




版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、1北京全式金生物技術(shù)有限公司2背景資料 基因克隆是分子生物學(xué)必不可少的工具,傳統(tǒng)的T4 DNA Ligase方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。 TOPO克隆5分鐘快速克隆,是克隆技術(shù)的革命。這個(gè)技術(shù)上的飛躍為實(shí)現(xiàn)“加速科研”的理念提供了先決條件。 基因定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因的便利方法?;蚬δ苎芯恳呀?jīng)成為生命科學(xué)研究的新熱點(diǎn),因此需要強(qiáng)有力的工具保證基因結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系研究的進(jìn)行。3TOPO克隆技術(shù) TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的關(guān)鍵 TOPO克隆常見問題及解決方法4TOPO克隆原理 TOPO即Topoisomerase 拓?fù)洚悩?gòu)酶 特點(diǎn):由316個(gè)氨基酸組成識(shí)別5-CCCTT-3同時(shí)具有限
2、制性內(nèi)切酶和連接酶的功能不需要能量5TOPO克隆原理6TOPO克隆過程7TOPO克隆過程TOPO克隆迅速、便捷載載 體體片片 段段產(chǎn)產(chǎn) 物物5 min8TOPO克隆克隆策略有無雜帶?有無引物二聚體?PCR產(chǎn)物無雜帶,有引物二聚體均有或有雜帶均無Gel Extraction KitPCR Purification Kit基因克隆、轉(zhuǎn)化9TOPO克隆和傳統(tǒng)T4克隆比較Topo克隆T4 DNA Ligase克隆PCR產(chǎn)物無需純化可直接用于克隆(若無雜帶和引物二聚體)需要純化,否則抑制連接反應(yīng)時(shí)間5分鐘過夜(12小時(shí))操作載體+片段(污染幾率?。┹d體+片段+T4 DNA Ligase Buffer+T
3、4 DNA Ligase(污染幾率大)克隆效率85%60%特點(diǎn)省時(shí)(至少節(jié)約1天)快速、高效費(fèi)時(shí)10TransGen TOPO Vector pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expression Vetor pEASY-E2 Expression Vetor11克隆載體圖譜TA Cloning12克隆載體圖譜Blunt Cloning13表達(dá)
4、載體TA Cloning 一步法載體構(gòu)建一步法載體構(gòu)建藉由藉由TOPO技術(shù)實(shí)現(xiàn)技術(shù)實(shí)現(xiàn)!14TOPO克隆成功的關(guān)鍵 引物設(shè)計(jì) PCR條件 克隆反應(yīng)設(shè)置(DNA加入量、反應(yīng)的溫度和時(shí)間) 克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇 選用質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒15 引物設(shè)計(jì): 引物不能磷酸化; 引物5端第一個(gè)堿基會(huì)影響下游的連接效率; PCR注意事項(xiàng): 后延伸設(shè)置為721020分鐘; 目的: 保證擴(kuò)增片段完整,可以有效降低擴(kuò)增背景; 使用Taq系列DNA聚合酶擴(kuò)增時(shí),該步驟相當(dāng)于加A反應(yīng)。 16目的片段加入量為保證良好的連接效率,推薦如下 700bp以及更小的片段:保證20ng 700bp以上的片段:保證30
5、100ng 2Kbp左右的片段:保證40ng 3Kbp左右的片段:保證60ng 片段加入量max:4l,濃度很低時(shí)也有一定的連接效率, 體積大于5 l會(huì)破壞反應(yīng)體系平衡; 片段加入量min:0.5l,濃度很高時(shí)需要稀釋, 可以補(bǔ)充無菌水方便操作。反應(yīng)溫度: TOPO酶的工作溫度為203717 反應(yīng)時(shí)間:PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物 / PCR/ PCR純化產(chǎn)物純化產(chǎn)物25 5min25 5min膠回收產(chǎn)物膠回收產(chǎn)物/ /加加A A產(chǎn)物產(chǎn)物25 10min251015min25 15min【大片段、特殊結(jié)構(gòu)】25 20min【大片段、特殊結(jié)構(gòu)】18 克隆感受態(tài)細(xì)胞的選擇:Top10適用于毒基因的克隆DH
