當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對ECV304細胞血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響

1、當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對ECV-304細胞血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響【摘要】 目的 探討當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV-304)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA表達的影響。方法 以體外培養(yǎng)的ECV-304細胞為模型,采用四氮唑藍比色法(MTT法)測定細胞增殖,半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測ECV-304細胞VEGF mRNA表達的變化。結(jié)果 當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對ECV-304細胞有促增殖的作用,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物能夠誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達,其作用與劑量呈正相關(guān)。結(jié)論 當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對EC

2、V-304細胞的促增殖作用機制是通過誘導(dǎo)ECV-304細胞VEGF mRNA表達實現(xiàn)的。 【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸；紅芪；內(nèi)皮細胞；血管內(nèi)皮生長因子 Abstract：Objective To study the effect of the ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixture on the VEGF mRNA expression of ECV-304 cell. Method Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixtu

3、re were refined by ultra-filtration technique. ECV-304 cells were cultured as model, and its proliferation was detected by MTT colorimetry. VEGF mRNA expression was observed by semi-quantitative RT-PCR. Results The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotrys2 / 14s mixtu

4、re could markly promote the growth of ECV-304 cells, there was significant difference between experimental and control group (P0.05). The ultra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixture upregulated VEGF mRNA expression with dose-dependent relation. Conclusion The ul

5、tra-filtration extract from Angelica sinensis and Hedysarum polybotryss mixture can markly promote ECV-304 cell proliferation, which may be related to the expression of VEGF mRNA.Key words：Angelica sinensis；Hedysarum polybotrys；ECV-304 cell；VEGF當(dāng)歸、紅芪是甘肅道地藥材,當(dāng)歸有補血活血之功效,紅芪又名“多序巖黃芪”,具有補氣固表、斂瘡生肌功效。當(dāng)歸、黃芪

6、按15配伍所組成的當(dāng)歸補血湯是中醫(yī)補氣生血的經(jīng)典方,現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)紅芪、當(dāng)歸有顯著的抗心肌缺血作用。益氣生血、補血活血中藥的藥效是否與促進血管新生有關(guān),當(dāng)歸紅芪合劑(15)的有效成分中是否具有促進血管新生的活性成分,本研究對此進行了探討。1 實驗材料1.1 藥物與細胞系 紅芪購自甘肅宕昌縣,當(dāng)歸購自甘肅岷縣。人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ECV-304),購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基,美國Sigma公司產(chǎn)品。胎牛血清,杭州四季青產(chǎn)品。四氮唑藍(MTT)試劑、碘化丙啶(PI),華美生物工程公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為分析純,天津化工試劑廠提供。1.3 儀器 5萬分子量超濾膜,甘

7、肅省膜科學(xué)技術(shù)研究所提供。超濾設(shè)備,主要組件為海德能公司產(chǎn)品,甘肅省膜科學(xué)技術(shù)研究所研制。細胞CO2培養(yǎng)箱：SCP-2000型,美國Shill公司產(chǎn)品。流式細胞儀：XL型,美國Coulter公司產(chǎn)品。酶聯(lián)免疫檢測儀：DG-5031型,國營華東電子管廠產(chǎn)品。2 實驗方法2.1 藥物制備 稱取當(dāng)歸飲片500 g、紅芪飲片2 500 g,混合,加水浸泡,煎煮后傾出藥液,趁熱棉花過濾,冷卻后上超濾設(shè)備。首先陶瓷膜微濾當(dāng)歸濃縮液技術(shù)參數(shù)為壓力0.5 kPa/m3、溫度25 、流量100 L/(h·m2)；其次PNA中空纖維超濾膜(截留分子量5萬)超濾經(jīng)微濾處理的紅芪、當(dāng)歸配伍的水煎液壓力56

8、kg/m3、溫度25 、流量100 L/(h·m2)。將5萬分子量以下超濾液濃縮至相當(dāng)于每毫升藥液含原藥材量為1 g,高壓滅菌,冷卻后置冰箱(4 )貯藏備用。2.2 細胞培養(yǎng) 采用常規(guī)培養(yǎng)ECV-304細胞,培養(yǎng)液為含5%的胎牛血清,青、鏈霉素各100 U/mL的DMEM,在37 、飽和濕度、5% CO2孵箱中培養(yǎng),每23 d用0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化傳代。2.3 分組 實驗分為用藥組和對照組：用藥組細胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物,從而形成不同藥物濃度培養(yǎng)下的ECV-304細胞；對照組為細胞培養(yǎng)液中加等量的PBS所培養(yǎng)的ECV-304細胞。2.

9、4 細胞增殖率測定 采用MTT法。將ECV-304細胞懸液調(diào)整為4×104/mL,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 L,常規(guī)培養(yǎng)24 h細胞貼壁后,實驗組分別于細胞培養(yǎng)液中加入當(dāng)歸紅芪合劑的超濾膜提取物,并配制成不同濃度；對照組于細胞培養(yǎng)液中加入等量的PBS,調(diào)零孔只加等量的細胞培養(yǎng)液無細胞,每組8個復(fù)孔,分別于加藥后24、48、72、96 h在各孔加入MTT 10 L。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),每孔加入150 L二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm處的吸光度值(A490),按下式計算細胞增殖率(PR)：PR(A用藥/A對照1)×1

10、00%。2.5 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達 按試劑盒說明提取細胞內(nèi)總RNA,根據(jù)文獻1選用特異性引物。VEGF上游引物：5-AAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATG-3,VEGF下游引物：5-GCGAATTCCT GCCCGCGCTGAC-3,B-actin上游引物：5-AACACCCAGCCATGTACGTTG-3,B-actin下游引物：5-CGG ATGTCCACGTCACACTTCAT-3。參照文獻1略加改進：42 DNA合成45 min,94 預(yù)變性4 min,94 預(yù)變性45 s,60 退火30 s,72 延伸45 s,循環(huán)35次,72 延伸10

