微生物檢驗實驗室菌種保存程序

1、微生物檢驗實驗室菌種保存程序1.目的規(guī)范菌種保存程序。2.范微生物實驗室保存的標準菌種和來自臨床的標本菌株。3.職責微生物實驗室檢驗人員正確執(zhí)行本程序O4.程序4.1 需氧菌保存法4.1.1 一般保存法見表6-1表6；常見菌種培養(yǎng)基保存期限菌種培養(yǎng)時間培養(yǎng)基保存溫保存時間流感嗜血桿菌 18-24脫纖維羊血或脫脂牛奶-20 6個月葡萄球菌、鏈球菌18-24血瓊脂斜面（高層加液體石蠟）腸桿菌科4818-2413年Soxbean酪蛋白瓊脂（高層加液48體石蠟）腸桿菌科、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等18-24牛肉湯（6 1苛養(yǎng)菌18-245%小牛血清肉湯-206個月分枝桿菌幽門螺桿菌18-24羅氏培養(yǎng)基（加液

2、體石蠟）48 3個月18-24心腦浸液或布氏肉湯加入甘油-70 6年注：保存郡主均需培養(yǎng)1824h。4.1.2 冷凍干燥法將待保存菌培養(yǎng)1824小時后，挑取 菌落加入一定量的牛肉湯或心腦浸出液加入20%的蔗糖，混 勻，分裝于安甑中，置70低溫冰箱中迅速凍結，再放入冷 凍干燥機內(nèi)，抽真空1624小時，然后將安甑封口，置低溫 冰箱保存。大多數(shù)菌株可保存10年以上，甚至更長。4.1.3 超冰凍法保存菌株初代培養(yǎng)1824小時的菌落、 菌苔，加入0.5l.0ml無菌脫纖維羊血安甑中，封口，置液 氮或.40冰箱中保存。4.2 厭氧菌保存法4.2.1 短期保存方法4.2.1.1 皰肉培養(yǎng)基保存法用牛肉渣和牛

3、肉浸出液制成 皰肉培養(yǎng)管，接種待保存菌株，然后覆蓋廠2cm的石蠟，再 將培養(yǎng)管垂直放置片刻，待石蠟凝固置35培養(yǎng)（無芽胞厭 氧菌培養(yǎng)72小時，普通梭菌培養(yǎng)24小時，產(chǎn)氣莢膜梭菌和 多枝梭菌培養(yǎng)2周左右），最后置室溫或20保存。發(fā)酵糖 類的厭氧菌每個月轉鐘1次，不發(fā)酵糖類的厭氧菌36個月 轉鐘1次。4.2.1.2 半固體培養(yǎng)基保存法在上述液體培養(yǎng)基中加入。2%0.5%瓊脂，制成半固體培養(yǎng)基，接種時用毛細管將 待保存的厭氧菌的菌液加入半固體培養(yǎng)管底，表面加入2cm厚度的液體石蠟，密封管口，培養(yǎng)48小時，置室溫4.2.1.3 甘油乳劑培養(yǎng)基保存法在厭氧液體培養(yǎng)基（含胰蛋白陳、牛肉膏、酵母浸液、L半胱

4、氨酸和維生素K等） 中加入少量牛肉渣分裝于長試管中，接種待保存菌株,35c培養(yǎng)4872小時，取出后加入無菌甘油（按1:1比例）, 蓋緊蓋子后用石蠟封口，置4或-20保存。此法適用于保 存脆弱擬桿菌、產(chǎn)黑色素普雷沃菌和具核梭桿菌。4.2.2 長期保存法4.2.2.1 低溫冷凍保存法（厭氧菌在低溫條件下新陳代 謝處于抑制狀態(tài)，不繁殖也不死亡）培養(yǎng)基包括脫纖維羊血、 兔血或馬血，20%脫脂牛乳，7.5%葡萄糖的馬血清。將待保 存菌株（培養(yǎng)2448小時）加入上述培養(yǎng)基中，封好瓶口， 置70液氮或-70C低溫冰箱中保存。菌種不同造成保存時 間差異，最長可保存10年，最短可保存2年以上。4.2.2.2 冷

5、凍真空干燥法冷凍真空干燥法的培養(yǎng)基（保 存劑）有兩種，一種是用10%20%脫脂牛奶加入0.1%的谷氨 酸鈉和0.03%的L.半胱氨酸，煮沸15分鐘消毒，冷卻備用。 另一種是用10%蔗糖與馬血清的混合液，過濾滅菌，并置厭 養(yǎng)，酵母菌24日，產(chǎn)抱子的絲狀真菌需形成成熟的抱子， 不產(chǎn)抱子的真菌生長成健壯的菌絲為止。覆蓋2cm的無菌石 蠟（礦物）油（石蠟油的滅菌一般在1小時以上，然后將自 然冷卻的石蠟油加入含真菌的試管中，使液面高于斜面頂部 1cm左右）。使用此方法，許多真菌可在室溫下存活數(shù)年。在恢復培養(yǎng)時，先從石蠟油下面挑取一小塊（2-3mm3） 菌落，沿試管壁邊挑取邊擠壓過多的石蠟油（因石蠟油過多 會抑制真菌生長），然后接種于沙氏瓊脂斜面上，培養(yǎng)數(shù)日 并觀察生長情況。4.4.3水保存法將真菌接種于培養(yǎng)基的斜面上，待培養(yǎng) 成熟后，將無菌蒸