BD FACSCalibur流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀操作與維護(hù)程序目 的：規(guī)范BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀操作與維護(hù)程序，正確使用設(shè)備，保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行、操作人員人身安全和設(shè)備安全。適用范圍：本規(guī)程適用于BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀的使用操作。責(zé) 任 者：操作人員：負(fù)責(zé)按照本規(guī)程操作儀器設(shè)備，對儀器進(jìn)行日常維護(hù)，并作使用記錄。保管人員：負(fù)責(zé)監(jiān)管儀器操作是否符合規(guī)程，并對儀器進(jìn)行定期維護(hù)、保養(yǎng)?？剖邑?fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對儀器設(shè)備的綜合管理。內(nèi) 容：1. 每日開機(jī)程序1.1 在氣壓閥減壓的狀態(tài)下檢查鞘液桶，確認(rèn)：1.1.1鞘液充滿狀態(tài)，約3L1.1.2蓋緊蓋子1.1.3安上金屬擋板1.1.4管路暢通

2、，無扭曲1.2. 檢查廢液桶，確認(rèn)：1.2.1廢液桶充滿400ml漂白劑1.2.2管路暢通，無扭曲1.3打開流式細(xì)胞儀。1.4打開電腦。1.5氣壓閥置于加壓位置，并排除管路中氣泡。1.6做Prime。1.7等待機(jī)器預(yù)熱510分鐘后可開始試驗(yàn)。2. 每日關(guān)機(jī)程序2.1 用3mlFACSClean洗液加入樣品管中上樣，將樣品支撐架置于旁位，以外套管吸入1ml。2.2 將樣品支撐架置于中位，以HI RUN運(yùn)行10分鐘，使內(nèi)管吸入約1ml。2.3 將樣品管換成蒸餾水重復(fù)1-2步。2.4 放置盛有1ml蒸餾水的試管于樣品支撐架上。2.5 選擇Standby模式10分鐘，將激光冷卻后可關(guān)掉主機(jī)。2.6 退

3、出所有應(yīng)用軟件，關(guān)閉電腦。2.7 將流式細(xì)胞儀的壓力閥置于減壓狀態(tài)。3. 每月維護(hù)程序3.1 將FACSClean洗液12L裝入鞘液桶。3.2 旁路鞘液過濾器（過濾器上的快速接口從SANLINE FILTER端斷開，將鞘液白色管路液路取下聯(lián)到SANLINE FILTER端口），以防傷害。3.3 將盛有3ml FACSClean洗液的試管置于樣品支架上，以HI RUN 30分鐘。3.4 將鞘液和樣品換成蒸餾水重復(fù)步驟3，以 HI RUN 60分鐘。3.5 將鞘液桶裝滿鞘液，恢復(fù)過濾器。3.6 以HI RUN 10-20分鐘。3.7 在測定正式樣品之前實(shí)施每日開機(jī)程序。4. FACScomp 自動(dòng)

4、質(zhì)控操作4.1 試劑準(zhǔn)備4.1.1三色試劑的校正（Cat No：340486）4.1.1.1取四色試劑盒中的Unlabeled試劑，充分混勻，加一滴到裝有1ml鞘液的試管中，混勻，標(biāo)記為unlabeled。4.1.1.2取FITC、PE、PerCP、unlabeled試劑，充分混勻，各加一滴到第二支裝有2ml的鞘液的試管中，混勻，標(biāo)記為mixed。4.1.1.3上機(jī)進(jìn)行儀器的校準(zhǔn)。4.1.2或四色試劑的校正（Cat No：340486；Cat No:340487）4.1.2.1取試劑盒中的unlabeled試劑和APC試劑各一滴加入到第一支裝有1ml鞘液的試管中，混勻。4.1.2.2取5種試劑

5、（FITC、PE、PerCP、APC、Unlabeled）各一滴加入第二支裝有2ml鞘液的試管中，混勻。4.1.2.3上級進(jìn)行儀器的校準(zhǔn)。4.2 Calibrite beads FACScomp上機(jī)操作的具體步驟4.2.1執(zhí)行FACSalibur開機(jī)程序；4.2.2執(zhí)行FACScomp軟件；4.2.3在運(yùn)行“Sign in”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，計(jì)算機(jī)將保存這些信息；單機(jī)“Acceppt”；4.2.4進(jìn)入”Set Up窗口，先看最左側(cè)的Assay selection選項(xiàng)，在里面選中Lyse/Wash或Lyse/No Wash；4.2.5在Calibrite Beads

