一顱鎖骨發(fā)育不全綜合征家族的RUNX2基因分析研究

1、e    一顱鎖骨發(fā)育不全綜合征家族的runx2基因分析研究    姜濤 蔣序 張運奎摘要 目的 檢測一個顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（ccd）家系runx2基因突變情況。方法 采用先證者查證法，對ccd家系各成員進行全身健康狀況及口腔?？茩z查，拍攝x線片；抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血，提取基因組dna，聚合酶鏈反應（pcr）擴增runx2基因并測序，將先證者及其父母、姐姐runx2基因測序結(jié)果進行blastn比較分析。結(jié)果 在先證者runx2基因的外顯子2上發(fā)現(xiàn)了一個ct突變，此突變來自母系染色體該基因568位點的基因突變；密碼子cggtgg引起runx

2、2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位保守的精氨酸變成色氨酸，突變型為c.568c>t。結(jié)論 c.568c>t突變是導致該家系發(fā)病的分子基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞 顱鎖骨發(fā)育不全綜合征； runx2； 基因突變 r 781.6 文獻標志碼 a doi 10.7518/hxkq.2013.05.019顱鎖骨發(fā)育不全綜合征（cleidocranial dyspla-sia，ccd）是一種累及骨骼和牙齒的常染色體顯性遺傳性疾病1，具有明顯的家族聚集性，男女發(fā)病率無明顯差別，臨床發(fā)病率約為1：1 000 000。ccd常見的臨床癥狀有囟門閉合延遲或不閉合，顱骨縫增寬，鎖骨鈣化不良、缺失或部分缺失，錐形胸，恥骨聯(lián)合增

3、寬而致骨盆發(fā)育不良，身材矮小等；口腔表現(xiàn)常見上頜骨發(fā)育不足，有多生牙，乳牙滯留，恒牙萌出延遲或埋伏牙等癥狀2-5。目前ccd的發(fā)病機制尚不清楚，本研究采用分子生物學的方法對1個顱鎖骨發(fā)育不全家系的患者進行runx2基因測序分析研究。1 材料和方法1.1 研究對象ccd家系1個，來自山東省濟南市，家系圖見圖1。先證者，女，29歲，2010年6月因“牙齒不齊，咀嚼困難”到濟南市口腔醫(yī)院修復科就診，要求修復上下牙列缺損。采用先證者查證法，對家系各成員進行全身健康狀況及口腔專科檢查。查體：先證者反，混合牙列，恒牙僅16、17、26、27、36、37、46萌出，全部乳牙均滯留，1115、2125、313

4、5、4145未萌，65、71、72、73、75、81、82、83、85松動度；顱骨和面部比例失調(diào)，頭大面小，前額及頂部突出呈方形，前囟門未閉合，從額部到枕部中線區(qū)有明顯凹陷；面中部發(fā)育不足，凹面型，眶距增寬；上頜骨及顴骨發(fā)育不足，下頜骨發(fā)育相對正常；肩部窄小，胸部呈圓錐形，鎖骨短小，僅在近胸骨處可捫及，雙肩下垂并可在胸前并攏。x線（圖2）檢查：上下頜骨內(nèi)有埋伏牙，滯留乳牙牙根未見明顯吸收，前囟門未閉合，顱縫增寬，并見多塊縫間骨，雙側(cè)肩胛骨較小，呈翼狀，位置下垂，雙側(cè)鎖骨肩峰端部分缺如，恥骨聯(lián)合間隙增寬，骶髂關(guān)節(jié)輕度增寬。先證者及其母親的臨床表現(xiàn)和x線特征均符合ccd特征。該家系中3代共15位成

5、員，其中ccd患者2例：先證者及其母親，其母親自述先證者姥姥、姥爺和其兄弟姐妹無類似癥狀。箭頭所指為先證者，代表代數(shù)。圖 1 患者家族譜系圖fig 1 the pedigree of the involved family1.2 基因組dna提取及測序1.2.1 dna提取 抽取先證者及其父母、姐姐外周靜脈血各2 ml，放入干冰凍存，使用universal ge-nomic dna extraction kit試劑盒進行dna 提取，取 1 l進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得基因組dna。1.2.2 聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，pcr）擴增 參照文獻6的方法設(shè)計7

6、對寡核苷酸引物（表1），然后對runx2 基因分別使用takara la taq?、takara mightyamp dna polymerase?進行套式pcr 擴增，反應體系及方法按照說明書進行。1.2.3 基因測序及突變位點分析 使用takara aga-rose gel dna purification kit切膠回收目的片段進行測序，測序由寶生物工程（大連）有限公司完成，并對測序結(jié)果進行blastn比較分析。2 結(jié)果將先證者的runx2基因測序結(jié)果進行blastn比較分析，在exon 2上發(fā)現(xiàn)了一個ct突變，實際測序圖譜顯示雙峰結(jié)構(gòu)（c、t）；對于其ccd母親的基因檢測結(jié)果表明，此突

7、變來自母系染色體該基因568位點的基因突變；密碼子cggtgg可能引起runx2編碼的轉(zhuǎn)錄因子第190位（r190w）保守的精氨酸變成色氨酸。該突變型為c.568c>t，cgg>tgg。先證者的父親、姐姐的測序結(jié)果顯示，在同一位點顯示c的單峰，即與blastn中健康人的序列相同（圖3）。3 討論目前的研究表明，顱鎖骨發(fā)育不全的致病基因是runx2，該基因定位于染色體6p217-8，基因的錯意表達、基因插入、缺失或者移碼突變等都是造成顱鎖骨發(fā)育不全綜合征的重要原因9。鎖骨顱骨發(fā)育不全呈常染色體顯性遺傳，有很高的外顯率和不同的表現(xiàn)型，輕癥僅有牙齒異常，嚴重者表現(xiàn)為全身骨質(zhì)受累2。本研究

8、家系中母女兩人受累，家系其他成員表型正常，考慮基因突變?yōu)橥话l(fā)性，突發(fā)后呈常染色體顯性遺傳。鎖骨顱骨發(fā)育不全的致病基因runx2是哺乳動物編碼轉(zhuǎn)錄因子pebp2/cbf異二聚體d亞單位的3個基因之一，此亞單位包含了有結(jié)合dna能力的128個氨基酸殘基，并且這一結(jié)構(gòu)在進化中為保守區(qū)域，與果蠅的runt區(qū)域具有較高的同源性，因而得名6。研究發(fā)現(xiàn)runx2基因敲除小鼠模型沒有骨組織和成骨細胞，這表明該轉(zhuǎn)錄因子為成骨細胞分化所必需，其在維持正常的骨骼生長發(fā)育中起著重要的作用10-11。runx2基因突變存在熱點區(qū)域，該基因外顯子1、2、3、5、7編碼蛋白質(zhì)的3個重要功能域：谷氨酸-丙氨酸富集區(qū)（qa功能

9、域）、runt功能域和脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)（pst功能域）12-14。本研究檢測到的r190w突變發(fā)生在runx2中，位于runt功能域內(nèi)，這個堿基改變將導致位于runt 結(jié)構(gòu)域中第190 位保守的精氨酸編碼為色氨酸（r190w）。在runt區(qū)域中的精氨酸拉伸物對dna的結(jié)合有重要作用，因此，這個區(qū)域的破壞可以導致dna結(jié)合能力的喪失13，精氨酸側(cè)鏈是dna結(jié)合的主要區(qū)域，當被不同的疏水性的色氨酸代替后，干擾了runt區(qū)域的結(jié)構(gòu)，降低了dna的結(jié)合能力。2001年berg-witz等15首次報道了這個突變位點，本研究結(jié)果則進一步證實了runx2中的r190w錯義突變?yōu)閏cd的致病突變，

10、推測r190w（c.568c>t）為一個突變熱點。典型ccd一般根據(jù)患者的典型面容、咬合關(guān)系、x線片檢查以及全身情況即可診斷，x線檢查方法為確診本病的主要手段。由于ccd的x線征象具有特殊性，所以診斷并不困難，關(guān)鍵在于是否能想到本病。但對于輕癥特別是僅有牙齒萌出異?；颊叩呐R床診斷較困難，通過檢測runx2是否存在突變位點可以輔助診斷ccd。由于本病目前尚無確切有效的治療手段且外顯率高，即使檢測基因發(fā)現(xiàn)有突變位點也并無好的治療方法，因此ccd患者愿意進行抽血基因檢測的比例很少。盡管目前已有8090個runx2不同的突變位點被報道，約500個獨立的ccd患者家族經(jīng)過突變檢測的篩選，但是此疾病

