DNA甲基化檢測技術(shù)

1、 DNA甲基化檢測之甲基化檢測之甲基化特異性甲基化特異性HRM檢測技術(shù)檢測技術(shù)（ Methylation-sensitive high resolution melting）內(nèi)容提示內(nèi)容提示 DNA甲基化的定義及生物學(xué)意義 MS-HRM檢測的原理 MS-HRM檢測的方法及步驟 MS-HRM檢測結(jié)果分析DNADNA甲基化的定義甲基化的定義在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾現(xiàn)象。DNADNA甲基化的形式：甲基化的形式：DNA甲基化主要形成5-mC和少量的N6-甲基嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG） CpG CpG 島（島（CpG Isl

2、andCpG Island） 在基因組的某些區(qū)域中，通常是基因的啟動子區(qū)域，5端非翻譯區(qū)和第一個(gè)外顯子區(qū)，CpG序列密度非常高，超過均值5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，稱之為CpG島(CpG Islands, CGIs)。u 正常結(jié)構(gòu)基因組中70% 90% 的獨(dú)立CpG 都被甲基化, 未甲基化的CpG 成簇地聚集形成CpG 島u 主要位于結(jié)構(gòu)基因的啟動子和第一外顯子區(qū)域，約有60以上基因的啟動子含有CpG島。 u 是結(jié)構(gòu)基因啟動子的核心序列和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) CpG island的功能：通過甲基化與去甲基化，調(diào)控下游基因的表達(dá) 基因表達(dá)的調(diào)控開關(guān)DNA甲基化的生物學(xué)意義甲基化的生物學(xué)意義l 1

3、、轉(zhuǎn)錄抑制 基因啟動子區(qū)的甲基化可影響轉(zhuǎn)錄激活因子和其識別序列 的結(jié)合.DNA甲基化的生物學(xué)意義甲基化的生物學(xué)意義l 2、影響基因表達(dá) 直接抑制基因表達(dá) 或甲基化的 CpG雙核苷酸序列可被甲基結(jié)合蛋 白家族 識別,而后者可通過吸引補(bǔ)充組蛋白去乙酞化酶 和組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶 等組蛋 白修飾蛋白質(zhì)來改變?nèi)旧|(zhì)的活性 ,以間接方式影響基因表達(dá).l 3、損傷與修復(fù) 一方面參與凋亡和修復(fù)的基因受DNA 甲基化調(diào)控,另一方面異常甲基化往往會導(dǎo)致DNA 的多種損傷。此外 ,甲基化還可能直接參與DNA損傷的識別和修復(fù)過程.l 4、其他 ： 甲基化還參與DNA 的復(fù)制和包裝及 DNA片段的轉(zhuǎn)座等?；蚪M甲基化的

4、特點(diǎn)：基因組甲基化的特點(diǎn)：u可逆性許多甲基化位點(diǎn)可以根據(jù)細(xì)胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；u組織特異性不同的組織細(xì)胞具有不同的甲基化模式，為基因表達(dá)設(shè)定程序。u異常的甲基化可分為高甲基化和低甲基化 ，前者指正常組織中不發(fā)生甲基化的位點(diǎn)被甲基化 ，后者是指在正常組織中發(fā)生甲基化的位點(diǎn)去甲基化。DNADNA甲基化與腫瘤的關(guān)系甲基化與腫瘤的關(guān)系 腫瘤細(xì)胞的特征：n癌基因低甲基化 被激活；n抑癌基因高甲基化 被沉默 甲基化水平與腫瘤生物學(xué)特性密切相關(guān)，DNA甲基化水平越低，染色體越容易發(fā)生功能異常，腫瘤的浸潤能力就越高，臨床分期也愈晚常見易被甲基化的抑癌基因與修復(fù)基因及其作用常見易被甲基化的抑癌基因

5、與修復(fù)基因及其作用 基因基因基因沉默對腫瘤的意義基因沉默對腫瘤的意義腫瘤類型腫瘤類型APC對細(xì)胞增殖、遷移、粘附、骨架重組及染色質(zhì)穩(wěn)定性失去調(diào)節(jié)作用乳腺癌、肺癌、食管癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰、 肝癌BRCA1與DNA 修復(fù)與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)乳腺癌、卵巢癌 CDKN2A/p16周期素依賴性蛋白激酶抑制劑GIT 、頭與頸部瘤、NHL、肺癌 DAPK1鈣/鈣調(diào)素-依賴的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制肺癌E-cadherin增強(qiáng)增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移乳腺癌 、甲狀腺癌、胃癌ER激素抵抗乳腺癌、前列腺癌GSTP1失去對致癌物活性代謝產(chǎn)物的解毒作用前列腺癌、乳腺癌、腎癌hMLH1缺損DNA錯(cuò)配修復(fù),基因點(diǎn)突變結(jié)腸癌

6、、胃癌、子宮內(nèi)膜瘤、卵巢癌MGMTp53-相關(guān)基因，與DNA 修復(fù)及耐藥性有關(guān)肺癌、腦瘤P15細(xì)胞的過度激活與增殖非白血性白血病、淋巴瘤、鱗狀細(xì)胞癌、肺癌 RASSF1A失去了對G1/S負(fù)調(diào)控抑制作用肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、鼻咽癌Rb不能抑制DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂必需的基因轉(zhuǎn)錄成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)(細(xì)胞)瘤VHL錯(cuò)誤的降解RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，改變RNA穩(wěn)定性腎細(xì)胞癌縮寫: APC, adenomatous polyposis coli; BRCA1, breast cancer 1; CDKN2A/p16, cyclin-dependent kinase 2A; DAPK1, deat

7、h-associated protein kinase 1; ER, estrogen receptor; GSTP1, glutathione S-transferase Pi 1; hMLH1, Mut L homologue 1; MGMT, O-6 methylguanine-DNA methyltransferase; RASSF1A, Ras association domain family member 1; Rb, retinoblastoma; VHL, von Hippel-Lindau; GIT, gastrointestinal tract; NHL, non-Hod

8、gkins lymphoma.DNADNA甲基化與腫瘤的關(guān)系甲基化與腫瘤的關(guān)系 MGMT基因在許多腫瘤中被認(rèn)為是抗腫瘤藥物治療的預(yù)測標(biāo)記。MGMT啟動子腫瘤特異性甲基化，可以抑制MGMT蛋白的活性，從而使得腫瘤細(xì)胞對烷化類的抗腫瘤藥物敏感，因而被廣泛用于腫瘤化療治療。 Figure： KaplanMeier Estimates of Overall Survival, According toMGMTPromoter Methylation Status.DNA DNA 甲基化的檢測方法甲基化的檢測方法DNA DNA 甲基化的檢測方法甲基化的檢測方法MS-HRMMS-HRM檢測技術(shù)檢測技術(shù) 目

9、前，甲基化檢測的方法很多，例如甲基化特異性PCR，Northern印跡法、Western印跡法、免疫細(xì)胞化學(xué)等，這些檢測方法由于需要花費(fèi)大量時(shí)間，成本高等等，在臨床推廣應(yīng)用時(shí)均存在一定的困難。最新報(bào)道了一種基于熔解曲線的高分辨率熔解（High Resolution Melt，HRM）的新方法，為甲基化的檢測帶來了新的曙光。用HRM方法檢測MGMT啟動子區(qū)域內(nèi)的甲基化狀態(tài)，可檢測低達(dá)0.1%的甲基化程度；并且可以根據(jù)已知甲基化程度的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品的甲基化百分比進(jìn)行測定。MS-HRMMS-HRM檢測技術(shù)原理檢測技術(shù)原理 采用重亞硫酸鹽處理DNA模板后，在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對針對經(jīng)亞硫酸氫鈉處

10、理后DNA鏈的引物，這對引物中間包含有意義的甲基化CpG島，一旦這些CpG島發(fā)生甲基化，胞嘧啶不發(fā)生變化，而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，樣品中的GC含量發(fā)生了變化，最終被轉(zhuǎn)化成了熔解曲線Tm值之間的差異。CpG位點(diǎn)在小的擴(kuò)增片段內(nèi)的相對位置也會對熔解峰的形狀產(chǎn)生影響，因此，根據(jù)Tm值和熔解峰的形狀可以檢測出樣本的甲基化位點(diǎn)和甲基化程度MS-HRMMS-HRM檢測方法及步驟檢測方法及步驟引物設(shè)計(jì)：引物需包含個(gè)CpG二核苷酸序列；CpG二核苷酸序列應(yīng)盡量靠近引物的端；引物的Tm值應(yīng)盡量接近，最好控制在內(nèi)；引物的端應(yīng)包含有個(gè)或多個(gè)T堿基，從而確保只有經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾的DNA模板得到擴(kuò)增；引物不

11、能有二聚體存在；擴(kuò)增子的長度盡量控制在100bp左右 MS-HRMMS-HRM檢測方法及步驟檢測方法及步驟引物設(shè)計(jì)： MS-HRMMS-HRM檢測方法及步驟檢測方法及步驟2. DNA樣本的準(zhǔn)備： 可使用新鮮組織或石蠟組織樣本，一般不使用血液樣本；3. 儀器選擇（一般可進(jìn)行HRM分析的儀器均可）：如LightCycler480 (Roche), RotorGene6000 (CorbettResearch), Applied Biosystems 7500 FAST real-time PCR system(Applied Biosystems), LightScanner System and

12、 the HR-1 instrument(Idaho Technologies). MS-HRMMS-HRM檢測方法及步驟檢測方法及步驟4. DNA樣本的甲基化修飾： 可使用FFPE Tissue Kit (QIAGEN) 對DNA甲基化修飾及回收；3. PCR擴(kuò)增：上樣體系PCR-HRM反應(yīng)程序 MS-HRMMS-HRM檢測方法及步驟檢測方法及步驟a. 上樣體系：反應(yīng)體系組分(20L)加入的體積（L）10PCR Buffer(15 mM mgcl2)2MgCl2 (25 mM)0.4dNTP（10 mM）0.520 Eva-green飽和染料1.010m Primers0.5+0.5Temp

13、late（5ng/L）1.0Taq酶(5U/L)0.2ddH2O14.3MS-HRMMS-HRM檢測方法及步驟檢測方法及步驟b. PCR-HRM反應(yīng)程序：過程溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)cycles預(yù)變性955min1PCR9510s506015s7225s(收集熒光)HRM951min1401min651s95每秒檢測熒光25次冷卻4010s1MS-HRMMS-HRM檢測結(jié)果分析檢測結(jié)果分析MGMT甲基化檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖MS-HRMMS-HRM檢測結(jié)果分析檢測結(jié)果分析MS-HRMMS-HRM檢測結(jié)果分析檢測結(jié)果分析Figure 1 | The effect of the PCR annealing tem

14、perature on the sensitivity of the ATM MS-HRM assay. Thedilutions of methylated and unmethylated templates are indicated as follows: 100% methylated-red, 10%methylated-blue, 1% methylated-green and 0.1% methylated-brown and unmethylated-black. MS-HRMMS-HRM檢測結(jié)果分析檢測結(jié)果分析Figure 4. The MS-HRM assay for BNIP3 methylation. Results of the