6、 Lot IDS中，根據(jù)每種顏色的beads所對應(yīng)的Lot ids，輸入編號，次編號在Calibrite Beads試劑盒內(nèi)，打開新買的試劑盒，里面有一張橙色膠紙，取出貼在試劑盒的背面，標(biāo)題是Calibrite BeadsTM3Batch NO，選擇FACS Flow Sheath下的編號(右側(cè)的編號)；如做四色校正，同樣方法輸入Calibrite BeadsTM APC的IDS。4.2.6在右側(cè)的保存選項(xiàng)中文件會自動(dòng)保存，路徑FacstationBD fileFACSCompDDMMYY,還可以單擊“Location”改變保存路徑；4.2.7其他的不要改動(dòng)，直接單擊“run”出現(xiàn)PMT視窗，

7、然后準(zhǔn)備好上樣管；4.2.8上第一管后單擊start，儀器開始自動(dòng)調(diào)節(jié)PMT。完成后儀器會在窗口底部出現(xiàn)一行提示：“PMTs set Successfully”，這時(shí)軟件會暫停5秒，然后自動(dòng)進(jìn)入下一個(gè)調(diào)節(jié)窗口(Comp 窗口)；如果是四色微球調(diào)試，儀器還會對激光的延遲進(jìn)行測試，直到儀器電腦屏幕出現(xiàn)提示:“Time Delay Calibration was successful”，然后才會同樣自動(dòng)進(jìn)入下一個(gè)調(diào)節(jié)窗口（Comp窗口）；4.2.9上第二管，單擊start，儀器開始自動(dòng)調(diào)節(jié)補(bǔ)償并進(jìn)行靈敏度測試。完成后儀器會給出提示，最后軟件給出一個(gè)Summary Report。檢查報(bào)告中的“Resu

8、lt”是否都PASS，如果有沒有PASS，堅(jiān)持原因。（1）是否試劑過期（2）兩個(gè)試管中的液體和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）日常維護(hù)是否充分適當(dāng)（5）聯(lián)系BD人員4.2.10打印報(bào)告，退出FACScomp軟件；4.2.11計(jì)算機(jī)會自動(dòng)把FACScomp測試結(jié)果保存在Calib File或Calib File .LNW（免洗試驗(yàn)）中，運(yùn)行其他程序，調(diào)用這些結(jié)果就可以進(jìn)行樣本的檢測。注意事項(xiàng)：1、第一管的速率不能低于400個(gè)/秒（run high），少于時(shí)可以補(bǔ)一滴Unlabeled。 2、兩個(gè)試管中的鞘液必須和鞘液桶中的是同一種液體。5.FACScomp校正HLA-B27的操作說明5

9、.1試劑的準(zhǔn)備：取HLA-B27試劑盒的HLA-B27 calibration beads (Cat No：340183)試劑，混勻，加兩滴到裝有1ml鞘液的試管中，混勻，待測。5.2 FACScomp上機(jī)檢測HLA-B27的具體步驟5.2.1執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序；5.2.2運(yùn)行FACScomp軟件；5.2.3在出現(xiàn)“Sign in”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，計(jì)算機(jī)將保存這些信息；單機(jī)“Accept”；5.2.4進(jìn)入“Set up”窗口，先看最左側(cè)的Assay selection選項(xiàng)，選擇HLA-B27 Assay，在進(jìn)行HLA-B27 Assay之前，必須

10、一次性的通過Lyse/Wash Assay校正；5.2.5在右側(cè)框中輸入正確的HLA-B27 Lot No值、Suffix值和Beads Lot No值。這些參數(shù)分別決定了FL1 PMT的標(biāo)準(zhǔn)和decision maker的位置。對于結(jié)果至關(guān)重要，不可弄錯(cuò)；5.2.6在右側(cè)的保存選項(xiàng)中文件會自動(dòng)保存，路徑FacstationBD fileFACSComp日期，還可以單擊“Location”改變文件保存路徑；其他的不需要改動(dòng)，直接單擊“run”出現(xiàn)PMT視窗，然后準(zhǔn)備好上樣；5.2.7放上Beads管后單擊start，儀器開始自動(dòng)調(diào)節(jié)PMT。完成后儀器會在底部出現(xiàn)一行提示：“PMTs set s

