mRNA差異顯示技術(shù)

1、Page 1臨床獸醫(yī)學臨床獸醫(yī)學2012級級Page 2 一、一、 二、二、DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)的發(fā)明及其基礎(chǔ) 三、三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理：差異顯示技術(shù)的原理：Page 3 高等生物大約有35 萬個不同的基因，在每一個正常的體細胞中都含有相同的基因組拷貝，但在不同的組織細胞中僅有10%20%的少部分基因被，這種選擇性表達是在發(fā)育過程中細胞分化的根本原因，是調(diào)控細胞生命活動過程的核心機制。因此，比較不同組織之間，或相同組織在不同生理條件下，或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達差異，可分離并克隆出這些特異性表達的基因。研究基因差異表達的主要技術(shù)有 差別雜交(differential

2、hybridization) 扣除（消減）雜交(Subtractive hybridization) mRNA差異顯示技術(shù) (mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR) 抑制消減雜交法(suppressial substractive hybridization ,SSH) 代表性差異分析 (Represential display analysis ,RDA) 交互扣除RNA差別顯示技術(shù)(RSDD) 以及基因表達系列分析和電子消減Page 4mRNA差異顯示PCR技術(shù)是1992年由美國波斯頓Dena-Faber

3、癌癥研究所的Liang Peng 博士和Arthur Pardee 博士建立起來的一種用于鑒定和克隆哺乳動物正常生理狀態(tài)和異常狀態(tài)細胞之間差異表達基因的方法,是目前篩選差異表達基因最有效的方法,同時，研究mRNA差異相對于研究DNA差異而言。它排出了非編碼區(qū)（內(nèi)含子）的影響，從而使得研究結(jié)果更加接近于真實。 Page 5二. DDRT-PCR的發(fā)明及其基礎(chǔ)n 由Liang于1992年創(chuàng)立n是分離差異表達基因強有力的工具n在隨后幾年里， Liang等在技術(shù)方面做了大量改進，使技術(shù)更適用、更簡便n 基于RT-PCR理論，依賴于3種技術(shù)n1）RT-PCR技術(shù)n2）以特定引物進行的PCR技術(shù)n3）DN

4、A電泳技術(shù) Page 6三、mRNA差異顯示技術(shù)的原理： mRNA差異顯示技術(shù)的主要原理是利用cDNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù),PCR擴增和高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，來顯示PCR產(chǎn)物的差異。其中，反轉(zhuǎn)錄技術(shù)中使用了一系列能與mRNA的Poly（A）尾巴相結(jié)合的錨定寡聚脫氧核苷酸引物OligoT12MN。錨定引物與mRNA的Poly（A）+的兩個堿基，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下可以啟動mRNA群體反轉(zhuǎn)錄。Page 75 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 Poly(A) RNA5 T12MN 3錨定引物錨定引物逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5變

5、性變性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火退火5 T12MN 3錨定引物錨定引物寡核苷酸隨機引物寡核苷酸隨機引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延長延長dNTP、Taq聚合酶聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3變性、退火、延伸變性、退火、延伸電泳電泳顯示顯示T12MN(M為為A、G、C，N為為A、T、G、C) 啟動啟動cDNA第一鏈合成第一鏈合成不同長度的不同長度的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物回收差異條帶，再擴增回收差異條帶，再擴增，克隆測序，同源比對，克隆測序，同源比對隨機結(jié)合到隨機結(jié)合到cDNA鏈上鏈上Pag

6、e 8四.DDRT-PCR目前的應(yīng)用領(lǐng)域n主要用于醫(yī)學研究的癌癥、神經(jīng)、骨科、病理、生殖等領(lǐng)域n動植物遺傳、育種，動物營養(yǎng)及微生物等領(lǐng)域Page 9五. DDRT-PCR一般操作步驟n總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄nRT-PCRn聚丙烯酰胺凝膠電泳及差異DNA條帶的回收nPCR在擴增及其產(chǎn)物的回收n測序和數(shù)據(jù)庫比對分析n實時定量PCRmRNA差異顯示技術(shù)簡略流程圖Page 11六. DDRT-PCR的優(yōu)點n以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)n靈敏度高，僅需0.2g的總RNAn可以同時比較多個樣品間基因表達的差異 n可以同時檢測到“上調(diào)”及“下調(diào)”的基因 n時間短，實驗過程中可步步驗證比較 n可進行多

