探討酶解法提取蕎麥皮中活性物質

1、.探討酶解法提取蕎麥皮中活性物質1引言苦蕎,學名稱韃靼蕎麥,是我國特有的一種土生植物,具有很強的環(huán)境適應能力，即使是惡劣的氣候條件，也能頑強生存。苦蕎麥生長在環(huán)境原始的高山寒冷地區(qū),含有豐富的全面的氨基酸、油酸、亞油酸及多種維生素和活性物質等。苦蕎麥是藥物作用較強的植物,蕎麥面具有殺腸道病菌、消積化痰、解除病毒的功效。苦蕎富含比其他谷物高的生物類黃酮物質,是優(yōu)質的保健食品來源之一。蘆丁是黃酮類活性物質的主要成分之一,現代臨床醫(yī)學表明,苦蕎麥及其制品可以幫助擴張冠狀血管和降低血管脆性、降血糖、增強人體免疫功能,同時，在降低膽固醇及血脂方面有較好的效果,這與其含有黃酮類物質蘆丁有很大的關系。對苦蕎

2、麥中各部分黃酮得率進行深入研究,為苦蕎麥資源的開發(fā)和保健食品的發(fā)展打了根基,也為評價苦蕎麥各部分的功效價值提供了有效依據。近年來，伴隨具各種生物活性的短肽的開發(fā)和研究，其研究和價值日益受到各國科學家的關注。大量科學研究顯示通過選擇合適的蛋白酶，水解的蛋白質可以得到大量的具有有益生物活性功能的生物活性肽?？嗍w麥活性肽是苦蕎麥皮粉經蛋白酶水解后產生的多肽和氨基酸的混合物質，在人體消化吸收方面有著更加令人滿意的效果。近年國內外科研人員不斷發(fā)現由苦蕎麥粉水解制得的水解產物具有降低血液膽固醇、降血壓、抑制有害物的吸收、抑制乳腺癌和大腸癌的發(fā)生、抑制脂肪蓄積、抑制膽結石的形成、抗氧化以及抗衰老等功能2。因

3、此，人們對苦蕎麥研究和開發(fā)的不斷深入，它的營養(yǎng)價值和生理功能會引起人們的關注，也會不斷提升對苦蕎麥活性物質的科學技術和鉆研水平。1.1生物活性肽的概述肽(peptides)是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物,是蛋白質的結構與功能片段,也正是因為他，蛋白質才會給人類帶來數以千萬計的生理功能。肽本身也具有很強的生物活性。氨基酸為肽的基本構成單位,由2個或3個氨基酸脫水縮合而成的肽分別叫二肽和三肽,以此類推為四肽、五肽。一般說來,肽鏈上氨基酸數目在10個以內的叫寡肽,1050個的叫多肽,50個以上的叫蛋白質。人們習慣上也把寡肽中的二、三肽稱為小肽。因為構成肽的氨基酸種類、數目與排列順序的不

4、同,所以肽具有了紛繁復雜的結構與功能。生物活性肽(biologicallyactivepeptide/bioactivepeptide/biopeptide)是指對生物機體的生命活動有益4或具有生理作用的肽類化合物,又稱功能肽(functionalpeptide)。肽是由氨基酸組成,人體擁有20種氨基酸,由于不同的氨基酸的種類排列,以及數量排列，還可能有二級、三級結構,通過這種方式排列出來的肽，其類別龐大而復雜。每一種活性肽都是由其獨特方式的組成,不同活性肽的組成結構決定了其具有復雜多樣的功能。此外活性肽在生物體內的含量也很微量,但卻顯示了其卓越的生理活性。據報道,有些多肽在10-7mol/L

5、的濃度時，仍顯示了其顯著的生理活性,簡單來說，1mL的多肽用60倍水稀釋后,仍然可以發(fā)揮他的生理功能。而且生物體可以參考自身生理狀態(tài)的情況下來合成或者降解其活性肽,因此,可以依據自身情況調節(jié)狀態(tài)的活性肽的半衰期均很短。1975年Hughes等首先報道從動物組織中發(fā)現了具有類嗎啡活性的小肽;1979年Brantl等從酶解的酪蛋白水解產物中分離到1個七肽物質(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile),為-酪蛋白的第6066氨基酸殘基片段,具有阿片活性。阿片樣肽(opioidpeptide)顯示出類阿片受體配體活性,擁有激素和神經遞質與體內的受體相互作用,具有鎮(zhèn)痛和調節(jié)人體情緒、呼吸