11、uccessfully”這時(shí)軟件會暫停5秒，調(diào)試后的結(jié)果會自動(dòng)保存在Calib File.B27中，并生成summary Report；5.2.8退出FACScomp軟件，然后進(jìn)入HLA-B27軟件進(jìn)行檢測。6.MultiSET四色免洗淋巴細(xì)胞亞群的絕對計(jì)數(shù)6.1實(shí)驗(yàn)原理：用已知總數(shù)的熒光微球Beads做標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，加入血中，再加入熒光抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞儀中的獲取和分析軟件，就可以得出血中CD3、CD4、CD8、B、NK細(xì)胞的絕對數(shù)。細(xì)胞（/ul）=（細(xì)胞獲取數(shù)×Beads總量）/（Beads獲取數(shù)樣本量）6.2主要試劑：6.2.1抗體：CD3/CD8/CD45/CD4；CD3/CD1

12、6+56/CD45/CD19四色熒光抗體。6.2.2Trucount管（內(nèi)含數(shù)量已知的Beads）。6.2.3FACS Lysing Solution（溶血素）（10×,使用前用蒸餾水稀釋成1×）6.3實(shí)驗(yàn)步驟:6.3.1取2支TruCount管,順序編號A和B;6.3.2用反向加樣法在Tube中加入50ul充分混勻的抗凝全血;注意:血不要碰到試管底部的微球(Beads)。6.3.3取20ulCD3/CD8/CD45/CD4抗體加入到A管中；取20ulCD3/CD16+56/CD45/CD19抗體加入到B管中。注意：不要碰到血。渦旋混勻，室溫避光放置15-20min；6.3

13、.4加入450ul 1×FACS溶血素，充分混勻，室溫避光放置15min；6.3.5 24小時(shí)內(nèi)上機(jī)，用MultiSET軟件獲取15000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測，上機(jī)前應(yīng)充分混勻。6.4注意事項(xiàng)：6.4.1樣本使用EDTA抗凝全血，室溫放置，24小時(shí)內(nèi)處理，處理前充分混勻。6.4.2取血時(shí)要采用反向加樣法，即加樣槍吸取血樣時(shí)，打到第二擋，放時(shí)打到第一檔，保證血量的準(zhǔn)確，減少誤差。6.4.3染色和溶血步驟應(yīng)在室溫避光進(jìn)行，并充分混勻，過程中盡量防止血樣的飛濺，以免血樣留在管壁上。6.4.4本實(shí)驗(yàn)為免洗試劑，操作簡單，減少細(xì)胞的丟失提高工作效率和計(jì)數(shù)精確度。6.4.5TruCOUNT管2-25保

14、存，從冰箱取出后，應(yīng)恢復(fù)室溫再打開封條，保證TruCOUNT管包裝袋密閉，袋內(nèi)干燥劑變成粉紅色時(shí)，TruCOUNT管應(yīng)棄去不要7MultiSET軟件收獲分析的具體操作7.1執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序，進(jìn)入MuliTSET軟件。7.2在出現(xiàn)“sign in”窗口中輸入操作者姓名、單位、負(fù)責(zé)人姓名等信息，計(jì)算機(jī)將保存這些信息；相關(guān)信息，單機(jī)“Accept”。7.3進(jìn)入“set up”窗口：7.3.1在“Data Source”對話框中選擇“From Cytometer：Acquisition and Analysis”；7.3.2在“Automatic Saving Options”中選者

15、“Data File”、“l(fā)aboratory Report”、“Physician Report”，軟甲會自動(dòng)生成并保存報(bào)告文件，文件的默認(rèn)路徑FaacstationBD fileMultisetDDYYMM文件夾；7.4在“View Report”中選擇“Until NextButton Pressed”.7.5然后單擊“Accept”，進(jìn)入“FACSComp”窗口，單擊“skip FACSComp”（四色儀器調(diào)整FACSComp在檢測前單獨(dú)完成，見FACSComp操作部分）。7.6進(jìn)入“Test Prefs”窗口，在“Physicians Report Choices”一項(xiàng)可以全選，運(yùn)行

16、一種試劑，會自動(dòng)報(bào)告相應(yīng)的結(jié)果。在“Lot ID”中輸入TruCount管批號和Beads總數(shù)（標(biāo)在包裝袋上），單擊“Accept”。7.7進(jìn)入“Samples”窗口，在表格中輸入相應(yīng)的Patient Name、IDCase Number和在Panel中選擇4color TBNK+Truc；7.8在窗口最上方“Cytometer”的下拉菜單中依次選擇“Detectors/Amps”、“Threshold”、“Compensation”、“Staus”，出現(xiàn)相應(yīng)的四個(gè)窗口；在“Cytometer”的下拉菜單中，單擊“Instrument Setting”，在出現(xiàn)的新對話框中單擊“open”；打開

