NOX4報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控初探

1、NOX4報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)調(diào)控初探 作者：趙麗君 劉燕翔 劉珍 王伯瑤 黃寧 吳琦【摘要】 目的：構(gòu)建NOX4熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體，探討NOX4基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。方法：以細(xì)胞基因組DNA為模板作，采用PCR擴(kuò)增NOX4基因上游調(diào)控序列(533bp)，插入質(zhì)粒pGL3basic載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3NOX4，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。將pGL3NOX4轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，通過細(xì)胞因子刺激觀察報(bào)告基因表達(dá)水平。結(jié)果：酶切及測(cè)序證實(shí)NOX4報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染報(bào)告基因的A549細(xì)胞以細(xì)胞因子刺激，結(jié)果顯示NOX4表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論：成功構(gòu)建了NOX4熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體，為進(jìn)一

2、步研究NOX4基因的表達(dá)規(guī)律及生理功能奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 NOX4;報(bào)告基因;表達(dá)調(diào)控還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶首先發(fā)現(xiàn)于中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞，在吞噬微生物病原體時(shí)，NADPH氧化酶被激活，細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，成為機(jī)體抵抗微生物感染的重要成分1。近年，在非吞噬細(xì)胞質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名為NOX(NADPH oxidase)蛋白家族。人類基因組同源性檢索發(fā)現(xiàn)了7種NADPH氧化酶，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox22-4。

3、NOX家族廣泛表達(dá)于機(jī)體的組織器官，它們的生物學(xué)功能成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。為了探討NOX家族中NOX4在機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)中的作用，我們構(gòu)建NOX4報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL3NOX4，并初步觀察了炎癥細(xì)胞因子對(duì)該基因表達(dá)水平的影響。1 主要材料和試劑A549上皮細(xì)胞株、E.coli DH5為本實(shí)驗(yàn)室保存。熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3basic，海腎熒光素酶內(nèi)對(duì)照?qǐng)?bào)告載體pRLTK及DualLuciferase Report Assay System為Promega產(chǎn)品。質(zhì)粒提取，PCR產(chǎn)物純化及凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。DMEM培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自In

4、vitrogen公司。新生小牛血清購(gòu)自蘭州民海生物工程有限公司，細(xì)胞因子TNF、IFN購(gòu)自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP,限制性內(nèi)切酶(Xho1，BamH)，T4DNA連接酶等購(gòu)自Takara公司?；蚪MDNA提取試劑盒，DL2000 DNA Marker購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司。2 方法2.1 質(zhì)粒載體的構(gòu)建2.1.1 引物合成 通過GenBank檢索NOX4基因全序列，參考相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出含有NFB結(jié)合位點(diǎn)的NOX4基因上游調(diào)控序列。引物設(shè)計(jì)采用Primer5.0軟件，其序列如下：P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAGP2：GGTGGATC

5、CCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA引物分別含限制性內(nèi)切酶Xho1，BamH酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段全長(zhǎng)533bp。引物由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。2.1.2 PCR 以細(xì)胞基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25L，含10×PCR反應(yīng)buffer2.5L; dNTP 2L;上下游引物各0.5L;Pfu高保真酶0.2L;DNA模板0.5L;其余加水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為94變性3min，之后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94 30s，.51 30s，72 4min,，)，72延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將PCR產(chǎn)物做電泳膠回收。pGL3basic載體用Xho1，Ba

6、mH雙酶切，小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收質(zhì)粒載體。2.1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 經(jīng)酶切純化后的PCR產(chǎn)物和pGL3basic載體用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5感受態(tài)細(xì)菌中，涂布于LB培養(yǎng)板，37孵育過夜，挑取細(xì)菌克隆提質(zhì)粒，用Xho1，BamH進(jìn)行雙酶切鑒定，最后經(jīng)ABI 3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序(上海英俊生物技術(shù)有限公司)。2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及報(bào)告基因活性檢測(cè)2.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用含10%新生小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，按每孔10×104個(gè)細(xì)胞密度接種于48孔培養(yǎng)板，當(dāng)

7、細(xì)胞達(dá)85-95%時(shí)，按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行重組質(zhì)粒pGL3basicNOX4和pRLTK載體轉(zhuǎn)染。具體操作為將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無血清的DMEM( 100L/孔)，Lipofectamine 2000與質(zhì)粒DNA(報(bào)告基因重組質(zhì)粒和內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒pRLTK)以一定比例各加入100L無血清的DMEM中，5min后混合，室溫孵育20min，再加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，37，5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24-48h。2.2.2 細(xì)胞因子刺激試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組為TNF組，IFN組，TNF+IFN組，空白對(duì)照組。TNF終濃度為25ng·mL-1，IFN終濃度為10ng·mL-1，在

