Aprotein A） l 凝集素（凝集素（lectinlectin）79親和配基親和配基l輔酶和磷酸腺苷輔酶和磷酸腺苷l三嗪類色素（三嗪類色素（triazine dyestriazine dyes）: :色素親和層析色素親和層析l （ DyeDyeligand affinity ligand affinity chromatographychromatography） l過渡金屬離子過渡金屬離子 ：金屬螯合層析：金屬螯合層析l (Metal chelate (Metal chelate chromatography) chromatography) l組氨酸組氨酸 l肝素肝素 (hepari

49、n) (heparin) 80親和吸附介質(zhì)親和吸附介質(zhì) 親和吸附介質(zhì)又稱親和載體。作為載體的親和吸附介質(zhì)又稱親和載體。作為載體的固體粒子應(yīng)該滿足以下要求：固體粒子應(yīng)該滿足以下要求：l具有親水性多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附，比表具有親水性多孔結(jié)構(gòu)，無非特異性吸附，比表面積大；面積大；l物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長；用壽命長； l含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，用于親和配基的固定含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，用于親和配基的固定化；化； l粒徑均一的球形粒子。粒徑均一的球形粒子。 81親和吸附介質(zhì)親和吸附介質(zhì) 利用凝膠過濾介質(zhì)合成所需的親和吸附介質(zhì)的利用凝膠過濾介質(zhì)合成所需的親和吸附介質(zhì)的合成方法：合成方法：l 溴化腈活化法：用于多糖凝膠的活