6、、脈搏、體溫的功能。內源性阿片肽有腦啡肽、內啡肽、強啡肽、孤啡肽。目前已經從小麥谷蛋白和大米蛋白中分離出了外源性阿片樣肽。它們與普通鎮(zhèn)痛劑的不同，經過消化道進入人體后沒有任何副作用,也不會讓人成癮,這一方面已經上升為藥理學、功能食品學研究的熱點。至今，學者們已經從動、植物和微生物中分離提取出了眾多紛繁復雜的生物活性肽。生物活性肽的結構有簡單的二肽，也有較大分子的多肽(數百個氨基酸)。生物活性肽的生物學意義在于兩個方面，一是其吸收機制優(yōu)于氨基酸，二是具有氨基酸不可比擬的生理功能,其生理功能主要體現為有類嗎啡樣活性、激素和調節(jié)激素的功能,對生物體內的酶具有調節(jié)和抑制作用,免疫調節(jié),抗血栓,抗高血壓

7、,降低膽固醇,抑制細菌、病毒滋生,抗癌,抗氧化和清除自由基等作用,促進元素吸收和礦物質運輸,調節(jié)生長,改善食品風味、口味和硬度等。因此,生物活性肽是篩選藥物、制備疫苗、食品添加劑和功能性因子的天然資源寶庫。1.2生物活性肽的研究歷史所有的生物，從最簡單的病毒直到復雜生物人類，體內龐大的蛋白質結構，本質上都由相同的20種氨基酸組成，也就構成了千姿百態(tài)的蛋白質世界。生物學家等在對蛋白質的深入研究過程中，發(fā)現一類由氨基酸構成但又不同于蛋白質的中間物質，這類具有蛋白質特性的物質被稱作多肽。肽是比蛋白質簡單、分子量小,由氨基酸通過肽鍵相連的一類化合物。多肽可以調理機體生理功能、為機體運輸營養(yǎng)，它幾乎影響

8、著人體的一切代謝合成。含有的氨基酸少于10個的肽稱為寡肽，超過的就稱為多肽；氨基酸為50多個以上的肽就成為人們熟悉的蛋白質。1902年，倫敦大學醫(yī)學院的兩位生理學家Bayliss和Starling在動物胃腸里發(fā)現了胰泌素，一種能刺激胰液分泌的物質。這是人類第一次發(fā)現的多肽物質。由于這一發(fā)現開創(chuàng)了多肽在內分泌學中的功能性研究，具有深刻的意義，諾貝爾獎委員會授予他們諾貝爾生理學獎。1931年，一種命名為P物質的多肽被發(fā)現，它具有興奮平滑肌并能舒張血管而降低血壓的作用。科學家們自此開始關注多肽類物質對神經系統(tǒng)的作用，并把這類物質命名為神經肽。1953年，由Vigneand領導的生化小組第一次成功合成

9、了生物活性肽催產素。從此，整個50年代的多肽研究，都集中于腦垂體所分泌的多種多肽激素。1952年，生物化學家StanleyCohen在將肉瘤植入小鼠胚胎的實驗中，發(fā)現了小鼠交感神經纖維生長加快、神經節(jié)明顯增大這一問題。8年后到了1960年，我們才知道這是因為一種多肽發(fā)揮的作用，并將之稱為神經生長因子（NGF）。50年代末，Merrifield研究出了多肽固相合成的方法，因此被授予諾貝爾化學獎。60年代初期，多肽的研究得到了迅猛的發(fā)展，多肽的結構分析、生理功能等都得到了很多理論和實踐成效6。1965年，我國科學家成功地合成了牛結晶胰島素，這在世界范圍里第一次人工合成多肽類生物活性物質。70年代，

10、神經肽的研究被推向了頂峰，腦啡肽及阿片樣肽相繼被公布，科學界進入了多肽影響生物胚胎發(fā)育的研究階段。1975年Hughes和Kosterlitz從人和動物的神經組織中提取出內源性活性肽，增加了生物制藥內容，拓展了“細胞生長調節(jié)因子”這一生物制藥領域。這一時發(fā)現的細胞生長調節(jié)因子有100種,比臨床應用的多肽激素和其他活性多肽的總和還要多很多。90年代，人類基因組計劃開始全面啟動。隨著科學家們解開一個個基因的原理，多肽研究及其應用呈現空前繁榮的局面。肽是組成蛋白質的結構片段，蛋白質發(fā)揮作用也是依靠他所具有的活性基因部分。實際上動物體內的功能性蛋白質多數只是活性功能物質的載體，它們所具有的的功能多數只

