潔凈室(區(qū))浮游菌測定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、1.目的：建立一個潔凈室（區(qū)）浮游菌測定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保潔凈室（區(qū)）潔凈程度。2.范圍：適用于潔凈室和潔凈區(qū)、無菌室或局部空氣凈化區(qū)域（包括潔凈工作臺）的浮游菌的測定和環(huán)境的驗證。3.責(zé)任：質(zhì)量管理部QA監(jiān)測員對本規(guī)程的實施負(fù)責(zé)。4.程序：4.1.術(shù)語和定義：下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。4.1.1.菌落 ：微生物培養(yǎng)后，由一個或幾個微生物繁殖而形成的微生物集落，簡稱CFU。通常用個數(shù)表示。4.1.2.浮游菌：用本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提及的方法收集懸浮在空氣中的活微生物粒子，通過專門的培養(yǎng)基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數(shù)。4.1.3.浮游菌濃度：單位體積空氣中含浮游菌菌落數(shù)的多少，以

2、計數(shù)濃度表示，單位是個/m3或個/L。4.1.4.糾偏限度：對于受控的潔凈室（區(qū)），由使用者自行設(shè)定微生物含量等級。當(dāng)檢測結(jié)果超過該等級時，應(yīng)啟動監(jiān)測程序?qū)υ搮^(qū)域的微生物污染情況立即進(jìn)行跟蹤。4.1.5.警戒限度：對于受控制的潔凈室（區(qū)），由使用者自行設(shè)定一個微生物含量等級，從而給定了一個正常狀態(tài)相比最早警戒的偏差值。當(dāng)超過該最早警戒的偏差值時，應(yīng)啟動保證工藝或環(huán)境不受影響的程序及相關(guān)措施。4.2.測試方法4.2.1.方法提要：本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程采用的方法是計數(shù)濃度法。即通過收集懸游在空氣中的生物性粒子于專門的培養(yǎng)基（選擇能證實其能夠支持微生物生長的培養(yǎng)基），經(jīng)若干時間和適宜的生長條件讓其繁殖到可

3、見的菌落計數(shù)，以判定該潔凈室的微生物濃度。4.2.2.人員的職責(zé)及培訓(xùn)：潔凈室（區(qū)）的測試人員應(yīng)進(jìn)行本專業(yè)的培訓(xùn)并獲得相應(yīng)資格后才能履行對潔凈室（區(qū)）測試的職責(zé)，其中包含涉及的衛(wèi)生知識和基本微生物知識。潔凈室（區(qū)）的測試人員應(yīng)選擇與生產(chǎn)操作的空氣潔凈度級別要求相適應(yīng)的穿戴方式。4.2.3.儀器、輔助設(shè)備和培養(yǎng)基選擇合適的浮游菌采樣器，包括采用無油的抽氣泵，較低的氣流流速和較大的采樣流量，以保證培養(yǎng)基表面的水分不被吹干。本測試需要具備儀器、輔助設(shè)備和培養(yǎng)基如下：浮游菌采樣器、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基（見本標(biāo)準(zhǔn)附錄B）、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌器。4.2.4.浮游菌采樣器原理浮游菌采樣器一般采用撞擊法機理，

4、可分為狹縫式采樣器、離心式或針孔式采樣器。狹縫式采樣器由內(nèi)部風(fēng)機將氣流吸入，通過采樣器的狹縫式平板，將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉(zhuǎn)的平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機的高速旋轉(zhuǎn)，氣流從采樣器前部吸入從后部流出，在離心力的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時間撞擊到專用的固形培養(yǎng)條上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。針孔式采樣器是氣流通過一個金屬蓋吸入，蓋子上市密集的經(jīng)過機械加工的特制小孔，通過風(fēng)機將收集到得細(xì)小的空氣流直接撞擊到平板培養(yǎng)基表面上，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中使用的浮游菌采樣器為狹縫式采樣器。4.2.5.