8、細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞的不同時(shí)間點(diǎn)(6h，12h，24h)，裂解細(xì)胞檢測(cè)NOX4報(bào)告基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3復(fù)孔。2.2.3 報(bào)告基因活性檢測(cè) 在細(xì)胞因子刺激細(xì)胞后的不時(shí)間點(diǎn)吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞。每孔加入60L的1×PLB細(xì)胞裂解液(按DualLuciferase Report Assay System試劑盒說明配備)，孵育30min，收集裂解液，10000轉(zhuǎn)4離心10min，上請(qǐng)儲(chǔ)存于-20備用。取20L細(xì)胞裂解上請(qǐng)，根據(jù)DualLuciferase Report Assay System試劑盒說明進(jìn)行報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶及內(nèi)對(duì)照海腎熒光素酶檢測(cè)，儀器采用Beckman

9、Coulter DTX880。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行分析，采用T檢驗(yàn)。3 結(jié)果3.1 報(bào)告基因重組質(zhì)粒(pGL3NOX4)的構(gòu)建和鑒定以基因組DNA為模板，利用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果在約533bp處可以見到與預(yù)期大小相符的目的片段(圖1)。PCR產(chǎn)物插入pGL3basic載體，得到重組質(zhì)粒pGL3NOX4經(jīng)Xho，BamH雙酶切鑒定，顯示有一條為約533bp片段(圖2)，通過上海英俊生物公司測(cè)序證實(shí)，重組質(zhì)粒目的片段與Genbank報(bào)道序列一致。3.2 細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞報(bào)告基因活性檢測(cè)用細(xì)胞因子TNF，IFN刺激轉(zhuǎn)染了報(bào)告基因pGL3NOX4的A

10、549細(xì)胞，分別于刺激6、12、24小時(shí)裂解細(xì)胞測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果顯示單獨(dú)采用TNF或IFN都能夠刺激報(bào)告基因的表達(dá)，而聯(lián)合使用兩種細(xì)胞因子的刺激作用更強(qiáng)。在刺激6、12、24小時(shí)，兩種細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性分別為未加細(xì)胞因子的陰性對(duì)照組(DMEM對(duì)照)熒光素酶活性的2.6、2.2、2.0倍。實(shí)驗(yàn)數(shù)值經(jīng)SPSS軟件分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，P<0.05(圖3)4 討論表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶最先被發(fā)現(xiàn)，該酶是吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)的關(guān)鍵分子，吞噬細(xì)胞通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，成為依賴氧殺菌機(jī)制的重要介

11、質(zhì)1。吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的催化亞基gp91 phox位于細(xì)胞質(zhì)膜，當(dāng)細(xì)胞受刺激后，gp91phox與胞漿中其他亞基(p22phox，p47phox，p40phox，p67phox,和Rac)共同形成有活性的NADPH氧化酶復(fù)合體。吞噬細(xì)胞gp91 phox現(xiàn)在稱為NOX2。與gp91 phox結(jié)構(gòu)同源的分子共同組成NOX蛋白家族，他們包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5，Duox1和Duox2。他們與NOX2一樣均參與細(xì)胞ROS生成，所不同的是，NOX2似特異表達(dá)于吞噬細(xì)胞，而NOX蛋白家族其他成員在組織細(xì)胞有廣泛表達(dá)，由于他們發(fā)現(xiàn)較晚，其生理功能研究有待深入2-3?；钚?/p>

12、氧往往作為第二信使參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在MAPKs信號(hào)通路、JAKSTAT信號(hào)通路、NFB信號(hào)通路等，都有活性氧參與其中，這些信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞分裂分化，轉(zhuǎn)化，遷移，凋亡等過程密切相關(guān)，由此也提示NOX蛋白家族與上述重要生命現(xiàn)象關(guān)聯(lián)4-6。最初研究表明，NOX4在腎臟組織中大量的表達(dá)，它可能作為一種敏感性氧感受器，NOX4主要分布在鼠腎的近端小管和人腎單位遠(yuǎn)端，而促紅細(xì)胞生成素(EPO)的生成與管周細(xì)胞相鄰。在肝臟也表達(dá)少量NOX4的mRNA，提示N0X4可能作為EPO合成的氧感受器7-8。最近有研究發(fā)現(xiàn)，NOX4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中也有一定表達(dá)。除了NOX2，NOX家族其他分子在機(jī)體天然免疫及

13、炎癥中的作用仍有待研究9-10。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了NOX4熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒，成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，以此為模型，觀察炎癥細(xì)胞因子對(duì)NOX4表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF、IFN刺激NOX4基因表達(dá)，這不但提示NOX4參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)，同時(shí)為我們進(jìn)一步探討NOX家族在機(jī)體對(duì)抗微生物感染過程中的作用奠定了很好的基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】 1 Clark RA. Activation of the neutrophil respiratory burst oxidaseJ. J Infect Dis, 1999, 179(Suppl 2): S309-S317.2Kikuchi H, Hikage M, Miy

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