7、基因家族的表達分析 Page 12 七.DDRT-PCR的缺點n 假陽性高 n 樣品mRNA可能有部分降解 n 有少量的DNA污染 n 單條帶可能由一種以上cDNA 片段所構(gòu)成 n 有些特異cDNA片段太短,在Northern雜交時檢測不到雜交信號 n PCR擴增了一些稀有mRNA片段,在雜交時顯示不出差異表達的信號 n 絕大多數(shù)差異條帶僅含有3-UTR 500bp以內(nèi)的一短片段的信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對保守，得不到特異的基因 n 對低豐度mRNA檢出率低Page 13八.DDRT-PCR的技術(shù)改進n 針對以上不足,特別是假陽性率高的缺點，從以下幾個方面做了大量改進：n 引物設(shè)計n 反應(yīng)條

8、件的優(yōu)化n 顯示方法n 假陽性鑒定Page 14引物設(shè)計n mol等將12種錨定引物變?yōu)?種，并發(fā)現(xiàn)G的擴增效果最好n 王夏等在T12MN之前加上了一段T7啟動子序列，提高了PCR反應(yīng)的嚴謹性n Liang發(fā)現(xiàn)910個mer長度的隨機引物比較適宜n Liang還發(fā)現(xiàn)，當長度為13bp，在5端增加Hind酶切位點，能更有效的擴增，并能提高特異性Page 15反應(yīng)條件優(yōu)化nRNA模板量在2-3g時，能擴增出較多的條帶n不同條件下dNTP濃度不是固定不變的 n1.5-2.0mmol/L的Mg2+濃度效果較好n40-42的退火溫度通常能得到較好的擴增效果，周寧新等在PCR的頭兩個循環(huán)，用低嚴謹?shù)耐嘶饻?/p>

9、度36，在隨后的循環(huán)中退火溫度提高到45，獲得了很清晰的電泳圖譜Page 16顯示方法n 最初DDRT-PCR通過放射性同位素在變性膠上進行放射自顯影成像nSanguinetti介紹了一個快速銀染方法，只需15分鐘，而且容易克隆回收 nRompf等通過瓊脂糖凝膠電泳分辨差異cDNA片段n余桂華等建立了熒光mRNA差異顯示方法，最大限度地降低了假陽性Page 17假陽性的鑒定n Northern blot仍是鑒定差異的一個主要手段；分析較多條帶，反向Northern blot是較為切合實際的選擇n Heinz通過SSCP分析排除了非差異表達的cDNA污染n Callard把純化后的PCR 產(chǎn)物分

10、成兩部分:一部分用于克隆，另一部分用作探針雜交以篩選克隆n Sompayra設(shè)計了向5步移的方法mRNA差異顯示技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功運用于動物的胚胎發(fā)育、組織分化、生長因子激活與抑制、細胞周期控制、，在植物無性繁殖、形態(tài)發(fā)生、次生代謝、抗逆抗病等方面被用來進行基因的鑒定、克隆以及功能研究，并取得很好的結(jié)果。概括起來其主要用途可以歸納為以下三點： 第一，尋找差異表達的基因。 第二，研究個體、種群或品種間轉(zhuǎn)錄水平上的遺傳變異。 第三，鑒定經(jīng)濟動物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟性狀位點的基因。 由于人們認識的基因還不夠全面，特別是對生物發(fā)生、發(fā)育及病理生理過程中某些新的功能基因和調(diào)控作用認識不足，因此差異顯示技術(shù)將在研究生物進化、損傷修復、癌變及治療反應(yīng)過程中具有重要意義。差顯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為在該領(lǐng)域中尋找新基因提供了有用的工具。相信隨著不斷的應(yīng)用和技術(shù)的不斷改善，差異顯示技術(shù)必越來越多的在生命科學以及醫(yī)學領(lǐng)域的