5、測試要點4.2.5.1.必須按照測試儀器的檢定周期，定期對儀器作檢定，使用校驗合格，且在使用有效期內(nèi)的儀器。4.2.5.2.測試儀器在未進(jìn)入被測區(qū)域時，若必需，則先清潔表面，或在相應(yīng)的潔凈室內(nèi)準(zhǔn)備和存放（用保護罩或其他適應(yīng)當(dāng)?shù)赝庹直Ｗo儀器）。4.2.5.3.在A級潔凈室內(nèi)用紙時，上面應(yīng)蒙上一張透明不沾塵的覆蓋物，在A級潔凈室內(nèi)不能用鉛筆和橡皮。4.2.5.4.使用測試儀器時應(yīng)嚴(yán)格按照儀器說明書操作。4.2.5.4.1.儀器開機，預(yù)熱至穩(wěn)定后，方可按儀器說明書的規(guī)定對儀器進(jìn)行校正，同時檢查采樣流量，并根據(jù)采樣量設(shè)定采樣時間。4.2.5.4.2.采樣口必須用便于消毒及化學(xué)性能穩(wěn)定的材料制造。4.2

6、.5.4.3.采樣管嚴(yán)禁滲漏，內(nèi)壁應(yīng)光滑。4.2.5.4.4.采樣管的長度應(yīng)根據(jù)測點的高度定，盡量減少彎曲。4.2.6.培養(yǎng)皿4.2.6.1.一般采用90mm×15mm規(guī)格的培養(yǎng)皿。可根據(jù)所選用采樣器選擇合適的培養(yǎng)皿。在本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中采用150mm×15mm規(guī)格的培養(yǎng)皿4.2.6.2.離心式采樣器采用專用的固形培養(yǎng)條。4.2.7.培養(yǎng)基：大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）或沙氏培養(yǎng)基(SDA)或其他用戶認(rèn)可并經(jīng)驗證了的培養(yǎng)基。其配制方法見附錄B。4.2.8.恒溫培養(yǎng)箱：必須定期對恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行校驗。4.2.9.測試步驟4.2.9.1.測試前儀器、培養(yǎng)皿表面必須嚴(yán)格消毒。4.2

7、.9.1.1.采樣器進(jìn)入被測房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，用于A級潔凈室的采樣宜預(yù)先放在被測房間內(nèi)。4.2.9.1.2.用消毒劑擦凈培養(yǎng)皿的外表面。4.2.9.1.3.采樣前，先用消毒劑清洗采樣器的頂蓋、轉(zhuǎn)盤以及罩子的內(nèi)外面，采樣結(jié)束，再用消毒劑輕輕噴射罩子的內(nèi)壁和轉(zhuǎn)盤。4.2.9.1.4.采樣口及采樣管，使用前必須高溫滅菌。如用消毒劑對采樣管的外壁及內(nèi)壁進(jìn)行消毒時，應(yīng)將管中的殘留液倒掉并晾干。4.2.9.1.5.采樣者應(yīng)穿戴與被測潔凈區(qū)域相應(yīng)的工作服，在轉(zhuǎn)盤上放入或調(diào)換培養(yǎng)皿前，雙手用消毒劑消毒或戴無菌手套操作。4.2.9.1.6.采樣儀器經(jīng)消毒后先不放入培養(yǎng)皿，開啟浮游菌采樣器，使儀器中

8、的殘余消毒劑蒸發(fā)，時間不少于5min，并檢查流量并根據(jù)采樣量調(diào)整設(shè)定采樣時間。4.2.9.1.7.關(guān)閉浮游菌采樣器，放入培養(yǎng)皿，蓋上蓋子。4.2.9.1.8.置采樣口于采樣點后，開啟浮游菌采樣器進(jìn)行采樣。4.2.10. 培養(yǎng)4.2.10.1.全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.2.10.2.采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于2d；采用沙氏培養(yǎng)基(SDA)配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在2025培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于5d。4.2.10.3.每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。4.2.11

9、.菌落計數(shù)4.2.11.1.用肉眼對培養(yǎng)皿上所有的菌落直接計數(shù)、標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用510倍的放大鏡檢查，有否遺漏。4.2.11.2.若平板上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。4.2.12.注意事項4.2.12.1.使用前應(yīng)仔細(xì)檢查每個培養(yǎng)皿的質(zhì)量，培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿有變質(zhì)、破損或污染的不能使用。4.2.12.2.對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。4.2.12.3.由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落或培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。4.3.測試規(guī)則4.3.