11、是由掛在其上的肽段來實現的。通過多肽這一中介，既能夠深入研究蛋白質的功能性質，又能為改善和組成新功能的蛋白質補充新的基礎資源。同時，幾乎所有細胞都由多肽調節(jié)，它包括激素、神經、細胞生長和生殖等各個領域，在生命活動中，很多功能性生理作用如細胞分化、神經激素遞質調節(jié)、腫瘤病變、免疫調節(jié)等，均與活性多肽息息相關。伴隨現代生物技術的發(fā)展以及生命科學歷程的演進，多肽在生物體內的生理功能被越來越多的人熟知，尤其是許多活性肽生理功能和結構的推進，更是增進了科學界對活性肽的重視和開發(fā)。1.3生物活性肽的生理功能1.3.1免疫活性Jolles等在酪蛋白的降解物中分離提取出了免疫活性肽,他能激發(fā)巨噬細胞的吞噬功能

12、。Berthou等對人乳酪蛋白的消化物進行研究，并提取得到六肽和三肽,并證明它能借助鼠巨噬細胞激活綿羊紅血細胞的吞噬功能。提供免疫活性肽的食物源有大豆蛋白。這些免疫活性肽常常與腸粘膜結合淋巴組織形成戰(zhàn)略伙伴,而且通過自由滲透腸壁而直接與外周淋巴細胞發(fā)生作用。胸腺肽可以化身免疫因子，寄身于載體上應用于醫(yī)學，已經取得獲得可喜成果。1.3.2抗氧化作用抗氧化肽存在于動物肌肉中的肌肽,可在體外抑制被鐵、血紅蛋白、脂質氧化酶和單態(tài)氧催化的脂質氧化作用3。某些肽和蛋白水解物承擔著重金屬清道夫作用和過氧化氫分解促進劑的作用,因而可降低自氧化速率和減少脂肪過氧化氫含量?？寡趸钚噪谋惶砑拥饺庵破分校梢杂行Х?/p>

13、止氧化型脂肪酸敗,扮演者防腐劑的角色，在食品和動物飼料中有無限的應用潛力。1.3.3抗高血壓活性抗高血壓肽主要是通過抑制血管緊張素-轉換酶,進而影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)來實現對血壓影響的。一般我們覺得,維持高活性必須有抗高血壓肽的C末端的Pro、Phe和Tyr或序列中含有的疏水氨基酸。對二肽來說,最有效的方法是結合N未端的芳香氨基酸與血管緊張素。已知的抗高血壓肽大致上有4種來源:如乳蛋白的肽類;來自酸乳的肽類;來自魚貝類(沙丁魚、金槍魚)的肽類;來自植物的肽類(玉米醇溶蛋白、無花果)等。1.3.4降膽固醇作用研究發(fā)現,大豆多肽可以帶來降低血清膽固醇的作用5,與大豆蛋白相比存在特殊的優(yōu)點

14、。對于膽固醇值正常的人,沒有降低膽固醇的作用,而對于膽固醇值高的人具有降低膽固醇的作用;對膽固醇值正常的人,食用高膽固醇含量的食品時,有預防血清膽固醇值升高的作用;使膽固醇中LDL、VLDL值降低,但不會使HDL值降低。大豆多肽主要是通過刺激甲狀腺激素分泌來實現降膽固醇作用,促進膽固醇的膽汁酸化,使糞便排泄膽固醇增加,從而降低血液膽固醇。1.3.5促生長作用促生長肽能促進細胞的生長分化,如大豆蛋白的酶解物可刺激細菌的生長,特別是乳酸菌族的生長;從雞蛋中提取的肽能促進細胞的生長和DNA的合成;動物循環(huán)中存在外源組織蛋白合成促進肽。1.3.6抗血栓作用研究人員從北美水蛭中發(fā)現一種由39個氨基酸殘基

15、組成的肽,可競爭性地抑制纖維蛋白原與血小板表面的受體(GPb)與a結合,從而具有抗血小板聚集的功能和阻斷血栓的最終生成。Jolles等發(fā)現,源于牛-酪蛋白的CasoplatelinC11肽可抑制腺苷酸二磷酸誘導的血小板凝集及其與纖維蛋白原結合的作用?？寡牡陌l(fā)現和進一步的開發(fā)利用將為血栓類疾病的預防和治療提供了新的手段。1.3.7抑制腫瘤轉移某些小肽(如Arg-Gly-Asp、Leu-Asp-Val、Tyr-Ile-Sly-Ser-Arg)在腫瘤轉移中起重要作用,人工合成含有這些氨基酸序列的外源性生物活性肽可以與細胞外基質(ECM)、纖維蛋白競爭細胞和血小板表面的整合素等分子,干擾腫瘤細胞-