11、致病基因的篩選和驗證分析工作仍遠遠不夠，新基因位點的鑒定將保證進一步的系統(tǒng)突變分析工作的開展，這可以為探討ccd致病機制的分子遺傳學機制打下堅實的基礎(chǔ)。對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的ccd患者應進行遺傳咨詢，通過產(chǎn)前診斷及時發(fā)現(xiàn)攜帶有致病基因的胎兒16。目前對ccd并無確切有效的治療方法。對于處于生長發(fā)育期的患者可以采用正畸的方法進行治療，必要時拔除滯留乳牙，減小恒牙萌出的阻力，或者采用牽引的辦法幫助恒牙萌出；對于骨缺損導致的鼻梁塌陷等，可采用整形外科手術(shù)的方法進行骨移植，恢復患者的容貌；對于缺失牙齒，可采用種植或活動義齒等修復方法來進行修復。總之，對于ccd患者需要多學科聯(lián)合修復治療，長期的臨床效果尚需要進

12、一步觀察。參考文獻1 mundlos s， otto f， mundlos c， et al. mutations involving the transcription factor cbfa1 cause cleidocranial dyspla-siaj. cell， 1997， 89（5）：773-779.2 mundlos s. cleidocranial dysplasia： clinical and molecu-lar geneticsj. j med genet， 1999， 36（3）：177-182.3 fernandez ba， siegel-bartelt j， he

13、rbrick ja， et al. holo-prosencephaly and cleidocranial dysplasia in a patient due to two position-effect mutations： case report and review of the literaturej. clin genet， 2005， 68（4）：349-359.4 鄧潤智， 唐恩溢， 楊旭東， 等. 顱骨鎖骨發(fā)育不全綜合征的特征分析j. 口腔醫(yī)學研究， 2008， 24（1）：70-71.deng runzhi， tang enyi， yang xudong， et al.

14、clinical cha-racteristics of cleidocranial dysplasiaj. j oral sci res， 2008， 24（1）：70-71.5 蔣蘭， 李勇， 賴文莉. 鎖骨顱骨發(fā)育不全綜合征1例j. 華西口腔醫(yī)學雜志， 2009， 27（4）：459-460.jiang lan， li yong， lai wenli. cleidocranial dysplasia： acase reportj. west china j stomatol， 2009， 27（4）：459-460.6 quack i， vonderstrass b， stock m，

15、et al. mutation analysis of core binding factor a1 in patients with cleidocranial dys-plasiaj. am j hum genet， 1999， 65（5）：1268-1278.7 lin wd， lin sp， wang ch， et al. runx2 mutations in tai-wanese patients with cleidocranial dysplasiaj. genet mol biol， 2011， 34（2）：201-204.8 kamamoto m， machida j， mi

16、yachi h， et al. a novel muta-tion in the c-terminal region of runx2/cbfa1 distal to the dna-binding runt domain in a japanese patient with cleidocranial dysplasiaj. int j oral maxillofac surg， 2011， 40（4）：434-437.9 zhang c， zheng s， wang y， et al. mutational analysis of runx2 gene in chinese patient

17、s with cleidocranial dyspla-siaj. mutagenesis， 2010， 25（6）：589-594.10 komori t， yagi h， nomura s， et al. targeted disruption of cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblastsj. cell， 1997， 89（5）：755-764.11 chung cr， tsuji k， nifuji a， et al. micro-ct e

18、valuation of tooth， calvaria and mechanical stress-induced tooth mo-vement in adult runx2/cbfa1 heterozygous knock-out micej. j med dent sci， 2004， 51（1）：105-113.12 軒東英， 莊最新， 謝寶儀， 等. 顱骨鎖骨發(fā)育不良綜合征患者的runx2基因突變檢測分析j. 實用口腔醫(yī)學雜志， 2009， 25（4）：544-547.xuan dongying， zhuang zuixin， xie baoyi， et al. mutations in runx2 gene in a chinese family with cleidocranial dy-splasia（ccd）j. j pract stomatol， 2009， 25（4）：544-547.13 yoshida t， kanegane h， osato m， et al. functional ana-lysis of runx2 mutations in japanese patients wit