10、1.測試條件：在測試之前，要對潔凈室（區(qū)）相關(guān)參數(shù)進(jìn)行預(yù)先測試，這類測試將會提供測試懸浮粒子的環(huán)境條件，例如：這種預(yù)先測試或可包括：4.3.1.1.溫度和相對濕度的測試。潔凈室（區(qū)）的溫度和相對濕度應(yīng)與其生產(chǎn)及工藝要求相適應(yīng)（無特殊要求時，溫度在1826，相對濕度在4565為宜），同時應(yīng)滿足測試儀器的使用范圍;4.3.1.2.室內(nèi)送風(fēng)量或風(fēng)速的測試，或壓差的測試；4.3.1.3.高效過濾器的泄露測試。4.3.2.測試狀態(tài)：靜態(tài)和動態(tài)兩種狀態(tài)均可進(jìn)行測試。靜態(tài)測試時，室內(nèi)人員不得多于2人。浮游菌測試前，被測潔凈室（區(qū)）由使用者決定是否需要預(yù)先消毒。測試報告中應(yīng)標(biāo)明測試時采用的狀態(tài)和室內(nèi)測試人員數(shù)

11、。4.3.3.測試時間4.3.3.1.在空態(tài)或靜態(tài)a測試時，對單向流潔凈室（區(qū)）而言，測試宜在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運行時間不少于10min后開始。對非單向流潔凈室（區(qū)），測試宜在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運行時間不少于30min后開始。在靜態(tài)b測試時，對單向流潔凈室（區(qū)），測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)在并經(jīng)過10min自凈后開始；對非單項流潔凈室（區(qū)），測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)在并經(jīng)過20min自凈后開始。4.3.3.2.在動態(tài)測試時，則須記錄生產(chǎn)開始的時間以及測試時間。4.3.4.浮游菌濃度計數(shù)4.3.4.1.采樣點數(shù)量及其布置4.3.4.1.1. 最少采樣點數(shù)目：浮游菌測試的最少采樣點數(shù)目可參照

12、4.3.4.1.2. 采樣點的位置： 浮游菌的采樣點位置可參照。4.3.4.1.2.1.工作區(qū)測點位置離地0.8m1.5m左右（略高于工作面）；4.3.4.1.2.2.送風(fēng)口測點位置離開送風(fēng)面20cm左右；4.3.4.1.2.3.可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動范圍處增加測點。采樣點布置的規(guī)則見附錄A。4.3.4.2.最小采樣量：浮游菌每次最小采樣量見表1 表1 最小采樣量潔凈度級別采樣量L/次A級1 000B級1000C級500D級1004.3.4.3.采樣次數(shù)：每個采樣點一般采樣一次。4.3.4.4.采樣注意事項4.3.4.4.1.對于單向流潔凈室（區(qū)）或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝向應(yīng)正對氣流方向;

13、對于非單向流潔凈室（區(qū)），采樣口向上。4.3.4.4.2.布置采樣點時，至少應(yīng)盡量避開塵粒較集中的回風(fēng)口。4.3.4.4.3.采樣時，測試人員應(yīng)站在采樣口的下風(fēng)側(cè)，并盡量少走動。4.3.4.4.4.應(yīng)采取一切措施防止采樣過程的污染和其他可能對樣本的污染。4.3.4.4.5.培養(yǎng)皿在用于檢測時，為避免培養(yǎng)皿運輸或搬動過程造成的影響，宜同時進(jìn)行陰性對照試驗，每次或每個區(qū)域取1個對照皿，與采樣皿同法操作但不需暴漏采樣，然后與采樣后的培養(yǎng)皿（TSA或SDA）一起放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)果應(yīng)無菌落生長。4.3.5.記錄：測試報告應(yīng)包含以下內(nèi)容：4.3.5.1.測試者的名稱和地址，測試日期；4.3.5.2.測