16、ECM的相互作用,抑制血小板瘤栓形成及腫瘤血管生成,達到抑制腫瘤轉移的目的。1.3.8抗衰老作用張政等采用堿抽提和等電點沉淀法從苦蕎麥皮籽粒中制備出蕎麥蛋白復合物，用20%苦蕎麥蛋白復合物飼喂小鼠，結果發(fā)現小鼠血液和臟器中的超氧化物歧化酶、過氧化酶和谷胱苷肽過氧化物酶活性均有不同程度的提高，脂質過氧化物丙二醛含量下降，表明苦蕎麥蛋白復合物對生物體有一定的營養(yǎng)和抗衰老作用7。1.4苦蕎麥活性物質的研究目的與前景1.4.1苦蕎麥活性物質的研究目的蕎麥作為健康食品資源，正在被人們越來越熟悉和接受，并在世界范圍內流行開來8，主要原因在于蕎麥內含高生物價的蛋白質和豐富的生物活性物質。近幾年的研究表明，多

17、酚類化合物是蕎麥中最重要的營養(yǎng)保健功能因子。蘆丁作為主要的黃酮類化合物22，報道最多。具有強化毛細血管，降血壓，預防腦中風等生理功能。本試驗旨在盡可能得到用堿性蛋白酶的水解下得到高含量的活性物質，找到最適合的水解條件，為苦蕎麥的進一步研究提供試驗方法與基礎。1.4.2苦蕎麥活性物質的研究前景苦蕎麥活性肽的研究極具實際意義18：苦蕎麥作為一種經濟作物來源豐富、價格低廉，可滿足大規(guī)模生產的需求；自原始社會以來，人們就有食用蕎麥制品的習慣，開發(fā)生產蕎麥活性肽易為人們所接受；苦蕎麥活性肽產品安全健康，可靠養(yǎng)生，可以作為日常保健食品每天食用；開發(fā)具有抗氧化性的苦蕎麥活性肽可以大幅度提高蕎麥制品的附加值，

18、拓寬蕎麥的用途；值得注意的是，目前苦蕎麥的研究大多是以有機溶劑抽提為基礎的，由苦蕎麥粉經酶水解制得的活性物質的研究還極少有報道。因此開發(fā)利用苦蕎麥蛋白質的生物功能，多渠道、多方位地開辟蕎麥市場，研究開發(fā)苦蕎麥活性物質必將具有廣闊的前景。2.實驗方法2.1實驗材料、化學試劑與儀器2.1.1實驗材料蕎麥皮粉：取產自陜西的苦蕎麥皮磨成粉并過60目篩；經半微量凱氏定氮法測定其蛋白質含量為2.39%。堿性水解蛋白酶（Alcalase）：購自諾維信中國生物技術有限公司2.1.2主要儀器名稱型號產地1)紫外分光光度計UV-1601日本島津公司2)電子天平AE-200上海梅特勒-托利多儀器有限公司3)電熱恒溫

19、水浴鍋DK-S12上海森信實驗儀器有限公司4)離心沉淀機80-2上海手術器械廠5）電爐6）半微量凱氏定氮儀一套7）25ml酸式滴定管（附滴定臺）2.1.3化學試劑氫氧化鈉、檸檬酸、濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、鹽酸、碳酸鈉、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑、L-酪氨酸（Tyr）、Folin-酚（以上所用試劑均為分析純）。2.2酶解法提取蕎麥皮中的生物活性肽2.2.1酶解步驟蕎麥皮粉溶解熱變性處理(80恒溫水浴，30min)1mol/LNaOH調pH約11酶解滅酶(沸水浴10min)1mol/L檸檬酸調pH至4.5離心(3000rpm/25min)取上清液(提取液)2.2.2酶解反應的正交試驗設計在探

20、索試驗結果的基礎上得到適合堿性水解蛋白酶酶解反應的相關參數，然后在此基礎上對苦蕎麥皮粉酶解反應的正交實驗進行設計。實驗因素分別是水解溫度(A)、酶量g(B)和反應時間h(C)為條件，進行黃酮含量的三因素三水平的正交實驗10。詳見表1。2.3蛋白酶酶活測定酶活力單位定義為在特定的實驗條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1g酪氨酸的酶量定義為一個酶活單位。2.3.1Tyr標準曲線的制作精確稱取預先于105干燥至恒重的L-酪氨酸(Tyr)0.0lg，精確至0.00lg，用0.5mol/L的鹽酸溶解后定容至l00mL，即為100g/mL酪氨酸標準溶液。然后配置成0、20、40、60、80、100g/mL(須做