11、 min,4 ,上PCR反應(yīng)儀進行熱循環(huán)。預(yù)計產(chǎn)物長度：VEGF 121為246 bp, VEGF 165為375 bp,B-actin為509 bp。各組取10 L擴增產(chǎn)物溶液加入含0.5 mg/L溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠孔中,同時一孔內(nèi)加入與0.25%溴酚藍混勻的Marker作參照。在恒溫、電壓5 V/cm、恒流75 mA于1×TBE緩沖液中電泳12 h,在凝膠圖像成像系統(tǒng)下獲得圖像,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析所獲圖像上的各條帶的光密度,以VEGF 165基因條帶的光密度參數(shù)與B-actin條帶的光密度參數(shù)的比值做為該標(biāo)本mRNA的表達參數(shù)。重復(fù)上述實驗4次。3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPS

12、S軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理,結(jié)果用x±s表示,多組間均數(shù)比較用單因素方差分析和q檢驗。4 結(jié)果4.1 當(dāng)歸紅芪合劑對ECV-304細胞血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的影響(見圖1、表1)表1 ECV-304細胞在當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物處理48 h后VEGF mRNA 4.2 當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物對ECV-304細胞增殖的影響(見表2)表2 當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物作用于ECV-304細胞不同時間細胞增殖率比較(略)從表2可以看出,在1.521.0 g/L濃度范圍內(nèi),當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物作用ECV-304細胞48 h,有顯著的促ECV-304細胞增殖的作用。從增殖率看,在7.51

13、5.0 g/L濃度范圍,當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物促ECV-304細胞增殖的作用最強；比較在相同濃度下,當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物作用ECV-304細胞24、48、72、96 h的增殖率結(jié)果,提示當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物作用ECV-304細胞48 h促增殖效果最明顯；在3.09.0 g/L濃度范圍內(nèi),當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物作用ECV-304細胞24、48、72 h,均有顯著的促ECV-304細胞增殖的作用,并且其最佳作用時間為48 h；當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物促ECV-304細胞增殖的最大增殖率為44.31%,當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物的用藥范圍在1.521.0 g/L。4.3 藥物鑒定及制備結(jié)果

14、 當(dāng)歸、紅芪經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥學(xué)教研室李成義教授鑒定,分別為傘形科當(dāng)歸屬的根和豆科巖黃芪屬植物多序黃芪的干燥根莖。實驗所用當(dāng)歸紅芪合劑5萬分子量以下超濾膜提物具有穩(wěn)定性強、可重復(fù)性好的特點。5 討論本研究利用甘肅省膜科學(xué)技術(shù)研究所已有技術(shù)和設(shè)備優(yōu)勢,應(yīng)用超濾技術(shù)對當(dāng)歸紅芪合劑進行了精制。超濾技術(shù)不需要加熱,不需要添加化學(xué)試劑,操作條件溫和,沒有相態(tài)變化,具有破壞有效成分的可能性小、能耗少、工藝流程短等優(yōu)點,近年來正逐漸地被用于中藥成分的分離、純化、精制2。實驗過程中所用當(dāng)歸紅芪合劑5萬分子量以下超濾膜提取物具有穩(wěn)定性強、實驗可重復(fù)性好的特點。血管新生的許多關(guān)鍵步驟均需內(nèi)皮細胞參與,內(nèi)皮細

15、胞在血管生成中具有非常重要的作用。利用體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞,已廣泛應(yīng)用于血管新生的研究當(dāng)中,ECV-304細胞具有一般內(nèi)皮細胞的某些特征,而且還具有可無限傳代、不依賴特殊生長因子就能存活等特點3。李氏等4利用ECV-304細胞在體外成功構(gòu)建血管新生的三維模型,證明ECV-304細胞可用于血管新生的研究,所以本實驗以體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞株ECV-304細胞為模型。MTT法是檢測細胞增殖的經(jīng)典方法,可間接反映活細胞的數(shù)目。本實驗結(jié)果顯示,當(dāng)歸紅芪合劑有明顯促進ECV-304細胞增殖的作用；應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)分析了當(dāng)歸膜提取物作用ECV-304細胞后VEGF mRNA表達的變化。研究結(jié)果表明,

16、當(dāng)歸超濾膜提取物可以誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達,說明當(dāng)歸超濾膜提取物可能是通過誘導(dǎo)VEGF mRNA的表達而發(fā)揮其促內(nèi)皮細胞增殖的作用。基于VEGF廣泛的生物學(xué)效應(yīng)及內(nèi)皮細胞的增殖在血管新生中的重要性,提示當(dāng)歸紅芪合劑超濾膜提取物中可能存在一些活性物質(zhì),具有促血管新生的作用,其作用可能發(fā)揮在血管新生的多個環(huán)節(jié),而不是僅僅在內(nèi)皮細胞增殖這一個環(huán)節(jié)上起作用,這些活性物質(zhì)可能在一些缺血性疾病中有一定的應(yīng)用價值?！緟⒖嘉墨I】 1 Jian-Wei Zhu, Bao-Ming Yu, Yu-Bao Ji, et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor by hydrogen peroxide in human colon cancerJ. World J Gastroenterol,2002,8(1)：153157.2 彭國平,郭立瑋,徐麗華,等.超濾技術(shù)應(yīng)用對中藥成分的影響J.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2002,18(6)：339341.3 Suda K, Rothen-Rutishauser B, Gunther