17、路徑下FacstationBD fileInstrument SettingCalibur.LNW文件，調(diào)用儀器各個(gè)參數(shù)條件，最后單擊“Open”“Set”“Done”。7.9單擊“Run Test”，上樣，此時(shí)調(diào)整SSC電壓和閾值，單擊“Acquire”。7.10獲取完成后，可以打開屏幕底部的“Manual Gate”人工調(diào)整各個(gè)門的大小，單擊“Continue”，進(jìn)入醫(yī)生報(bào)告窗口“Phys Report”，可打印。7.11繼續(xù)其他實(shí)驗(yàn)，或單擊“Quit”,“Dont Save”,退出MultiTest軟件。操作中特別注意第3-7步，尤其是第7步。注意：做相對計(jì)數(shù)時(shí)，用普通的流式管代替Tru

18、Count管，在Panel中選擇4colorTBNK。做三色絕對或相對計(jì)數(shù)時(shí)，只需改變Panel即可。8 CellQuest Pro雙色淋巴細(xì)胞亞群分析樣本制備8.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏褂秒p色組合標(biāo)記抗體對人外周血中淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，了解認(rèn)得免疫狀態(tài)。從而指導(dǎo)臨床診斷和治療。8.2實(shí)驗(yàn)原理：利用熒光技術(shù)，在不同的鼠抗人的抗體上標(biāo)記熒光素，此熒光抗體就同人淋巴細(xì)胞表面是CD分子特異性的結(jié)合；然后用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)合分析軟件的自動(dòng)分析，便可以得出各亞群細(xì)胞的百分比。8.3主要試劑：8.3.1流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)，臺式離心機(jī)，渦旋振蕩器，微量移液器（1000L、200L、20L，流失細(xì)

19、胞專業(yè)試管、鞘液；PBS（加0.1%疊氮鈉）；8.3.2雙色檢測試劑：Isotype Control（MouseIgG1/IgG2a）CD3-FITC/CD19-PECD3-FITC/CD4-PECD3FITC/CD8-PECD3-FITC/CD16+CD56-PE8.3.3 FACS Lysing Solution紅細(xì)胞裂解液（10×,使用前用蒸餾水稀釋成1×）。8.3.4 1%的多聚甲醛，配制方法:稱1.0克多聚甲醛加少量PBS放入56水浴箱中使之溶解，用1N NaOH溶液和1N的HCL調(diào)整PH值在6.9-7.0，然后加入100ml容量瓶中定容，最后用0.45m的濾膜過

20、濾。8.4實(shí)驗(yàn)步驟：8.4.1 取5支流式試管，編號為1、2、3、4、5，分別取10L抗凝全血加入每支試管中，注意不要碰到管壁。8.4.2輕輕混勻，依次加入20L雙標(biāo)Isotype Control（MouseIgG1/IgG2a）、CD3/CD19、CD3/CD4、CD3/CD8、CD3/CD16+CD56熒光抗體。室溫避光保存20分鐘。8.4.3取出試管，每管加入10倍稀釋的1×FACS Lysing Solution 2ml，渦旋混勻，避光10分鐘。300g離心5min，棄去上清液。8.4.4每管加入2ml的PBS，渦旋混勻，300g離心5min，棄去上清液。然后加入0.5mlP

21、BS混勻，4避光1h內(nèi)上機(jī)檢測；若不能及時(shí)上機(jī)，加入0.5ml 1%多聚甲醛，放4冰箱保存，48h內(nèi)上檢測。 9.CELLQuest Pro的簡要操作步驟（1）Acquisition獲取數(shù)據(jù)9.1打開獲取模板（ACQ文件），如無現(xiàn)成的模板則制作新模板：9.1.1選擇點(diǎn)圖或直方圖工具，在窗口拖出大小合適的方框，點(diǎn)擊圖形的邊緣9.1.2Windows-show Inspector，Inspector窗口選擇：9.1.2.1 Plot Type點(diǎn)圖類型：如Acquisition獲取9.1.2.2 X Parameter橫軸參數(shù)：如FSC;Y Parameter縱軸參數(shù)：如SSC9.1.2.3 Gat

22、e設(shè)門：如No Gate或G1=R19.1.3圖形設(shè)置完畢，選擇SAVE AS,保存為ACQ文件9.2聯(lián)機(jī)AcquireConnect to cytometer，出現(xiàn)Acquisition control和Browser窗口，先將Browser窗口最小化；9.3數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：9.3.1 AcquireAcquisitionStorage-設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（10000-ALL）-OK9.3.2打開最小化的-Browser對話框選擇：-Directory：單機(jī)Change設(shè)定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（Prefix）-自定義；文件后綴（Suefix）-管號（設(shè)為

23、1），單機(jī)ok；-檢測或設(shè)置panel，確定試驗(yàn)組合；如果沒有相應(yīng)的panel則設(shè)置新的panel：AcquireEdit panel，在彈出的對話框單擊add選項(xiàng)，在new panel中輸入新的panel名稱，然后單擊前面的三角選中該panel激活Tubes窗口，單擊add加試驗(yàn)管，編輯各試驗(yàn)管的P1，P2，P3，P4確定實(shí)驗(yàn)組合，單擊ok；然后按照已有panel操作；已有panel的在Untitled Acquire Tube List下來菜單中選擇Load Tubes From Panel選擇新編輯或?qū)嶒?yàn)對應(yīng)的panel9.3.3 AcquireCounter打開計(jì)算器。9.4打開獲取條

24、件窗口，調(diào)出實(shí)驗(yàn)獲取條件（Instrument Setting）9.4.1 Cytometer-Detectors/Voltage，Threshold，Compensation9.4.2 Cytometer-Instrument Setting-Open打開實(shí)驗(yàn)獲取條件（FACSStation-BD File- Instrument Setting Files-Calib file或者Calib file.LNW）Open-set-done9.4.3實(shí)驗(yàn)獲取條件的調(diào)整：Acquisition Control-Setup-上樣（第一管）-Acquire-進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲取條件的調(diào)整：FSC、SSC電壓

25、。FSC閾值（Threshold）：減少碎片。設(shè)門：FSC/SSC點(diǎn)圖設(shè)門（R1）；熒光（FL）點(diǎn)圖（如FL1/FL2）或直方圖（如FL1）取門G1=R1(點(diǎn)擊圖形的邊緣-Inspector-Gate：G1=R1)。陰性對照管，調(diào)整熒光電壓（FL1、FL2、FL3、FL4Voltage），使陰性群體在左下角，確定十字位置。換地2管，多色實(shí)驗(yàn)的補(bǔ)償管（單陽性），調(diào)整熒光間補(bǔ)償（Compensation）：（1）Cytometer-Instrument Setting-Save保存實(shí)驗(yàn)獲取條件（InstrSet+實(shí)驗(yàn)獲取名稱） -Done（此步驟為可選項(xiàng)）；File-Save保存模板ACQ文件（新

26、作模板）。（2）Acquisition-Counter，打開計(jì)數(shù)器。9.5順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control-Setup-上樣-Acquire-儀器獲取足夠細(xì)胞后，自動(dòng)保存數(shù)據(jù)文件（data file），Quit-Dont save10.CELLQuest Pro的簡要操作步驟（2）10.1Analysis數(shù)據(jù)分析（新作模板ANA文件）10.1.1做FSC/SSC點(diǎn)圖，圈細(xì)胞R110.1.1.1選擇點(diǎn)圖工具，在窗口拖出大小合適的方框，點(diǎn)擊圖形邊緣10.1.1.2 Windows-show Inspector，Inspector窗口選擇：Analysis分析；Sele

27、ct File選擇第一管數(shù)據(jù)文件；X Parameter橫軸參數(shù)-FSC;Y Parameter縱軸參數(shù)-SSC；Gate設(shè)門-No Gate10.1.1.3選擇設(shè)門工具-在FSC-SSC點(diǎn)圖上，圈細(xì)胞R110.1.2做陰性對照管門內(nèi)細(xì)胞的FL1/FL2點(diǎn)圖，設(shè)十字，區(qū)分陰性和陽性界限10.1.2.1選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方框，點(diǎn)擊圖形邊緣10.1.2.2 Windows-show Inspector，Inspector窗口選擇：Analysis分析；Select File選擇陰性對照管數(shù)據(jù)文件；X Parameter橫軸參數(shù)-FL1;Y Parameter縱軸參數(shù)-FL2；Gate設(shè)

28、門-G1=R110.1.2.3選擇十字工具-在陰性對照管FL1/FL2點(diǎn)圖上，沿陰性群體設(shè)十字10.1.3 做各實(shí)驗(yàn)管門內(nèi)細(xì)胞的FL1/FL2點(diǎn)圖，拷貝陰性對照管的十字10.1.3.1選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方框，點(diǎn)擊圖形邊緣10.1.3.2 Windows-show Inspector，Inspector窗口選擇：Analysis分析；Select File選擇實(shí)驗(yàn)管數(shù)據(jù)文件；X Parameter橫軸參數(shù)-FL1;Y Parameter縱軸參數(shù)-FL2；Gate設(shè)門-G1=R110.1.3.3店中陰性對照管FL1/FL2點(diǎn)圖上的十字=Edit-Copy-點(diǎn)中試驗(yàn)管FL1/FL2點(diǎn)圖-

29、Edit-Paste10.1.4做各實(shí)驗(yàn)管FL1/FL2點(diǎn)圖的十字統(tǒng)計(jì)：點(diǎn)中試實(shí)驗(yàn)管FL1/FL2點(diǎn)圖-Stat-Quadrant Stat-出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果-點(diǎn)中統(tǒng)計(jì)結(jié)果框-Stat-Edit Quadrant Stat-選擇輸出結(jié)果（如Percent of gated門內(nèi)細(xì)胞陽性百分率）。10.1.5選擇文字工具（A），在報(bào)告上添加文字說明，報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。10.1.6 Save As保存分析模板（ANA文件）或分析結(jié)果，Print打印分析結(jié)果。10.2 Analysis數(shù)據(jù)分析（已有模板ANA文件）打開已保存的分析模板（ANA文件），依次改變各圖要分析的數(shù)據(jù)文件（Edit-Select All

30、-Plots-Change Data File），在出現(xiàn)的窗口中按文件存儲路徑找到數(shù)據(jù)，選中第一關(guān)文件-open；在空白處單擊一下鼠標(biāo)，選中第三個(gè)圖標(biāo)按蘋果調(diào)出第二管文件；第四個(gè)圖蘋果+ 以此類推，調(diào)整圈細(xì)胞群的門R1的位置，調(diào)整十字門位置，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果更改報(bào)告中結(jié)果，打印分析結(jié)果。11.HLA-B27分析和軟件操作11.1樣本的制備：11.1.1試劑：11.1.1.1HLA-B27試劑盒-包括抗體試劑A,10×溶血素試劑B，微球試劑C11.1.1.2抗凝全血11.1.1.3流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)常規(guī)試劑和儀器。11.1.2制備流程：11.1.2.1在試管上對應(yīng)于每一個(gè)樣本做好識別標(biāo)志（每個(gè)樣

31、本一個(gè)試管）11.1.2.2加30L抗體到試管中11.1.2.3用微量移液器小心滴將50l充分混勻的康寧血加到進(jìn)樣管的底部，確保WBC的濃度在3.5×103-9.4×103WBC/L之間，低速混勻3秒鐘，室溫避光靜置15-20分鐘； 注意：小心避免血樣加到試管壁上，一面血與試劑不能充分接觸，靜置時(shí)避免樣本直接光照。11.1.2.4將10×溶血素用蒸餾水稀釋成1×，每管中加入2ml試問的1×溶血素，立即低速混勻，避光試問靜置10分鐘，不要超過12分鐘； 注意：溶血時(shí)間不應(yīng)太長，以免破壞白細(xì)胞。11.1.2.5隨后室溫300g離心5min11.1.

32、2.6棄去上清液，留大約50L液體于試管中以免損傷細(xì)胞團(tuán)11.1.2.7低速混勻，重懸細(xì)胞，每管中加入2ml含0.1%疊氮鈉的PBS清洗細(xì)胞，低速混勻，室溫300g離心5min11.1.2.8吸去上清液，留大約50L液體于試管中以免損傷細(xì)胞團(tuán)11.1.2.9低速混勻，重懸細(xì)胞，每管中加入含1%-2%多聚甲醛的PBS來固定細(xì)胞，低速混勻，固定30分鐘11.1.2.10將已處理好的樣本管蓋好，避光保存于2-8以待上機(jī)檢測。最好在染色后24小時(shí)以內(nèi)分析樣本，上樣前充分混勻懸液以防細(xì)胞聚集。11.2 HLA-B27自動(dòng)軟件上機(jī)檢測的具體步驟11.2.1執(zhí)行FACSCalibur開機(jī)程序，進(jìn)入HLA-B

33、27軟件。11.2.2在出現(xiàn)的“sign in”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，單擊“Accept”，計(jì)算機(jī)將保存這些信息。11.2.3進(jìn)入“set up”窗口，首先在“Data Source”對話框中選擇“From Cytometer”，并輸入“15000”。然后在：A)“File name perfix”中選擇“Patient name”；B)在“Automatic Saving Options”中選擇好“Data File”、“Laboratory Report”，軟件會自動(dòng)生成一個(gè)文件夾，文件的默認(rèn)路徑Facstation G5BD filesHLA-B27DDMMYY

34、文件夾；C)單擊“Location”可改變文件保存路徑；在出現(xiàn)的新的對話框中指定的文件夾，選好文件夾后，單擊對話框底部的“chose”（此步驟為可選項(xiàng)）。D)在“View Report”中選擇“UntilNextButton Pressed”；最后單擊“Accept”。11.2.4進(jìn)入“FACSComp”窗口，在這里可以進(jìn)入FACSComp軟件，做HLA-B27 beads的調(diào)試。如果之前做了就單擊“Skip FACSComp”。11.2.5進(jìn)入“Patients”窗口，在表格中輸入相應(yīng)的Patient Name、ID、Case Number。11.2.6然后單擊“Run”，單擊“Acquir

35、e”。不要調(diào)節(jié)儀器的設(shè)置，儀器會自動(dòng)調(diào)出條件。獲取完成后打印Laboratory Report。11.2.7如果要繼續(xù)檢測單擊“More Tests”，如果退出單擊“QUIT”-“Dont save”。11.2.8退出軟件，按每日關(guān)機(jī)程序清洗儀器，關(guān)機(jī)。11.3或用Cellquest Pro/Cellquest手動(dòng)軟件進(jìn)行HLA-B27獲取和分析11.3.1打開獲取模板(HLA-B27 ACQ文件)；或制作新模板：11.3.1.1選擇點(diǎn)圖或直方圖工具，總共畫三個(gè)圖，兩個(gè)散點(diǎn)圖，一個(gè)直方圖。11.3.1.2散點(diǎn)圖FSC/SSC，畫出一個(gè)新的散點(diǎn)圖后，在Windows-show Inspector

36、，Inspector窗口選擇：Acquisition-Analysis分析； X Parameter橫軸參數(shù)：FSC；Y Parameter縱軸參數(shù)：SSC；選擇Multicolor gate屬性，Gate設(shè)門：如No Gate；11.3.1.3散點(diǎn)圖FSC/CD3 PE，畫出一個(gè)新的散點(diǎn)圖后，在Windows-show Inspector，Inspector窗口選擇：Acquisition-Analysis分析； X Parameter橫軸參數(shù)：FSC；Y Parameter縱軸參數(shù)：CD3 PE；在圖中畫門R1圈上CD3+陽性的細(xì)胞；11.3.1.4直方圖HLA-B27 FITC/Coun

37、ts，畫出一個(gè)新的直方圖后，在Windows-show Inspector，Inspector窗口選擇：Acquisition-Analysis分析； X Parameter橫軸參數(shù)：FITC,選擇門G1=R1選擇Maker工具，在直方圖中畫M1，圈定所有細(xì)胞，選中這個(gè)直方圖，對直方圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)-His-Stats，統(tǒng)計(jì)框中選擇File Name、Maker label、%Gate、Mean和Median；并且改Plot菜單下的Log dataUnit屬性為Chanel，Acquire菜單下AcquisitionStorage中的Resolution屬性為256。11.3.1.5設(shè)計(jì)試劑參數(shù)，在

38、Acquire菜單中選擇Paarameter Description，在對話框中設(shè)定：P1=FSC，P2=SSC，PS=HLA-B27 FITC，P4=CD3 PE。11.3.1.6圖形設(shè)置完畢，選擇SAVE AS，保存為HLA-B27 ACQ文件模板。11.3.2聯(lián)機(jī)Acquire-Connect to cytometer，出現(xiàn)Acquisition Control窗口；11.3.3數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：11.3.3.1 Acquire-AccquisitionStorage-設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（10000-ALL）-OK11.3.3.2 Windows-Browser對話框選擇： -Directo

39、ry設(shè)定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾； -File設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（Prefix）-自定義；文件后綴（Surfix）-管號；11.3.4打開獲取條件窗口，調(diào)出實(shí)驗(yàn)獲取條件（Instrument Setting）；11.3.4.1 Cytometer-Detectors/Voltage，Threshold。11.3.4.2 Cytometer-Instrument Setting-open，在Facstation G5BD fileInstrument Setting下找到并選擇Calibur file.B27文件，Open-Set-Down.11.3.5樣本優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件：Acquisiti

40、on Control Setup-上樣-Acquire-進(jìn)行實(shí)驗(yàn)獲取條件的調(diào)整（不能調(diào)節(jié)各熒光電壓和補(bǔ)償）： -調(diào)整FSC、SSC電壓使細(xì)胞完全顯示在FSC/SSC圖上; -調(diào)整FSC閾值（Threshold）：減少碎片； -調(diào)整FSC/CD3 PE中的R1,圈定需要分析的細(xì)胞（CD3+）; -調(diào)整HLA-B27/Counts中的M1，圈定所有細(xì)胞。（M1可以畫的大一些） -可以保存經(jīng)樣本優(yōu)化過的實(shí)驗(yàn)條件：Cytometer-Instrument Setting-Save保存實(shí)驗(yàn)獲取條件（InstrSet B27）-Done。11.3.6順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Cont

