CRISPR基因編輯技術(shù)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1CRISPR基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù) 1973 1973年，斯坦利年，斯坦利NN科恩科恩(Stanley N. Cohen)(Stanley N. Cohen)和赫伯特和赫伯特WW博耶博耶(Herbert W. Boyer)(Herbert W. Boyer) 成功將蛙的成功將蛙的DNADNA插入到細菌中。插入到細菌中。 20 20世紀世紀7070年代，基因泰克年代，基因泰克(Genetech)(Genetech)公司對大腸桿菌進行基因改造，使其帶有一個人源基因公司對大腸桿菌進行基因改造，使其帶有一個人源基因( (這個基因是人工合成的這個基因是人工合成的) )，最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰

2、島素。，最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素。 19741974年，加利福尼亞州索克生物研究所年，加利福尼亞州索克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)(Salk Institute for Biological Studies)的的Rudolf JaenischRudolf Jaenisch通過將通過將SV40 SV40 病毒的病毒的DNADNA注射到小鼠的囊胚中注射到小鼠的囊胚中, ,培育出了第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。培育出了第一只轉(zhuǎn)基因小鼠?；蛲蛔兗夹g(shù)：物理誘變、化學(xué)誘變基因突變技術(shù)：物理誘變、化學(xué)誘變轉(zhuǎn)基因技術(shù)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)：T-DNAT-DNA插入插

3、入RNARNA干擾技術(shù)：干擾技術(shù)：dsRNAdsRNA、Artificial miRNAArtificial miRNA核外遺傳技術(shù)：質(zhì)粒、人工染色體核外遺傳技術(shù)：質(zhì)粒、人工染色體同源重組技術(shù)：同源重組技術(shù)：e.g. e.g. 傳統(tǒng)的基因敲除小鼠傳統(tǒng)的基因敲除小鼠1.1. 無法控制突變位點無法控制突變位點2.2. 不能精確控制外源基因插入位點不能精確控制外源基因插入位點3.3. 對靶基因抑制不徹底、不特異對靶基因抑制不徹底、不特異4.4. 難以穩(wěn)定的遺傳難以穩(wěn)定的遺傳5.5. 費時費力費錢，難以大量應(yīng)用費時費力費錢，難以大量應(yīng)用并引起一系列生物倫理的問題并引起一系列生物倫理的問題現(xiàn)現(xiàn) 狀狀歷史

4、歷史p 1993年前ZFN就已開始出現(xiàn)，迄今已發(fā)展了20多年才有今天的成就；p 2009年底出現(xiàn)的TALEN似乎一夜之間呈現(xiàn)出取代ZFN的架勢；p 2012年底CRISPR/Cas已顯現(xiàn)出取代TALEN的巨大潛力，在2013年成為現(xiàn)實。榮譽榮譽1. 2011年：ZFN， TALEN和Meganuclease2011年度方法（Nature Methods）2. 2012年：TALEN 2012年十大突破（Science）3. 2013年：CRISPR/Cas被認為是諾貝爾獎級別的成果，華人科學(xué)家張峰已因此獲得生物醫(yī)學(xué)大獎。應(yīng)用應(yīng)用p 基因組巡航導(dǎo)彈，分子剪刀，DNA外科醫(yī)生p 定點突變，定點修飾

5、（包括得到轉(zhuǎn)基因），轉(zhuǎn)錄調(diào)控p 基因治療（如遺傳?。┨禺愋蕴禺愋訢NA識別域識別域非特異性非特異性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶+89核酸內(nèi)切酶：核酸內(nèi)切酶： 非特異性核酸內(nèi)切酶非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時形成二聚體時切割雙鏈切割雙鏈DNA 兩條兩條ZFN之間具有被稱為之間具有被稱為“間隔區(qū)間隔區(qū)”的的spacer結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的長度以結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的長度以56bp為宜，為宜，7bp也能正常工作，合理的也能正常工作，合理的“間隔區(qū)間隔區(qū)”設(shè)計才能保證設(shè)計才能保證ZFN二聚體擁有最佳的工作空間。二聚體擁有最佳的工作空間。全長為全長為34aa的的Tal 蛋白的第蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性

6、識別核苷酸堿基位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。 NG可以識別可以識別T HD可以識別可以識別C NI可以識別可以識別A NN可以識別可以識別G或或A通過這種特異性識別，將多個通過這種特異性識別，將多個Tal蛋白組裝在一起，就可以構(gòu)成可以識別目的片段的蛋白組裝在一起，就可以構(gòu)成可以識別目的片段的Tale蛋白。蛋白。TALEN原理原理TALENTALEN的特異性打靶的原理：的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的一對可以特異性識別靶基因的TALETALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶然后非特異性核酸內(nèi)切酶FokIFokI切斷雙鏈切斷雙鏈

7、DNADNA從而造成從而造成DNADNA雙鏈斷裂（雙鏈斷裂（double-strand breakdouble-strand break，DSBDSB）；）；再通過再通過DNADNA的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。FokIFokI只有在形成二聚體的時候才有內(nèi)切酶活性。只有在形成二聚體的時候才有內(nèi)切酶活性。TALEN原理原理CRISPR/Cas 9 背景背景 CRISPR是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自