6、5普遍使用JM109同源重組率低,提取質(zhì)粒質(zhì)量最好XL1-Blue適合非甲基化DNA的轉(zhuǎn)化(必要時(shí)可以代替DMT)Mach1-T1具有T1、T5噬菌體抗性,在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度快OmniMAX2-T1具有T1、T5噬菌體抗性,可用于文庫構(gòu)建TL-Blue適用于大質(zhì)粒DNA和重組產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化降低片段大小的偏愛性,可用于文庫構(gòu)建19 選擇質(zhì)量好的膠回收或PCR純化試劑盒: 試劑品質(zhì)很關(guān)鍵 質(zhì)量不好的試劑盒很可能會(huì)抑制下游連接20TOPO克隆常見問題及解決方法 克隆數(shù)少(確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞效率正常時(shí)) 克隆陽性率低 PCR鑒定重組子失敗 菌落多為淡藍(lán)色或FishEye(白邊藍(lán)芯)21反應(yīng)時(shí)間產(chǎn)物不新鮮克
7、隆數(shù)少或陽性率低:膠回收片段DNA濃度低毒基因基因特殊結(jié)構(gòu)22 上述五種情況,均需要適當(dāng)延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間!以保證連接效率和克隆數(shù)。(可參考上文的載體連接反應(yīng)時(shí)間) 另外每種情況也有一些特別的地方可以改進(jìn),進(jìn)一步提高克隆效果。23 PCR產(chǎn)物不新鮮:Why 3端熱力學(xué)不穩(wěn)定,3“A”容易脫落 直接導(dǎo)致TA克隆效率低How PCR產(chǎn)物置于4保存12天內(nèi)使用 不要冷凍PCR產(chǎn)物 PCR結(jié)束后立即使用效果最好24 克隆膠回收片段:Why 紫外照射和EB對(duì)dsDNA造成損傷; (受到損傷的DNA不是連接的最佳底物) 3-“A”容易在電泳過程中被核酸外切酶降解,導(dǎo)致TA連接效率低; 試劑殘留的抑制。How
8、 操作中通過細(xì)節(jié)注意避免25 目的片段濃度很低:Why 無法保證有效碰撞How 濃縮DNA26 毒基因:Why其本底表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主生長(zhǎng)有明顯抑制How 選用Top1027 基因特殊結(jié)構(gòu):Why 具有高AT、高GC、反向重復(fù)序列的基因,不容易連接How 調(diào)整、摸索連接體系和條件 嘗試不同的載體,不同的骨架對(duì)片段偏好性不同28PCR鑒定重組子失?。含F(xiàn)象:用通用引物鑒定時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物既無目的帶又無載體自連帶How 預(yù)變性95 10min (徹底裂解菌體、釋放DNA) 最好能用通用引物鑒定所謂連接失敗實(shí)為誤判!所謂連接失敗實(shí)為誤判!29菌落多為淡藍(lán)色或FishEye:Why 插入片段沒有影響LacZ基因
9、讀碼框 插入片段?。ㄐ∮?00bp)How 不要丟棄平板! 進(jìn)行進(jìn)一步鑒定所謂連接失敗實(shí)為誤判!所謂連接失敗實(shí)為誤判!30基因定點(diǎn)突變技術(shù) 利用PCR實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變的幾種傳統(tǒng)方法 GeneTailor,QuickChange, Easy /Fast Mutagenesis System 三種市售點(diǎn)突變?cè)噭┖械谋容^31傳統(tǒng)方法:僅利用PCR 反向PCR定點(diǎn)突變 重疊延伸PCR定點(diǎn)突變 大引物PCR定點(diǎn)突變32 反向PCR:特點(diǎn):必須以質(zhì)粒為模板;引物方向相反;引物需要磷酸化。33 重疊延伸PCR:特點(diǎn):兩輪PCR34 大引物PCR:特點(diǎn):兩輪PCR35 GeneTailor,QuickChange,
10、Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變,但它們與傳統(tǒng)方法的區(qū)別主要在于可以對(duì)突變克隆進(jìn)行初步的篩選 篩選原理:降解甲基化質(zhì)粒模板 篩選依據(jù): 來自大腸桿菌的質(zhì)粒99%發(fā)生甲基化; PCR是去甲基化過程,PCR產(chǎn)物(發(fā)生突變的產(chǎn)物)是去甲基化的產(chǎn)物。36 篩選方法: 體內(nèi)降解:原始質(zhì)粒模板可以被能降解甲基化質(zhì)粒的大腸桿菌(DMT)降解,而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物(發(fā)生突變的產(chǎn)物)不會(huì)被降解。 體外降解:DpnI識(shí)別序列5-GmATC-3(在DNA序列中,一般每256bp中出現(xiàn)一次)。甲基化模板可被DpnI識(shí)別、切割,而去甲基化的擴(kuò)增產(chǎn)物(發(fā)生突變的產(chǎn)物)不