41、rol-Setup-上樣-Acquire-儀器獲取足夠細(xì)胞后，自動(dòng)保存數(shù)據(jù)文件（data file）。11.3.7調(diào)節(jié)FSC/CD3 PE中R1的位置準(zhǔn)確地圈定好需要分析的細(xì)胞；并同時(shí)調(diào)節(jié)HLA-B27/Counts中的M1，把所有細(xì)胞出現(xiàn)的峰全部圈?。籋is-Stats統(tǒng)計(jì)表中統(tǒng)計(jì)出B27的平均熒光，得出分析結(jié)果。11.3.8輸入相關(guān)信息，保存并打印統(tǒng)計(jì)結(jié)果，退出程序。12.DNA測定12.1材料和試劑12.1.1抗凝外周血；12.1.2DNA QC Particle，DNA測定質(zhì)量控制試劑盒（BD公司，349523）CEN:小雞紅細(xì)胞核，CTN：小牛胸腺細(xì)胞核，2m的熒光微球，核酸染料PI

42、。12.1.3 CycleTEST PLUS DNA ReagentKit 試劑A，試劑B，試劑C，緩沖液12.2樣本制備12.2.1質(zhì)控樣本的制備（DNA QC Particle） CEN:輕輕搖勻后，吸取40L到1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘，即可上機(jī)。 CTN：大力震蕩試劑瓶，吸取40L到1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘即可上機(jī)檢測。12.2.2外周血DNA樣本的制備（Cycle TEST PLUS DNA Reagent Kit）12.2.2.1將100L抗凝外周血全 加入17 100-mm的管中12.2.2.2加入1 的溶血素2ml，混勻，室溫放置10分鐘12.2.

43、2.3室溫300 g離心5分鐘，吸去上清液12.2.2.4加入2mlPBS洗滌細(xì)胞1次，室溫300 g離心5分鐘，吸取上清液12.2.2.5加入250L A液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘12.2.2.6加入250L B液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘12.2.2.7加入250L C液，輕輕混勻，不要震蕩，低溫（28）避光靜置10分鐘12.2.2.8用50m尼龍網(wǎng)膜或35m細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞12.2.2.9低溫避光放置以待上機(jī)檢測。建議在加入C液后3小時(shí)內(nèi)上機(jī)，上機(jī)前輕輕混勻細(xì)胞懸液。12.3.Acquisition：用CellQuest/CellQuest Pro軟件獲取數(shù)據(jù)

44、12.3.1打開獲取模板（ACQ文件）或制作新模板：圖1：選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點(diǎn)圖對話框或Inspector中，選擇：Acquisition獲??；X Parameter橫軸參數(shù)：FSC；Y Parameter縱軸參數(shù)：SSC；OK-出現(xiàn)相應(yīng)的點(diǎn)圖。圖2：選擇點(diǎn)圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點(diǎn)圖對話框或Inspector中，選擇：Acquisition獲??；X Parameter橫軸參數(shù)：FL2-W；Y Parameter縱軸參數(shù)：FL2-A；OK-出現(xiàn)相應(yīng)的點(diǎn)圖。圖3：選擇直方圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的直方圖對話框或Inspector中，選擇：Acq

45、uisition獲?。籜 Parameter橫軸參數(shù)：FL2-A；OK-出現(xiàn)相應(yīng)的直方圖。在本圖橫軸200和400的位置分別設(shè)M門，標(biāo)為M1和M2；對此圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（Stats-Histogram Stats），對M1和M2進(jìn)行統(tǒng)計(jì):File name,Marker,%Gate,Mean,CV。三個(gè)圖形都設(shè)置完畢，F(xiàn)ile中選擇SAVE AS,保存模板ACQ文件。12.3.2聯(lián)機(jī)Acquire-Connect to cytometer，出現(xiàn)Acquisition Control窗口，出現(xiàn)Acquisition Control和Browser窗口，先將Browser窗口最小化；12.3.3數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：Acquire-AccquisitionStorage-設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（20000）-OK；Acquire-Parameter Discription對話框（Browser窗口最大化）選擇：-Directory：單擊Change設(shè)定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾； -File：設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（Prefix）-自定義；文件后綴（Surfix）-管號（設(shè)為1），單擊OK；12.3.4打