21、平行試驗)，向各試管依次中加入標準Tyr溶液、蒸餾水、碳酸鈉溶液、Folin-酚試劑(詳見表2)，迅速混勻后置予40水浴中顯色15min，取出冷卻至室溫，在波長680nmI處用分光光度計分別測定其吸光度，其中不含酪氨酸的管為空白對照。2.3.2蛋白酶酶活測定精確稱取待測堿性水解蛋白酶1.0g(樣品需做3支平行試管)，用0.02mol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH7.5)稀釋2000倍。取lmL分別置于試管中(同時做空白對照，空白管立即加入10的三氯乙酸溶液3.0mL充分混勻)。另三管加入經37預熱的pH7.8的1酪蛋白溶液2.0mL，混勻，連同空白管迅速放入37的恒溫水浴鍋中，用秒表

22、準確計時精確反應15min，立即向三個樣品管加入10三氯乙酸溶液3.0mL，充分混勻；同時向空白管加入1的酪蛋白溶液2.0mL搖勻，然后將四管繼續(xù)在40水浴中保溫15min。最后通過離心除去來被水解的酪蛋白和酶蛋白，上清液分別取lmL放入三支干燥試管中。加入0.55mol/L碳酸鈉溶液5.00mL，其余同標準曲線。在680nm波長比色測定12。2.3.3蛋白酶酶活的計算酶活力=A/(t×W)×K×V×N式中K：A=1.00時所需的酪氨酸的重量本實驗K=168.78；W：酶的重量(w=1.0g，精確到0.001g)；V：水解酪蛋白混合物體積(v=6.0mL

23、)；t：時間(t=15min)；2.4苦蕎麥皮中生物活性肽提取率的測定(以蛋白質含量記，半微量凱氏定氮法)2.4.1.蛋白質含量測定的實驗原理樣品與濃硫酸共熱時，有機物被破壞，其中的碳和氫被氧化成二氧化碳和水逸出，而氮轉變?yōu)榘痹倥c硫酸結合成硫酸銨留在消化液中。硫酸銨用氫氧化鈉中和生成氫氧化銨，加熱又分解成氨，經硼酸吸收后用標準酸液滴定，根據標準酸液的消耗量計算總氮量，再乘以換算系數，即蛋白質含量。其反應式如下：H2SO4=SO2+H2O+O2CH3CHNH3COOH+12O6CO2+4H2O+2NH32NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(NH4)2SO4+2NAOH=2NH3+NA2SO4

24、+2H2O2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCL+5H2O2NH4CL+4H3BO32.4.2苦蕎麥皮酶解液中蛋白質含量的測定步驟吸取同一實驗條件下的三組平行實驗酶解液各5mL，于同一干燥的100mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸銅，8g硫酸鉀及25mL硫酸，搖勻后先進行樣品消化，待樣品消化完成后，進行凱氏定氮，做三次平行測定。按同一方法作試劑空白試驗。2.4.3結果計算公式蛋白質含量的計算公式X=(V1-V2)×C×0.014×F×100/m×（10/100）式中：X-樣品中蛋白質的含量，%；V1-樣

25、品中消耗鹽酸標準液的體積，%；V2-試劑空白消耗鹽酸標準液的體積，%；C-鹽酸標準液的濃度，mol/L；0.014-1mol/L鹽酸標準液1mL相當于氮的g數；F-蕎麥皮為5.83；m-樣品的質量，g或mL；2.4.4苦蕎麥皮總蛋白質的含量測定稱取固體樣品2g于干燥的100mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸銅，8g硫酸鉀及25mL硫酸，搖勻后先進行樣品消化，待樣品消化完成后，進行凱氏定氮。2.4.5苦蕎麥皮抗氧化活性肽提取率的結果計算提取率（%）=苦蕎麥皮提取液中總蛋白/苦蕎麥皮總蛋白×100%2.5蕎麥皮中黃酮得率的測定2.5.1黃酮得率測定的實驗原理在黃酮類化合物的紫外光譜圖上主要有