14、試依據(jù)；4.3.5.3.被測潔凈室（區(qū)）的平面位置（必要時標(biāo)注相鄰區(qū)域的平面位置）；4.3.5.4.有關(guān)測試儀器及其測試方法的描述：包括測試環(huán)境條件，采樣點數(shù)目以及布置圖，測試次數(shù)，采樣流量，或可能存在的測試方法的變更，測試儀器的檢定證書等；若為動態(tài)測試，則還應(yīng)記錄現(xiàn)場操作人員數(shù)量及位置，現(xiàn)場運轉(zhuǎn)設(shè)備和數(shù)量和位置；4.3.5.5.測試結(jié)果；包括所有統(tǒng)計計算資料。4.3.6.計算結(jié)果4.3.6.1.用計數(shù)方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。浮游菌平均濃度（個/m3）=菌落數(shù)4.3.6.2.每個測點的浮游菌平均濃度的計算，見式（1）。采樣量 (1)1=2.5個/m3浮游菌平均濃度（個/m3）= 示例1：某

15、測點采樣量為400L，菌落數(shù)為1.則：0.4 3浮游菌平均濃度（個/m3）=1.5個/m3 示例2：某測點采樣量為2 m3，菌落數(shù)為3，則：24.3.7.結(jié)果評定：每個測點的浮游菌平均濃度必須低于所選評定標(biāo)準(zhǔn)中的界限。評定標(biāo)準(zhǔn)見表2 。表2 潔凈室區(qū)微生物監(jiān)測的動態(tài)標(biāo)準(zhǔn)項 目A級B級C級D級浮游菌cfu/ m3合格限值<110100200糾偏限值0.757.575150警戒限值0.5550100沉降菌（90mm）cfu/ 4h合格限值<1550100糾偏限值0.753.53575警戒限值0.52.52550表面微生物（55mm) cfu/皿合格限值<152550糾偏限值0.7

16、53.51840警戒限值0.52.512255變更歷史版本號生效日期變更原因、依據(jù)及詳細(xì)變更內(nèi)容01 年 月 日2010版GMP附 錄 A潔凈室（區(qū)）采樣點布置A1 潔凈室（區(qū)）采樣點布置宜力求均勻，避免采樣點在某局部區(qū)域過于稀疏。下列采多點采樣的采樣點布置圖示可作參考（見圖A1）。    · ·· · 注：·為采樣點。 圖A1 平面采樣點布置圖A2 A級單向流區(qū)域，潔凈工作臺或局部空氣凈化設(shè)施的采樣點宜布置在正對氣流方向的工作面上，氣流形式可參考圖A2、A3 圖A2 水平單向流的氣流形式 圖A3 垂直單向流的氣流

17、形式最少采樣點數(shù)參見.6.1.1.，采樣點一般在工作臺面上0.2m高度的平面上均勻布置。 附 錄 B （規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基的滅菌及準(zhǔn)備B.1 大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）培養(yǎng)基的滅菌及準(zhǔn)備B1.1 培養(yǎng)基采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，可以按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后按培養(yǎng)基規(guī)定的經(jīng)驗證合格的滅菌程序滅菌。B.1.2 大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基配方 酪蛋白胰酶消化物15g 大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g 氯化鈉5g 瓊脂15g 純化水1 000ml 取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，分裝，滅菌，冷卻至約60，在無菌操作要求下傾注約20ml至無菌平皿（f90mm1）中。加蓋后在室溫放至凝固。B .2 沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）培養(yǎng)基的滅菌及準(zhǔn)備 葡萄糖 40g 酪蛋白胰酶消化物、動物組織的胃