11、會(huì)被降解。37Invitrogen:GeneTailor Mutagenesis System 優(yōu)點(diǎn) 引物部分重疊,指數(shù)擴(kuò)增 擴(kuò)增產(chǎn)物可見,易于操作 篩選方法:DMT體內(nèi)降解 缺點(diǎn): 突變點(diǎn)在一條引物上 無DpnI限制性內(nèi)切酶降解模板38Stratagene:QuickChange Mutagenesis System 優(yōu)點(diǎn): 篩選方法:DpnI限制性內(nèi)切酶 缺點(diǎn): 引物完全重疊,線性擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物不可見,可操作性差 擴(kuò)增產(chǎn)物為線狀 無DMT體內(nèi)消化降解模板39TransGen:Easy/Fast Mutagenesis System 共有部分:PCR組分、DpnI酶、DMT細(xì)胞 Easy
12、Mutagenesis System: 使用EasyPfu酶 Fast Mutagenesis System: 使用FastPfu酶 擴(kuò)增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高,擴(kuò)增10Kb左右的質(zhì)粒只需2個(gè)小時(shí)! (請(qǐng)參考金品是怎樣煉成的)40TransGen: 引物部分重疊,指數(shù)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物可見,易于操作;擴(kuò)增產(chǎn)物為環(huán)狀; 兩條引物上均有突變點(diǎn),突變效率高; DpnI體外降解篩選 + DMT體內(nèi)降解篩選=雙重篩選雙重篩選! 大大提高陽性率。41 TransGen:Easy/Fast Mutagenesis System 引物設(shè)計(jì)示意圖正向引物上的突變點(diǎn) 反向引物上的突變點(diǎn)FWD 55 REV33重疊區(qū)重疊區(qū)延伸區(qū)延伸區(qū)42引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)擴(kuò)增特點(diǎn)擴(kuò)增特點(diǎn)模板降解方法模板降解方法InvitrogenGeneTailer部分重疊部分重疊突變位點(diǎn)位于突變位點(diǎn)位于一條引物上一條引物上指數(shù)擴(kuò)增,產(chǎn)物可見指數(shù)擴(kuò)增,產(chǎn)物可見產(chǎn)物為環(huán)狀產(chǎn)物為環(huán)狀 DMTDMT細(xì)胞體內(nèi)降解細(xì)胞體內(nèi)降解StratageneQuickChange完全重疊完全重
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 泰州環(huán)保球場(chǎng)施工方案
- 繩索操作考試題及答案
- 陜師大歷史復(fù)試題及答案
- 2025年cdfi醫(yī)師上崗考試試題及答案
- 5年級(jí)上冊(cè)手抄報(bào)全部總結(jié)
- 登鸛雀樓吟誦符號(hào)
- arp報(bào)文發(fā)送的描述
- 【無印良品】大眾推廣策劃案 - 副本 - 副本
- 2025年臨汾職業(yè)技術(shù)學(xué)院?jiǎn)握新殬I(yè)適應(yīng)性測(cè)試題庫完美版
- 2025年關(guān)于黨史知識(shí)競(jìng)賽培訓(xùn)題庫及答案
- 高素質(zhì)農(nóng)民培訓(xùn)認(rèn)識(shí)
- 地域文化與城鄉(xiāng)景觀 全國(guó)優(yōu)質(zhì)課一等獎(jiǎng)
- 工業(yè)機(jī)器人及零部件結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
- OA辦公系統(tǒng)的詳細(xì)介紹
- 心理疏導(dǎo)之藝術(shù)療愈課程
- 多元化團(tuán)隊(duì)背景下領(lǐng)導(dǎo)力對(duì)團(tuán)隊(duì)績(jī)效作用研究
- SY-T 7693-2023 石油天然氣鉆采設(shè)備 防噴器膠芯
- 產(chǎn)科醫(yī)療質(zhì)量持續(xù)改進(jìn)QCC品管圈PDCA案例合集
- 培訓(xùn)機(jī)構(gòu)與家長(zhǎng)協(xié)議書協(xié)議書
- 口腔專項(xiàng)護(hù)士基礎(chǔ)知識(shí)考試試題及答案
- 個(gè)人所得稅贍養(yǎng)老人約定分?jǐn)倕f(xié)議書(范本)正規(guī)范本(通用版)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論