26、兩個吸收帶:環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶(300550nm)和環(huán)苯酰系統(tǒng)引起的吸收帶(240280nm)。若加入鋁鹽,則鋁離子與黃酮化合物形成穩(wěn)定的配合物,帶會明顯向長波方向移動(紅移)，在NaNO2的強堿性溶液中,其在510nm處吸光度值最大,從而為分光光度法測定提供了可靠的依據。黃酮13含量單位定義為在特定的實驗條件下，每克苦蕎麥皮中所含的黃酮的毫克數。2.5.2蘆丁標準曲線的繪制14準確稱取干燥恒重的蘆丁標準品0.0750克，用30%乙醇溶解并定容250mL，搖勻得濃度為0.3000mg/mL標準應用液。吸取蘆丁標準液0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL置于0#

27、、1#、2#、3#、4#、5#、6#25mL容量瓶中，用30%乙醇補充至12.5mL，分別加0.7mL5%亞硝酸鈉溶液搖勻，放置5min后分別加入0.7mL10%硝酸鋁搖勻，6min后分別加入5mL1mol/L氫氧化鈉搖勻，用30%乙醇定容至刻度，10min后于510nm處比色測定，0#作參比得黃酮含量測定的標準曲線，以濃度（C）為橫坐標，以吸光度（A）為縱坐標得標準曲線方程：A=0.0104C+0.0062R2=0.9999A-吸光度C-ug/mL即C=95.853A-0.5905R2=0.99992.5.3分光光度法測定黃酮吸光度取0.5mL樣品于25mL容量瓶中，用30%乙醇補充至12.

28、5mL，加入0.7mL亞硝酸鈉搖勻靜置5min，加入0.7mL硝酸鋁搖勻靜置6min，加氫氧化鈉5mL,30%乙醇定容至25mL.10min后測定其在510nm下比色測定，用無樣品的同樣的混合液作空白參比，測定吸光度A15-17。2.5.4黃酮得率計算苦蕎麥皮中黃酮得率（%）為C*25/0.5*100mL*10-6g/10g式中：C為由測定出的吸光度值根據蘆丁標準曲線算出黃銅濃度單位ug/mL3.結果與討論3.1標準曲線的繪制3.1.1酪氨酸標準曲線繪制分別配制酪氨酸系列濃度20µg/mL、40µg/mL、60µg/mL、80µg/mL、100µ

29、;g/mL，測量其對應的吸光度值結果如表2。表2酪氨酸標準曲線繪制Table2tyrosinestandardcurvedrawing濃度C（µg/mL）20406080100吸光度A0.1220.2410.3580.4770.594標準曲線方程為：Y=0.0059x+0.0044R2=1.0000。3.1.2蛋白酶酶活測定采用Folin-酚法測定堿性水解蛋白酶的平均吸光度值為0.124，代入計算公式，測得堿性水解蛋白酶的酶活為1.6743×104（U/g）。3.1.3蘆丁標準曲線繪制準確稱取干燥恒重的蘆丁標準品0.0750克，用30%乙醇溶解并定容250mL，搖勻得濃度為

30、0.3000mg/mL標準應用液。分別系列的蘆丁溶液，測量其對應的吸光度值，結果如表3。表3蘆丁標準曲線繪制Table.3Therutinstandardcurvedrawn蘆丁標準液（mL）01.02.04.06.08.0吸光度（A）空白0.1350.2590.5080.7601.0043.2苦蕎麥皮酶解提取活性肽和黃酮的正交實驗結果與極差分析按2.2.2苦蕎麥皮酶解反應的正交試驗表進行正交試驗，對其活性肽提取率()進行測定，如表四所示。表4蕎麥酶解反應的正交試驗結果Table.4Buckwheatenzymaticreactionoforthogonaltestresults樣品號因素活性

31、肽提取率(%)黃酮得率(%)ABC111142.20±1.283.40±0.01212230.50±5.442.69±0.01313338.86±1.283.43±0.00421236.36±0.663.51±0.04522333.84±0.263.16±0.04623133.44±5.023.12±0.15731328.42±2.042.84±0.10832133.44±1.383.24±0.14933245.96±3.183.40±0.01從表4中可以看出，10g苦蕎麥皮粉用堿性蛋白酶水解提取黃酮，黃酮的得率為3.00%左右，根據文獻，10g苦蕎麥皮粉用乙醇抽提所得的最高黃酮得率為1.80%，可見，苦蕎麥皮中的黃酮用堿性蛋白酶酶解提取要比用乙醇抽提效果好，堿性酶酶解提取黃酮切實可行。為了了解各因素對活性肽提取率和黃酮得率()，本文做了極差分析，如表五