8、己的基因整合到細菌內(nèi)，利用細菌的細胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，到細菌內(nèi)，利用細菌的細胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出很多成簇細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列( (既既CRISPR序列序列) )和和CRISPR相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于1987年年首次發(fā)現(xiàn)首次發(fā)現(xiàn)(1)，于，于2002年被年被Jansen等將正式命名等將正式命名(。CRISPR/Cas 9 背景背景CRISPR/Cas 9概述概述CRISPR-Cas：一種來源是細菌獲得性免疫的由：

9、一種來源是細菌獲得性免疫的由RNA指指導(dǎo)導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。CasCas蛋白是一種雙鏈蛋白是一種雙鏈DNADNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNAguide RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它與與folkfolk酶功能類似，但是它并不需要形酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。成二聚體才能發(fā)揮作用。CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)識別作用識別作用切割作用切割作用 CRISPR系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（repeats，R）與長度相似的間區(qū)序列（與長

10、度相似的間區(qū)序列（spacers，S）間隔排列而成的）間隔排列而成的CRISPRCRISPR簇，前導(dǎo)序列簇，前導(dǎo)序列( (leader，L)以及一系列的以及一系列的CRISPR相關(guān)蛋白基因相關(guān)蛋白基因(cas)(cas)。 Cas（CRISPR associated）：存在于）：存在于CRISPR位點附近，是位點附近，是一種雙鏈一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引導(dǎo)下對靶位點進行切引導(dǎo)下對靶位點進行切割。它不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。割。它不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。CRISPR的轉(zhuǎn)錄與加工的轉(zhuǎn)錄與加工CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即（簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即

11、（crRNA），然后），然后逐步被加工成小的逐步被加工成小的 crRNA。CRISPR/Cas 9作用機理作用機理CRISPR/Cas 9作用機理作用機理PAM（NGG序列）序列）CRISPR/Cas 9系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。在人。在人類基因組中，平均每類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個就出現(xiàn)一個NGG PAM。CRISPR/Cas 9基因編輯實驗流程圖基因編輯實驗流程圖CRISPR/Cas 9的技術(shù)應(yīng)用的技術(shù)應(yīng)用應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉

12、默、激活等。能夠在真核細胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的能夠在真核細胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的特異性位點發(fā)生雙鏈斷裂。特異性位點發(fā)生雙鏈斷裂。在模式生物中的應(yīng)用在模式生物中的應(yīng)用: :成功地對線蟲成功地對線蟲( (左左) )、斑馬魚胚胎（中）和果蠅進行遺傳學(xué)改斑馬魚胚胎（中）和果蠅進行遺傳學(xué)改造，獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積造，獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積更大的斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的更大的斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的果蠅，表明果蠅，表明CRISPR技術(shù)在動物基因改造技術(shù)在動物基因改造方面有巨大應(yīng)用潛力。方面有巨大應(yīng)用潛力。中國科學(xué)院遺傳中國科學(xué)院遺傳所高彩霞團隊：所高彩霞團隊：成功

13、地使三種水成功地使三種水稻基因失活。稻基因失活。近日，中國科學(xué)家利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，對抑制狗骨骼肌生長的基因（MSTN）進行了敲除，培育出兩只肌肉發(fā)達的“大力神”狗，成功構(gòu)建了世界首個基因敲除狗模型。CRISPR/Cas 9的技術(shù)應(yīng)用的技術(shù)應(yīng)用三大基因修飾技術(shù)比較三大基因修飾技術(shù)比較CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的優(yōu)勢系統(tǒng)的優(yōu)勢操作簡單，靶向精確性更高。操作簡單，靶向精確性更高。sgRNA靶向序列和基因組序列靶向序列和基因組序列必須完全匹配，必須完全匹配，Cas9才會對才會對DNA進行剪切。編碼進行剪切。編碼sgRNA 的的序列不超過序列不超過100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)

14、建TALENs和和ZENs更簡單方便，更簡單方便，用于用于CRISPR的的sgRNA識別序列僅需識別序列僅需2020個核苷酸。個核苷酸。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由系統(tǒng)是由RNA調(diào)控的對調(diào)控的對DNA的修飾，其基因的修飾，其基因修飾可遺傳。修飾可遺傳?；蛐揎椔矢?，基因修飾率高，CRISPRs基因敲入的效率為基因敲入的效率為51%-79%，TALENs的效率為的效率為0%-34%。基因調(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等基因調(diào)控方式多樣，例如敲除、插入、抑制、激活等無物種限制無物種限制, ,可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除?？蓪崿F(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。實驗周期短，最快僅需實驗周期短，

15、最快僅需2個月，節(jié)省大量時間和成本。個月，節(jié)省大量時間和成本。(ZFNS(ZFNS一個靶點成本一個靶點成本60006000) )CRISPR/Cas 9系統(tǒng)的評價系統(tǒng)的評價參考文獻：參考文獻：1 Y. Ishino, H. Shinagawa, K. Makino, M. Amemura, A. Nakata, Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology 169, 5429-5433 (1987).2 R. Jansen, J. D. A. v. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls, Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecu