HPLC(液相色譜)常識及疑難詳解(附實際操作圖解)

1、1 液相色譜基礎知識1.1 液相色譜名詞術語Mobile phase：流動相，在色譜柱中存在著相對運動的兩相，一相為固定相，一相為流動相。流動相是指在色譜過程中載帶樣品（組分）向前移動的那一相。Stationary phase：固定相，柱色譜或平板色譜中既起分離作用又不移動的那一相。Gradient elution: 梯度洗脫,一個分析周期中，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比, 使一個復雜樣品中的性質差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。Detection wavelength：檢測波長，retention time：保留時間，被分離樣品組分從進樣開始到柱后出現該組分濃度

2、極大值時的時間Peak:峰Peak Base：峰基線，經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸Peak Height：峰高，色譜峰頂點至峰底的距離。Peak Width：峰寬，色譜峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點間的距離Peak Width at Half Height：半峰高寬Peak Area：峰面積Tailing Peak: 后沿較前沿平緩的不對稱峰Leading Peak:前沿較后沿平緩的不對稱峰Ghost Peak: 假峰，并非由試樣所產生的峰Baseline Drift:基線漂移Baseline Noise:基線噪音Band Broad

3、ening:組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現象.1.2 流動相1.2.1 流動相類型正相液相色譜流動相：一般正相色譜固定相極性大于流動相極性，采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等），極性小的組分先出柱。 反相液相色譜流動相：一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合

4、物，極性大的組分先出柱（現在大部分液相用的是反相色譜法）。1.2.2 流動相注意事項1.2.2.1 pH值的選擇C18和C8使用的流動相pH值通常為2.57.5（28），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。1.2.2.2 濾膜的使用對于鹽類等試劑，或者沒有色譜純的試劑，可以使用分析純的，但是在使用前需要用0.45um或0.22um的濾膜過濾。鹽類試劑最好現配現用。使用濾膜時應注意：有機膜能濾水系，水系膜不能濾有機。如果流動相是有機溶劑的比例，那么就應該用有機膜過濾（但是如果是梯度進流動相的話，鹽溶液可先單獨用水膜過濾）水膜：纖維素微孔濾膜，易溶于丙酮等中等極性有機溶劑，不

5、易燃燒，可用于空氣測定之用，亦可用于乙醇或水液體過濾。纖維素膜:a) 醋酸纖維素膜：可過濾低分子量的醇類、水溶液、酒類、油類。b) 硝酸纖維素膜：適用于水溶液、空氣、油類、酒類過濾。不耐酸堿，溶于有機溶劑。可進行熱壓滅菌。c) 醋酸纖維與硝酸纖維素混合酯膜：性質類硝酸纖維素膜。但可適用于PH值310范圍，1020的乙醇，50的甘油，3050的丙二醇等，而2聚山梨酯80對膜有顯著影響。微孔濾膜使用前，應進行清洗處理，用蒸餾水浸泡洗凈后裝于濾器內，有機溶劑的過濾則用乙醇浸泡清洗。色譜樣品或試劑的過濾，若是水系的，蒸餾水洗凈浸泡后，再蒸餾水預過濾，若有機系過濾，最好先將本品在純甲苯和95%以上的乙醇

6、中分別浸泡過夜，再純甲苯和純乙醇預過濾，徹底洗凈膜后使用。 微孔濾膜正反：a) 各向同性，不分正反面，對額定孔徑以上固體微粒能起到絕對截留的作用。b) 有正反面，亮光強的為反面，亮光弱的為正面，膜內孔徑從正面到反面逐漸遞減。使用時應將正面對著待濾液，即待濾液從亮光弱的一面流入，濾凈液從亮光強的一面流出，欲截留微粒相當于經歷了孔徑從大到小多層濾膜的阻截而不易堵塞，可顯著延長使用壽命。使用時應在膜處理前認好正反面，（光線從側面照膜可以比較出），作上記號，入水后正面將難以分辨。有機膜尼龍（聚酰胺）微孔濾膜材料為脂肪族尼龍，有良好的親水性，耐適當濃度的酸堿，不僅適用于含有酸堿性的水溶液，亦適用于含有機

7、溶劑，例醇類、烴類、醚類、酯類、酮類，苯和苯的同系物，二甲基甲酰胺，二甲基亞砜等等，是適用范圍最廣的微濾膜之一。有機膜入水后顯著變脆，入有機溶劑強度的減少則輕些。有機能濾水系，水系不能濾有機。1.2.2.3 有機相的選擇使用反相色譜柱可以有三種有機溶劑可以選擇，甲醇、乙腈和四氫呋喃。每一種溶劑都有其獨特的優(yōu)點，需根據具體情況選擇。有些樣品的紫外吸收很弱，所以分析時紫外檢測器的波長為220nm甚至更低，但是四氫呋喃的紫外吸收比較強，所以在波長低于240nm時，就不能選擇這種溶劑。盡管低濃度的甲醇在較低的波長下也可使用，但是在低于220nm時，甲醇的濃度不易控制。選擇何種溶劑還必須考慮其與樣品及空

8、氣之間不發(fā)生作用，而四氫呋喃易分解，形成過氧化物，所以使用這種溶劑時須格外小心。一些研究人員發(fā)現，在四氫呋喃中加入水可以解決這個問題，但它與色譜柱平衡所需的時間比甲醇、乙腈長，而且其不愉快的氣味也是一個不利因素。與四氫呋喃相比，甲醇和乙腈的最大優(yōu)點是在柱壓較低的條件下，流速可控制在1-2ml/min之間?？紤]到理想溶劑的特點，如粘度低、紫外吸收弱、與樣品不相互作用，而且使用方便，所以首選的有機溶劑應是乙腈，當然利用甲醇作為有機溶劑的也較為常見。1.2.2.4 水相的選擇 樣品為一般化合物，可以用水作為水相，然而離子化合物在藥物分析時普遍存在，而這類化合物需要控制PH值才能得到很好的分離。如流動

9、相的PH值必須高于或低于樣品的PKA1.5個單位。在分析有機酸時，當PH值低于3時，色譜柱一般還比較穩(wěn)定，然而當PH值高于8時，就需要緩沖液，因為此PH值已經超出了二氧化硅的有效使用范圍。寬PH值的二氧化硅柱也比較常見，但是對高PH值物質的分離，很少有這方面的報道。所以建議使用緩沖液來減少二氧化硅的流失?？紤]到樣品的特性及柱子的穩(wěn)定，建議在分析PH值較高的物質時應使用緩沖液，2.5mM的磷酸鹽緩沖液 (PH=2.5)是非常合適的水相。如果在分析方法中使用了分光儀，那么就必須選易揮發(fā)的緩沖液，盡管不如真正的緩沖液有用，但0.1% Trifluoroacetic酸和乙酸能夠滿足PH值的控制要求。1

10、.3 色譜柱現在大部分液相色譜分析都是使用反相液相色譜柱，其中以C18 和C8柱最為流行。這兩種色譜柱之所以運用廣泛是因為在大多數情況下，使用這兩種柱子都能獲得理想的分離效果。盡管一些樣品的分離并不是這兩種柱子，但 C18和C8經常是最好的固定相，C18和C8柱兩者之間并無明顯的差別，但在我們實驗室中以常使用的是C18柱。1.3.1 柱子尺寸規(guī)格的選擇液相色譜分析時柱子選擇的另一個因素就是柱子大小、及填充顆粒的直徑(dp)的選擇。最常用顆粒直徑為5m，但顆粒的直徑(dp)為3.0及3.5m的也適合分析使用，但大多數色譜工作者都喜歡使用顆粒直徑為5m的色譜柱，因為這種色譜柱具有很長的使用歷吏。顆

11、粒的dp小意味著可以獲得較高的理論塔板數，但所需的柱壓增大，而且dp為3.0m的色譜柱易堵塞，所以一些色譜制造商又生產出dp為3.5m的色譜柱。 我們實驗室使用的是4.6mm*250mm,dp為5m，伊利特hypeisil ODS2的色譜柱，硅膠基質上鍵合了C18為官能團的色譜柱填料，是典型的高效液相色譜柱用填料，適合于分析非極性和中性樣品，包括酸性、中性及親脂性化合物。1.4 其他因素選擇液相色譜的分析方法時，必須考慮到其它的一些因素，比如溫度。因為溫度變化1度，保留時間將變化1-3%，所以溫度控制十分重要，溫度的變化還影響色譜柱的選擇性。在分析時柱溫一般比室溫高一點(如35)，因為此溫易控

12、制，而且在低壓下有利于降低溶劑的粘度，從而降低柱壓。2 實際操作這里簡單介紹一下重點實驗室島津LC20-AT液相色譜儀及其相關操作2.1 溶劑準備：色譜純級別a) 過濾0.45m濾膜（纖維素膜水溶液， 尼龍、PTFE通用型）。b) 脫氣超聲5-10min，排除O2，N2等。保證流量準確，提高色譜圖重現性，增加信噪比（低紫外去氧氣吸收），保護色譜柱（填料氧化）。c) 溶劑截止波長：最好避免，如乙腈和水190nm, 甲醇和乙醇210nm,等。d) 緩沖鹽流動相：需現配現用，低溫密封保存最多3天；有機溶劑和緩沖鹽（水）混配流動相，需低溫保存。e) 溶劑混溶性：建議用色譜純10%異丙醇or水作為過渡溶

13、劑。Notice：流動相-最多可以做A,B,C,D四通道梯度混合洗脫；灌注柱塞密封清洗液（seal wash）-一般建議使用6-10%甲醇水溶液；針頭清洗液（needle wash 綠色）-一般選擇80%甲醇和20%水玻璃容器必須使用超純水清洗； 所有溶劑和溶液在使用前必須用0.45 m的濾膜過濾，并至少超聲脫氣5分鐘； 用潔凈的玻璃容器盛放溶液和流動相，避免污染； 2.2 操作步驟2.2.1 開機和平衡系統(tǒng) 1 接通電源，依次開啟穩(wěn)壓電源、A泵、B泵、柱溫箱、自動進樣器、檢測器、系統(tǒng)控制器，待自檢通過2. 打開計算機電源3. 排空操作：打開LC-20AT泵排空閥（逆時針90度以上），按Pur

14、ge鍵，泵開始排空運行。（三分鐘自動停止）然后關緊排空閥（順時針旋緊）或者開機之前，直接打開排空閥，聽到滴聲之后，關緊排空閥4.把吸濾頭放入流動相瓶中，打開排液閥，按purge鍵排液23分鐘，purge完畢后關閉排液閥啟動泵送液（流速開始不宜太高應為正常分析流速的5080），此時可以同時進行自動進樣器的purge操作（時間為1525分鐘）自動進樣器清洗液一般使用與流動相比例接近的不含緩沖鹽的試劑也可以用甲醇：水70：30或甲醇：水1：1代替，觀察檢測器基線平穩(wěn)后即可做樣。（注意：a.如果使用前色譜柱中保存的流動相為純甲醇或純乙腈，而新流動相中含有緩沖鹽時，應先用純水沖洗色譜柱十分鐘左右再使用流

15、動相，以免鹽析出損壞系統(tǒng)。b.如系統(tǒng)為正相和反相交換使用，應先將所有管路用異丙醇清洗后再更換新流動相使用）。2.2.2 數據采集及分析1 在桌面上雙擊labsolution圖標進入實時分析窗口在開機畫面中，User ID選中Admin，不需輸入Password，點擊OK2 在左側助手欄給出了引導順序操作的圖標3 點擊Data acquisition進入采集數據編輯方法界面選中Normal（通用簡單）或Advanced（高級詳細）項a) 設定Pumps泵參數（Pumps泵參數：Mode控制方式，Flow流速，B，C，D conc各項濃度，P Max最大壓力 ） b) Oven柱箱參數(Oven柱

16、箱參數：Oven設定溫度，T Max最大保護溫度 ) c) Detecter檢測器參數：Cell設定池溫。Wavelength設定波長d) Controller系統(tǒng)控制器參數：e) Data acquisition選中Acquisition Time后，設置分析時間，等等 f) LC Time Prog時間程序參數：編輯泵梯度洗脫程序，也可以控制柱箱，檢測器，等等g) 點擊MethodData Analysis Parameter編輯積分參數：h) 設置 Width峰寬，Slope斜率，Min Area最小峰面積等等。新建方法推薦使缺省值，待分析完樣品后再設置此項參數，得到優(yōu)化的色譜數據結果后

17、，將參數保存在當前方法中i) 保存方法：點擊FileSave Method as j) 如圖：下載方法：點擊Down Load 鍵，向儀器傳送參數。起文件名*保存后，該方法即作為當前運行的方法。h) 運行方法：點擊如圖圖標（Instrument On/Off 系統(tǒng) 開/關）i) 單針進樣分析：如圖點擊Single Start圖標j) 編輯樣品參數：Sample ID樣品信息，Method Name 方法文件名，Data Path 數據存儲路徑，Data Name 數據文件名，Vial樣品瓶號(無)，Tray#架號(無)，Injection進樣量等, 點擊OK后，開始進樣操作。k) 報告予覽和打印, 點擊Top 返回上級引導操作欄： l) 點擊Post Run Analysis 進入數據后處理界面： m) 點擊report 進入報告界面：n) 打開